Oositlerin Mikroenjeksiyonu ile Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Üretilmesi

Bu protokolün genel amacı, oositlerin mikroenjeksiyonu ile genetiği değiştirilmiş farelerin başarılı bir şekilde üretilmesi için gerekli prosedürleri tanımlamaktır. Bu protokol, fare oluşumu alanında değil, aynı zamanda gen hedeflemede de yer alan araştırmacılara ve teknik personele yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, hem rastgele entegrasyon için hem de gen hedefleme için fare oositlerinin doğrudan enjeksiyonuna dayanması ve genetik olarak değiştirilmiş farelerin altı hafta gibi kısa bir sürede üretilmesine izin vermesidir.

Tek bir kılavuz RNA hazırlamak için, istenen iki hedef diziyi seçtikten ve metin protokolüne göre primerler yaptıktan sonra, PX330 plazmitini nükleaz içermeyen suda mikrolitre başına 10 nanograma seyrelterek doğrusal bir DNA şablonu sentezleyin. Sonunda polimerazı ekleyerek bir ana karışım hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Daha sonra çözeltiyi karıştırın ve sekiz PCR tüpüne bölün.

Tüp başına bir mikrolitre PXR330 ekleyin ve aşağıdaki programı çalıştırın. Ardından, PCR ürününü saflaştırmak için bir PCR saflaştırma kiti, bir manifold ve bir vakum kaynağı kullanın. PCR örneğinin bir hacmine beş hacim bağlama tamponu ekleyin ve karıştırın.

Silikon membran döndürme kolonunu manifoldun üzerine yerleştirin. DNA'yı bağlamak için, sekiz numunenin tümünü vakumda sütuna uygulayın. Numuneyi yıkamak için kolona 0,75 mililitre yıkama tamponu ekleyin ve vakumlayın.

Ardından, artık etanolü ortadan kaldırmak için sütunu 60 saniye boyunca 12.000 kez G'de santrifüjleyin. Kolonu temiz bir 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne yerleştirin, ardından DNA'yı çıkarmak için zarın ortasına 30 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. Sütunu bir dakika bekletin ve 60 saniye boyunca 12.000 kez G santrifüjleyin.

Daha sonra DNA konsantrasyonunu ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. Bir t7 RNA sentez kiti kullanarak in vitro transkripsiyon yapmak için, ana karışımı hazırlayın ve reaksiyonu üç saat boyunca 37 santigrat derecede bir termo döngüleyicide inkübe edin. 28 mikrolitre nükleaz içermeyen su ve iki mikrolitre DNA ekleyin, birini seçin ve reaksiyonu 15 dakika daha inkübe edin.

RNA'yı saflaştırmak için, sağlanan döndürme kolonunda bulunan tozu ve 650 mikrolitre nükleaz içermeyen mikro enjeksiyon tamponunu çözün. Tüm hava kabarcıklarını dikkatlice çıkarın, tüpü kapatın ve çözeltiyi oda sıcaklığında beş ila 15 dakika nemlendirin. Alttaki mavi kapağı çıkarın ve sütunu iki mililitrelik bir tüpe yerleştirin.

Daha sonra tüpü oda sıcaklığında iki dakika boyunca 750 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra sütunu 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe yerleştirin ve sütun duvarına dokunmadan merkeze 50 mikrolitre RNA çözeltisi damla damla uygulayın. Ardından, sütunu iki dakika boyunca 750 kez G'de döndürün.

RNA konsantrasyonunu ölçün ve metin protokolüne göre RNA'nın kalitesini değerlendirin. Nükleaz içermeyen mikro enjeksiyon tamponu kullanarak, gen nakavt deneyleri için kasayı dokuz mRNA'yı mikrolitre başına 50 nanograma ve sgRNA'ları mikrolitre başına 12.5 nanograma seyreltin. Homoloji doğrudan onarımına dayalı genom düzenleme için donör şablonunu mikrolitre başına 200 nanogram konsantrasyonda ekleyin ve buz üzerinde tutun.

Oositleri dört taze damla kazein amino asidi ile yıkamak için aspiratör ağızlığını kullanın. Ve bunları, mineral yağ ile kaplanmış son bir damla sekiz orta sıvıya aktarın. Rastgele entegrasyon için pro nükleer enjeksiyonu gerçekleştirmek için, stereo mikroskop altında, yaklaşık 50 yumurtayı, enjeksiyon odası olarak kullanılacak mineral yağ ile kaplanmış bir damla m2 ortamına dönüştürmek için aspiratör ağızlığını kullanın.

Enjeksiyon odasını ters çevrilmiş bir mikroskoba aktarın ve döllenmiş oositlere enjeksiyon karışımının birkaç pikolitresi ile enjekte edin. Enjeksiyon başarılı olursa pronükleus şişer. Gen hedefleme için sitoplazmik enjeksiyon yapın, yaklaşık 50 yumurtayı mililitre sitokalasin B başına beş mikrogram içeren bir damla casome A'ya aktarmak için bir ağızlık kullanın ve yumurtaları 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte beş dakika boyunca kuluçkaya yatırın.

Yumurtaları enjeksiyon odasına aktarın, daha sonra çok düşük basınçta, enjeksiyon karışımının birkaç pikolitresini sitoplazmaya enjekte edin. Mümkünse otomatik mikro enjektörün dengeleme basıncını kullanın. Enjeksiyondan sonra, oositleri bir damla kazoamino aside geri aktarmak için ağızlığı kullanın.

Sahte hamile kadınların yumurta kanalına yeniden implantasyon için yüklenene kadar onları 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte tutun. Tıkalı bir dişi fareyi metin protokolüne göre uyuşturduktan sonra, steril koşullar altında yeniden implantasyon yapmak için, dorsal orta hatta paralel bir santimetre uzunluğunda bir kesiye neşter kullanarak üreme sistemini açığa çıkarın. Daha sonra makasla kası kesin ve yağ yastığını tutmak için forseps kullanın.

Bağlı yumurta kanalı ve uterus açıkça görünene kadar yumurtalığı yavaşça dışarı çekin. Ardından yağ pedini sabitlemek için bir damar kelepçesi kullanın. Stereo mikroskop altında, ampullanın birkaç milimetre yukarısında, yumurta kanalının duvarına bir kesi yapmak için bir çift mikro makas kullanın.

Ayrıca stereo mikroskop altında 25 adet mikro enjekte edilmiş yumurtayı ağızlığa bağlı cam kılcal damara yükleyin. Ardından, cam kılcal damarı yumurta kanalına yerleştirin ve ampulla içinde bir hava kabarcığı görünene kadar yumurtaları dışarı atın. Yeniden implantasyonun başarılı olduğundan emin olmak için, ampulladaki hava kabarcığının varlığını kontrol etmelisiniz, bu da tüm yumurtaların doğru yerde dışarı atıldığını ve hiçbirinin cam kılcal damarda kalmadığını garanti eder.

Cam kılcal damarı nazikçe çıkarın ve üreme sistemini tekrar karın içine yerleştirin. Daha sonra insizyonu dikmek için üç sıfır, emilmeyen cerrahi sütür kullanın ve ardından cildi kapatmak için yara klipsleri kullanın. Hipotermiyi önlemek için fareyi ılık bir matın üzerine yerleştirin ve deri altına analjezik enjekte edin.

Tam bir iyileşme sağlanana kadar fareyi izleyin. Son olarak, metin protokolüne göre genom tipleme ve dizileme yapın. Bu şekil, transgen saflaştırmasının kalitesini gösteren analitik jelleri ve genetiği değiştirilmiş fareleri başarılı bir şekilde oluşturmak için kritik olan sgRNA sentezini göstermektedir.

Burada gösterilen, rastgele entegrasyon için bir mikro enjeksiyon oturumunun tipik bir okumasıdır. Genotipleme astarı, transgen üzerine oturmalı ve 200 ila 800 baz çiftinden oluşan bir parça oluşturacak şekilde tasarlanmalıdır. Gen hedefleme için yapılan bu okumada, bölgenin dışındaki genomik DNA ile hibritleşmek üzere seçilen primerler, sonunda iki adam tarafından eksize edilir.

Bu strateji, heterozigot ve homozigot nakavt kurucularının doğrudan tanımlanmasına izin verir. Burada gösterildiği gibi, protokolün her adımı optimize edildiğinde, transgenik yavru yüzdesi rastgele entegrasyon için %10 ila %25'e ulaşmalıdır, bu da CRISPR bileşenlerinin fare genomunu düzenleme yeteneğine kıyasla biraz düşüktür. Gen hedefleme için CRISPR kullanarak, kurucuların sayısı genellikle daha yüksektir, %25 ile %100 arasında değişir, CRISPR kullanılarak düzenlendiğinde başarılı bir şekilde homozigot olan bütün bir soy elde etmek alışılmadık bir durum değildir.

Geliştirildikten sonra, bu teknik, örneğin sinirbilim veya kanser gibi alanlardaki araştırmacıların, patolojik mekanizmaları keşfetmek ve sonunda bunu terapötik stratejilere dönüştürmek için yeni maske modelleri kullanmalarına olanak tanır.