Oositlerin Mikroenjeksiyonu ile Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Üretilmesi

Bu protokolün genel amacı, oositlerin mikroenjeksiyonu yoluyla genetik olarak modifiye edilmiş farelerin başarılı bir şekilde üretilmesi için gerekli prosedürleri tanımlamaktır. Bu protokol, hem fare üretimi hem de gen hedefleme alanlarında çalışan araştırmacılara ve teknik personele yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hem rastgele entegrasyon hem de gen hedefleme için fare oositlerinin doğrudan enjeksiyonuna dayanması ve böylece genetik olarak modifiye edilmiş farelerin altı hafta gibi kısa bir sürede üretilmesine olanak tanımasıdır.

Tek bir kılavuz RNA hazırlamak için, istenen iki hedef diziyi seçip metin protokolüne uygun primerleri hazırladıktan sonra, PX330 plazmidini nükleaz içermeyen su ile 10 ng/µL konsantrasyona seyrelterek lineer bir DNA kalıbı sentezleyin. Polimerazı en son ekleyerek bir master mix hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Ardından çözeltiyi karıştırın ve sekiz PCR tüpüne paylaştırın.

Her tüpe bir mikrolitre PXR330 ekleyin ve aşağıdaki programı çalıştırın. Ardından, PCR ürününü saflaştırmak için bir PCR saflaştırma kiti, bir manifold ve bir vakum kaynağı kullanın. Bir birim PCR örneğine beş hacim bağlama tamponu ekleyin ve karıştırın.

Silikon membranlı spin kolonunu manifold üzerine yerleştirin. DNA'yı bağlamak için, sekiz örneğin tamamını vakum altında kolona uygulayın. Örneği yıkamak için, kolona 0,75 mililitre yıkama tamponu ekleyin ve vakumlayın.

Ardından, kalıntı etanolü uzaklaştırmak için kolonu 12,000 ×g hızında 60 saniye boyunca santrifüje tabi tutun. Kolonu temiz bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin, ardından DNA'yı elüe etmek için membranın merkezine 30 µL nükleaz içermeyen su ekleyin. Kolonu bir dakika boyunca bekletin ve 12,000 ×g hızında 60 saniye boyunca santrifüje tabi tutun.

Ardından, DNA konsantrasyonunu ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. Bir t7 RNA sentez kiti kullanarak in vitro transkripsiyon gerçekleştirmek için, master mix'i hazırlayın ve reaksiyonu bir termosiklet cihazında 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. 28 µL nükleaz içermeyen su ve 2 µL DNAse one ekleyip reaksiyonu 15 dakika daha inkübe edin.

RNA'yı saflaştırmak için, sağlanan spin kolonunda bulunan tozu ve 650 µL nükleaz içermeyen mikro enjeksiyon tamponunu çözün. Tüm hava kabarcıklarını dikkatlice gidererek tüpün kapağını kapatın ve çözeltiyi oda sıcaklığında beş ila 15 dakika boyunca hidrate edin. Alttaki mavi kapağı çıkarın ve kolonu iki mL'lik bir tüpe yerleştirin.

Ardından tüpü, oda sıcaklığında 750 ×g hızda iki dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra kolonu yeni bir 1.5 mL tüpe yerleştirin ve RNA çözeltisinden 50 µL'yi, kolon duvarına değdirmeden merkezine damla damla uygulayın. Ardından, kolonu 750 ×g hızda iki dakika boyunca döndürün.

Yazılı protokole uygun olarak RNA konsantrasyonunu ölçün ve RNA kalitesini değerlendirin. Gen nakavt deneyleri için Cas9 mRNA'sını nükleaz içermeyen mikroenjeksiyon tamponu ile 50 ng/µL'ye ve sgRNA'ları 12,5 ng/µL'ye seyreltin. Homoloji yönlendirmeli onarıma dayalı genom düzenleme için donor şablonu 200 ng/µL konsantrasyonda ekleyin ve buz üzerinde tutun.

Oositleri dört taze damla kazein amino asitleri ile yıkamak için aspiratör ağızlığını kullanın. Ardından oositleri, üzeri mineral yağ ile kaplanmış son bir damla casome eight ortamına aktarın. Rastgele entegrasyon için pronükleus enjeksiyonunu gerçekleştirmek üzere, stereo mikroskop altında, aspiratör ağızlığını kullanarak yaklaşık 50 yumurtayı, enjeksiyon odası olarak kullanılacak ve üzeri mineral yağ ile kaplanmış bir damla m2 ortamına aktarın.

Enjeksiyon haznesini ters mikroskoba transfer edin ve döllenmiş oositlere birkaç picolitre enjeksiyon karışımı enjekte edin. Enjeksiyon başarılı olursa pronükleus şişecektir. Gen hedefleme için sitoplazmik enjeksiyon gerçekleştirin, bir ağız pipeti kullanarak yaklaşık 50 yumurtayı mililitre başına beş mikrogram cytochalasin B içeren bir damla casome A'ya transfer edin ve yumurtaları 37 °C'de ve %5 karbon dioksit altında beş dakika inkübe edin.

Yumurtaları enjeksiyon haznesine aktarın, ardından çok düşük basınçta, enjeksiyon karışımından birkaç picolitre miktarını sitoplazmaya enjekte edin. Mümkün olduğunca otomatik mikroenjektörün kompanzasyon basıncını kullanın. Enjeksiyondan sonra, oositleri tekrar bir casomeamino acids damlasına aktarmak için ağızlık kısmını kullanın.

Sözde gebe dişilerin oviduktuna yeniden implantasyon için yüklenene kadar onları 37 °C ve %5 karbon dioksit ortamında tutun. Tıpa oluşmuş dişi bir fareyi metin protokolüne uygun olarak anestezi altına aldıktan sonra, steril koşullar altında yeniden implantasyonu gerçekleştirmek için, dorsal orta hatta paralel bir santimetre uzunluğunda bir insizyon yapmak üzere skapel kullanarak üreme kanalını açığa çıkarın. Ardından, makasla kası kesin ve yağ pedini tutmak için pens kullanın.

Bağlı olan ovidukt ve uterus net bir şekilde görünene kadar yumurtalığı nazikçe dışarı çekin. Ardından, yağ pedini sabitlemek için bir damar klempi kullanın. Stereo mikroskop altında, ampulla'nın birkaç milimetre yukarısından ovidukt duvarına bir insizyon yapmak için bir mikro makas çifti kullanın.

Ayrıca, stereo mikroskop altında, ağızlık kısmına bağlı cam kapilere mikroenjeksiyonda kullanılmış 25 yumurta yükleyin. Ardından, cam kapileri ovidukte yerleştirin ve ampulla içerisinde bir hava kabarcığı görünene kadar yumurtaları boşaltın. Yeniden implantasyonun başarılı olduğundan emin olmak için, ampulladaki hava kabarcığının varlığını kontrol etmelisiniz; bu durum, tüm yumurtaların doğru konuma boşaltıldığını ve cam kapilerde hiç yumurta kalmadığını garanti eder.

Cam kılcal boruyu nazikçe çıkarın ve üreme kanalını tekrar abdomen içine yerleştirin. Ardından, insizyonu dikmek için üç sıfır, emilmeyen cerrahi süturlar kullanın ve ardından cildi kapatmak için yara klipsleri kullanın. Hipotermiyi önlemek için fareyi sıcak bir mat üzerine yerleştirin ve deri altına analjezik enjekte edin.

Fareyi tam iyileşme sağlanana kadar takip edin. Son olarak, metin protokolüne uygun olarak genom tiplemesi ve dizileme gerçekleştirin. Bu şekil, genetiği değiştirilmiş farelerin başarıyla üretilmesi için kritik olan transgen saflaştırma ve sgRNA sentezinin kalitesini gösteren analitik jelleri sunmaktadır.

Burada, rastgele entegrasyon için tipik bir mikroenjeksiyon oturumu okuması gösterilmektedir. Genotipleme primeri transgen üzerinde yer almalı ve 200 ile 800 baz çifti uzunluğunda bir fragman oluşturacak şekilde tasarlanmalıdır. Gen hedefleme için yapılan bu okumada primerler, nihayetinde iki guide RNA tarafından kesilen bölgenin dışındaki genomik DNA ile hibridize olacak şekilde seçilmiştir.

Bu strateji, heterozigot ve homozigot nakavt kurucu bireylerin doğrudan tanımlanmasına olanak tanır. Burada gösterildiği üzere, protokolün her adımı optimize edildiğinde, rastgele entegrasyon için transgenik yavru yüzdesi %10 ile %25'e ulaşmalıdır; bu oran, CRISPR bileşenlerinin fare genomunu düzenleme yeteneğine kıyasla oldukça düşüktür. Gen hedefleme için CRISPR kullanıldığında, kurucu birey sayısı genellikle daha yüksektir ve %25 ile %100 arasında değişir; CRISPR kullanılarak düzenlenen durumlarda, tüm progeny'nin başarıyla homozigot olması yaygın bir durumdur.

Geliştirildikten sonra bu teknik, örneğin nörobilim veya kanser gibi alanlardaki araştırmacıların, patolojik mekanizmaları keşfetmek ve nihayetinde bunları terapötik stratejilere dönüştürmek için yeni maske modelleri kullanmalarına olanak tanır.