Küresel emülsiyon damlacıkların Temel Mitotik Mil Sulandırma

Bu prosedürün genel amacı, su içinde yağ emülsiyon damlacıklarının geometrik sınırlaması dahilinde mitotik iğe benzeri yapıları yeniden oluşturmaktır. Bu yöntem, iğelerin nasıl konumlandığı ve kurulduğu ile tekil bileşenlerin bu süreçlere spesifik katkısının ne olduğu gibi, mitotik iğe kurulumu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mitotik bir hücrenin şeklini taklit eden geometrik sınırlama içerisinde iğe benzeri yapıları yeniden oluşturmak için aşağıdan yukarıya (bottom-up) bir yaklaşım kullanmamızdır.

Bu yöntem, hücresel sınırlamaya bağımlı olan diğer süreçleri incelemek için de kullanılabilir. Yaklaşık 40 gram toplam kütlede, 10 birim PDMS ön-polimeri ile bir birim kürleme ajanını karıştırın. Ardından, hava kabarcıklarını gidermek için karışımı yaklaşık 30 dakika boyunca bir vakum odasına yerleştirin.

Bu sırada, kalıbın etrafını alüminyum folyo ile sararak dört inç çapında ve bir santimetre derinliğinde bir kap oluşturun. Hazır olduğunda, PDMS karışımının yaklaşık 3/4'ünü kalıba dökün. Ardından, PDMS'i 30 dakika daha vakum odasına geri yerleştirin.

Gaz giderme işleminin ardından, PDMS'i 100 °C'de bir saat boyunca kürleyin. Bu sırada, cam lamları basınçlı hava ile tozlarından temizleyerek spin kaplama için hazırlayın. Ardından, kalan PDMS karışımını lamların üzerine spin kaplama yöntemiyle uygulayın.

PDMS'yi sertleştirmek için bu lamları 100 °C'de bir saat boyunca kürleyin. Ardından, PDMS şeritlerini bir jilet yardımıyla nazikçe soyun ve mikroakışkan çipler oluşturmak için PDMS şeritlerinden gerekli delikleri açın. Şimdi, mikroakışkan çipi ve PDMS kaplı bir cam lamı birkaç saniye boyunca korona işlemiyle değerlendirin.

Son olarak, kanalları aşağı bakacak şekilde her bir lam üzerine bir mikroakışkan çip yerleştirin ve çipleri gece boyunca 100 °C'de fırınlayın. İlk olarak, kloroformla yıkanmış cam malzemeler kullanarak, kloroformda çözünmüş yaklaşık 250 µg lipid hazırlayın. Lipid karışımını inert gaz ile dikkatlice kurutun.

Ardından, bir saat boyunca vakum odasına yerleştirin. Sonra, lipidleri mineral yağ ve %2,5 surfaktan içinde 0,5 mg/mL konsantrasyona (yaklaşık 500 µL) gelecek şekilde çözün. Lipidleri tamamen çözmek için karışımı 40 kHz'de 30 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun.

Ardından, mikroskop objektifine uygun bir kalınlıkta PDMS'yi lamellere spin coat yöntemiyle kaplayın. Daha sonra, PDMS'yi cam lamlara spin coat yöntemiyle kaplayın. Şimdi, PDMS kaplı lamelleri ve cam lamları 100 °C'de bir saat boyunca kürleyin.

Ardından, PDMS kaplı cam lamların üzerine ince laboratuvar sızdırmazlık filmi dilimlerini birbirine yakın şekilde yerleştirerek akış hücrelerini oluşturun. Üç milimetrelik şeritleri yaklaşık iki milimetre aralıklarla konumlandırın. Daha sonra, akış hücrelerini PDMS kaplı bir kapatma lamı ile örtün ve filmi 100 °C'de kısa bir dakika boyunca eriterek düzeneği mühürleyin.

Isıttıktan sonra, lamelini nazikçe aşağı bastırın ve Valap ile mühürleyin. Ardından, uzun süreli görüntüleme için bir PDMS kap hazırlayın. 3 mm kalınlığındaki bir PDMS dilimine 4 mm çapında bir delik açın.

Ardından, PDMS dilimine ve PDMS kaplı lamel camına korona işlemi uygulayın. İşlem tamamlandıktan sonra bunları üst üste yerleştirin ve düzeneği 100 °C'de gece boyunca pişirin. Damlacık oluşumunu ters aydınlık alan mikroskobunda izleyin.

Lipit yağ fazını basınç kontrolörüne bağlayın ve yağın bir damlası peak tüpünden çıkana kadar basıncı artırın. Peak tüpünü mikroakışkan çipin ikinci girişine bağlayın. Ardından, mikroakışkan çipleri ikinci girişten lipit yağ fazı ile tamamen doldurun.

Ardından, birinci girişi kullanarak MRB-80 bazlı su fazını ekleyin. Yaklaşık 15 mikron çapında damlacıklar oluşturmak için lipid yağ fazı ve su fazı basınçlarını değiştirerek damlacık boyutunu kontrol edin. Lipid yağ fazı için yaklaşık 800 millibar ve su fazı için 200 millibar uygun bir başlangıç noktasıdır.

İstenen damlacık boyutu elde edildikten sonra, akış hücresini tamamen damlacıklarla doldurun. Bu damlacıklar, su fazının küçük hacimleri kullanılarak oluşturulur. Bu durum, doğru boyuttaki damlacıklar oluşmadan önce tüm su fazının tüketilmemesi için mikroakışkan düzeneğin hızlı çalışması gerektiği anlamına gelir.

Doldurulduktan sonra, akış hücresinin uçlarını Valap kullanarak dikkatlice kapatın. Damlacıklar hareket etmeyi bırakmazsa, sızdırmazlık tamamlanmamış olabilir veya hava kabarcıkları girmiş olabilir. Uzun süreli görüntüleme için damlacıkları bir PDMS kaba aktarın ve bir yağ lipid karışımı tabakasıyla örtün.

Sentrozomları oda sıcaklığında çözdürün ve uygun mikrotübül nükleasyonunu sağlamak için 37 °C'de 20 dakika bekletin. Bekleme süresinde, assay karışımını buz üzerinde hazırlayın. Bu karışım; tubulin, GTP, bir oksijen yakalayıcı sistem, mikrotübül çapraz bağlayıcıları gibi moleküler kuvvet üreteçleri, ATP ve ATP rejenerasyon sistemi içermelidir.

Karıştırıldıktan sonra, örneği soğutulmuş Airfuge rotorunda 30 psi'da üç dakika boyunca döndürün. Ardından, önceden ısıtılmış sentrozomları karışıma ekleyin. Damla başına bir veya iki sentrozom elde etmek için eklenen sentrozom miktarını optimize edin.

Ardından, daha önce açıklandığı şekilde emülsiyon damlacıkları üretmek için bu karışımı kullanın. Dynein proteinlerini damlacık korteksindeki biyotinillenmiş lipidlere çekmek için su fazına GFP-dynein TMR ve streptavidin ekleyin. Döner disk konfokal mikroskop ile 26 °C'de 30 dakika bekledikten sonra mikrotübül büyümesini görüntüleyin.

Görüntüleme sırasında, sıcaklık 28 veya hatta 30 °C'ye yükseltilerek mikrotübül büyümesi teşvik edilebilir. Z-projeksiyonları için, damla başına yaklaşık 20 görüntü gerektirecek şekilde bir mikron aralıklarla yığınlar alın. Ana kamera paneline gidin, Edit Z'ye tıklayın ve Z Step değerini 1.0 olarak ayarlayın.

Ayarları kaydetmek için İleri'ye tıklayın. Ardından, Edinme panelindeki Kamera sekmesine tıklayıp EM Gain çubuğunu 300'e getirerek maksimum doğrusal EM Gain değerini ayarlayın. Son olarak, aynı sekmede Pozlama Süresini 200 milisaniye olarak ayarlayın.

Ayarları kaydetmek için Record'a tıklayın. Canlı görüntüleme deneyleri için, pozlama sürelerini yaklaşık 100 milisaniyeye düşürerek ve Z aralıklarını iki mikrona çıkararak iki saat boyunca her iki dakikada bir Z Projeksiyonları yapın. Canlı görüntüleme deneylerinde, örneğin maksimum immobilizasyonu için standart bir akış hücresi yerine PDMS kap kullanın.

Tanımlanan protokoller kullanılarak, sentrozom içeren su ve yağ emülsiyon damlacıklarında aster oluşumu incelenmiştir. Başlangıçta sentrozomlar, sınırlı hacimler içerisinde serbestçe difüze olur. Yaklaşık 20 ila 30 dakika sonra ilk mikrotübüller görünür hale gelir ve mikrotübüller her yöne doğru kortekse karşı büyüdükçe sentrozom difüzyonu kısıtlanmaya başlar.

Mikrotübüller damlacık çapının yarısından daha uzun olduğunda, sentrozomlar karşıt sınırlara doğru itilir ve mikrotübüller damlacık korteksi boyunca uzar. Streptavidin yokken, dynein damlacık içinde difüz haldedir. Ancak streptavidin varlığında, damlacık oluşumundan yaklaşık 10 dakika sonra, dynein biyotinize lipidlere bağlanır.

Kortikal dinein varlığında floresan tubulin incelendiğinde, sentrozomların merkezi konumda olduğu açıkça görülmektedir. Dinein yokluğunda ise sentrozomlar damlacığın zıt taraflarına itilmektedir. Bu durum muhtemelen, dineinin mikrotübül katastroflarını ve kortikal çekme kuvvetlerini teşvik etmesinden kaynaklanmaktadır ve bu da asterlerin merkezlenmesiyle sonuçlanmaktadır.

Bu videoyu izledikten sonra, küresel emülsiyon damlacıkları içinde iğsi yapılar oluşturmak için mikroakışkan teknolojilerinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Uzmanlaşıldığında, damlacık oluşturma ve görüntüleme işlemleri uygun şekilde gerçekleştirildiğinde iki ila üç saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür kullanılarak, iğ morphology ve konumlandırma üzerindeki etkilerini incelemek amacıyla diğer iğ montaj faktörleri de kapsüllenebilir.

Kloroform veya PDMS kullanılırken her zaman eldiven giymek gibi önlemler alınmalıdır.