Küresel emülsiyon damlacıkların Temel Mitotik Mil Sulandırma

Bu prosedürün genel amacı, yağ emülsiyon damlacıklarında suyun geometrik hapsi içinde mitotik iğ benzeri yapıları yeniden oluşturmaktır. Bu yöntem, mitotik milli mil montajı alanında, millerin nasıl konumlandırıldığı ve monte edildiği ve tek tek bileşenlerin bu süreçlere özel katkısının ne olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, bir mitotik hücrenin şeklini taklit eden geometrik hapsetme içinde iğ benzeri yapıları yeniden oluşturmak için aşağıdan yukarıya bir yaklaşım kullanmamızdır.

Bu yöntem aynı zamanda hücresel hapse bağlı diğer süreçleri incelemek için de kullanılabilir. 10 kısım PDMS prepolimeri, yaklaşık 40 gramlık bir toplam kütlede bir kısım kürleme maddesi ile karıştırın. Ardından, hava kabarcıklarını gidermek için karışımı yaklaşık 30 dakika bir vakum odasına koyun.

Bu arada, dört inç çapında bir santimetre derinliğinde bir kap oluşturmak için kalıbın etrafına alüminyum folyo sarın. Hazır olduğunda, PDMS karışımının yaklaşık 3 / 4'ünü kalıba dökün. Ardından, PDMS'yi 30 dakika daha bir vakum odasına geri koyun.

Gazdan arındırma işleminden sonra, PDMS'yi 100 santigrat derecede bir saat kürleyin. Bu arada, basınçlı hava ile tozlarını alarak sıkma kaplaması için bazı cam slaytlar hazırlayın. Ardından, kalan PDMS karışımını slaytların üzerine döndürün.

PDMS'yi sertleştirmek için bu slaytları 100 santigrat derecede bir saat kürleyin. Ardından, bir tıraş bıçağı kullanarak PDMS'yi nazikçe soyun ve mikroakışkan çipler yapmak için PDMS şeritlerinden gerekli delikleri açın. Şimdi, korona mikroakışkan çipi ve PDMS kaplı bir cam slaytı birkaç saniye boyunca tedavi edin.

Son olarak, kanallar aşağı bakacak şekilde her bir cam slaydın üzerine bir mikroakışkan çip yerleştirin ve cipsleri gece boyunca 100 santigrat derecede pişirin. İlk olarak, kloroformla yıkanmış cam eşyalar kullanarak, yaklaşık 250 mikrogram kloroformla çözünmüş lipit hazırlayın. Lipid karışımını inert gazla dikkatlice kurulayın.

Ve sonra bir saat boyunca bir vakum odasına koyun. Daha sonra, lipitleri mineral yağda ve% 2.5 yüzey aktif maddede mililitre başına 0.5 miligrama, yani yaklaşık 500 mikrolitreye çözün. Lipitleri tamamen çözmek için, karışımı 40 kilohertz'de 30 dakika boyunca sonikleştirin.

Daha sonra, PDMS'yi mikroskop objektifine uygun bir kalınlığa sahip kapak camlarına sıkın. Ardından, PDMS'yi cam slaytların üzerine sıkın. Şimdi, PDMS kaplı kapak camlarını ve cam slaytları 100 santigrat derecede bir saat boyunca kürleyin.

Ardından, PDMS kaplı cam slaytların üzerine ince laboratuvar sızdırmazlık filmi dilimleri yakın aralıklarla yerleştirerek akış hücrelerini yapın. Üç milimetrelik şeritleri yaklaşık iki milimetre aralıklarla yerleştirin. Ardından, akış hücrelerini PDMS kaplı bir kapak kızağı ile örtün ve filmi hızlı bir dakika boyunca 100 santigrat derecede eriterek düzeneği kapatın.

Isıtıldıktan sonra, kapak kızağını yavaşça aşağı bastırın ve Valap ile kapatın. Ardından, uzun süreli görüntüleme için bir PDMS kabı hazırlayın. Üç milimetre kalınlığında bir PDMS dilimine dört milimetre çapında bir delik açın.

Ardından, PDMS dilimini ve PDMS kaplı bir kapak camını korona ile tedavi edin. İşlem gördükten sonra üst üste yerleştirin ve düzeneği gece boyunca 100 santigrat derecede pişirin. Ters çevrilmiş parlak alan mikroskobunda damlacık oluşumunu izleyin.

Lipid yağ fazını basınç kontrol cihazına bağlayın ve tepe borusundan bir damla yağ çıkana kadar basıncı artırın. Tepe borusunu mikroakışkan çipinin ikinci girişine bağlayın. Ardından, mikroakışkan çipleri ikinci girişten lipit yağ fazı ile tamamen doldurun.

Ardından, birinci girişten MRB-80 bazlı su fazını tanıtın. Yaklaşık 15 mikron çapında damlacıklar oluşturmak için lipid yağ fazını ve su fazı basınçlarını değiştirerek damlacık boyutunu kontrol edin. Lipid yağı fazı için yaklaşık 800 milibar ve su fazı için 200 milibar iyi bir başlangıç noktasıdır.

İstenilen damlacık boyutunu elde ettikten sonra, akış hücresini tamamen damlacıklarla doldurun. Bu damlacıklar, küçük hacimlerde su fazı kullanılarak oluşturulur. Bu, doğru boyutta damlacıklar oluşmadan önce tüm su fazını kaybetmemek için mikroakışkan kurulumunun hızlı bir şekilde çalışması gerektiği anlamına gelir.

Doldurulduktan sonra, Valap kullanarak akış hücresinin uçlarını dikkatlice kapatın. Damlacıklar hareket etmeyi bırakmazsa, sızdırmazlık tamamlanmamıştır veya hava kabarcıkları oluşmuş olabilir. Uzun süreli görüntüleme için, damlacıkları bir PDMS kabına aktarın ve bir yağ lipid karışımı tabakası ile kaplayın.

Sentrozomları oda sıcaklığında çözdürün ve uygun mikrotübül çekirdeklenmesini sağlamak için 20 dakika boyunca 37 santigrat dereceye koyun. Beklerken tahlil karışımını buz üzerinde hazırlayın. Bu, tübülin, GTP, bir oksijen tutucu sistem, mikrotübül çapraz bağlayıcılar gibi moleküler kuvvet üreteçleri, ATP ve ATP rejenerasyon sistemi içermelidir.

Karıştırıldıktan sonra, numuneyi soğutulmuş Airfuge rotorunda 30 psi'de üç dakika boyunca döndürün. Ardından, önceden ısıtılmış sentrozomları karışıma ekleyin. Damlacık başına bir veya iki sentrozom elde etmek için eklenen sentrozom miktarını optimize edin.

Ardından, daha önce tarif edildiği gibi emülsiyon damlacıkları üretmek için bu karışımı kullanın. Damlacık korteksindeki biyotinile lipidlere dynein almak için, su fazına GFP-dynein TMR ve streptavidin ekleyin. Dönen bir disk konfokal mikroskobunda, 26 santigrat derecede 30 dakika sonra mikrotübül büyümesini görselleştirin.

Görüntüleme sırasında, sıcaklığı 28 hatta 30 santigrat dereceye çıkararak mikrotübül büyümesi teşvik edilebilir. Z projeksiyonları için, damlacık başına yaklaşık 20 görüntü gerektirmesi gereken bir mikron aralıklarla yığınlar alın. Ana kamera paneline gidin, Z Düzenle'ye tıklayın ve Z Adımını 1.0 olarak ayarlayın.

Ayarları kaydetmek için İleri'ye tıklayın. Ardından, Edinme panelindeki Kamera sekmesine tıklayarak ve EM Kazancı çubuğunu 300'e kaydırarak maksimum doğrusal EM Kazancını ayarlayın. Ardından, aynı sekmede Pozlama Süresini 200 milisaniye olarak ayarlayın.

Ayarları kaydetmek için Kaydet'e tıklayın. Canlı görüntüleme deneyleri için, maruz kalma sürelerini yaklaşık 100 milisaniyeye düşürerek ve Z aralıklarını iki mikrona çıkararak iki saat boyunca her iki dakikada bir Z Projeksiyonları yapın. Canlı görüntüleme deneyleri için, numunenin maksimum immobilizasyonu için normal bir akış hücresi yerine bir PDMS kabı kullanın.

Açıklanan protokoller kullanılarak, sentrozom içeren su ve yağ emülsiyon damlacıklarında aster oluşumu incelenmiştir. Başlangıçta, sentrozomlar sınırlı hacimler içinde serbestçe yayılır. Yaklaşık 20 ila 30 dakika sonra, ilk mikrotübüller görünür hale gelir ve mikrotübüller kortekse karşı her yöne büyüdükçe sentrozom difüzyonu kısıtlanır.

Mikrotübüller damlacık çapının yarısından daha uzun büyüdüğünde, sentrozomlar karşıt sınırlara itilir ve mikrotübüller damlacık korteksi boyunca büyür. Streptavidin olmadan, dymeine damlacık içinde yayılır. Bununla birlikte, streptavidin ile, damlacık oluşumundan yaklaşık 10 dakika sonra, dynein biyotinile lipidlere bağlanır.

Floresan tübülini kortikal dynein varlığında görüntülerken, sentrozomların merkezi olarak konumlandırıldığı açıktır. Dynein yokluğunda ise sentrozomlar damlacığın zıt taraflarına itilir. Bu muhtemelen dynein'in mikrotübül felaketlerini ve kortikal çekme kuvvetlerini teşvik etmesinden kaynaklanmaktadır, bu da asterlerin merkezlenmesine neden olur.

Bu videoyu izledikten sonra, küresel emülsiyon damlacıklarında mil benzeri yapılar oluşturmak için mikroakışkan teknolojilerinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, damlacık oluşumu ve görüntüleme, uygun şekilde yapıldığında iki ila üç saat içinde yapılabilir. Bu prosedür kullanılarak, iş mili morfolojisi ve konumlandırma üzerindeki etkilerini incelemek için diğer iş mili montaj faktörleri kapsüllenebilir.

Kloroform veya PDMS kullanırken her zaman eldiven giymek gibi önlemler alınmalıdır.