Name: Küresel emülsiyon damlacıkların Temel Mitotik Mil Sulandırma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Öğrenin, su-içinde-yağ emülsiyon damlacıklarında mitotik mil benzeri yapıların geometrik kısıtlama altında nasıl yeniden oluşturulduğunu. Bu yöntem, mil konumlandırma ve hücre bölünmesi mekanizmalarını incelemek için güçlü bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Değerli tartışmalar için Dogterom laboratuvarı üyelerine teşekkür etmek isteriz. Reaktifler için Stefan Diez ve Marcel Janson'a ve dynein saflaştırılmasına yardımcı oldukları için Samara Reck-Peterson'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Avrupa Araştırma Konseyi (ERC Synergy hibesi: MODEL-CELL) tarafından sağlanan fonla desteklenmiştir.

<ol><li>Kotak, S., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+spindle+positioning%3A+cortical+force+generators+in+the+limelight%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of spindle positioning: cortical force generators in the limelight.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 741-748 (2013).</li>
<li>Williams, S. E., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+divisions%2C+fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oriented divisions, fate decisions.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 749-758 (2013).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+centrosome+separation+and+bipolar+spindle+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of centrosome separation and bipolar spindle assembly.</a> Dev Cell. 19, 797-806 (2010).</li>
<li>Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+force+generators+and+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitotic force generators and chromosome segregation.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (13), 2231-2250 (2010).</li>
<li>Faivre-Moskalenko, C., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+microtubule+asters+in+microfabricated+chambers%3A+the+role+of+catastrophes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of microtubule asters in microfabricated chambers: the role of catastrophes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (26), 16788-16793 (2002).</li>
<li>Janson, M. E., de Dood, M. E., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubules+is+regulated+by+force%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubules is regulated by force.</a> J Cell Biol. 161 (6), 1029-1034 (2003).</li>
<li>Laan, L., Husson, J., Munteanu, E. L., Kerssemakers, J. W., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-generation+and+dynamic+instability+of+microtubule+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Force-generation and dynamic instability of microtubule bundles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8920-8925 (2008).</li>
<li>Laan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+dynein+controls+microtubule+dynamics+to+generate+pulling+forces+that+position+microtubule+asters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters.</a> Cell. 148 (3), 502-514 (2012).</li>
<li>Dogterom, M., Yurke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+force-velocity+relation+for+growing+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules.</a> Science. 278 (5339), 856-860 (1997).</li>
<li>Cytrynbaum, E. N., Scholey, J. M., Mogilner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+force+balance+model+of+early+spindle+pole+separation+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A force balance model of early spindle pole separation in Drosophila embryos.</a> Biophys J. 84 (2 Pt 1), 757-769 (2003).</li>
<li>Kozlowski, C., Srayko, M., Nedelec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+microtubule+contacts+position+the+spindle+in+C.+elegans+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cortical microtubule contacts position the spindle in C. elegans embryos.</a> Cell. 129 (3), 499-510 (2007).</li>
<li>Carminati, J. L., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+orient+the+mitotic+spindle+in+yeast+through+dynein-dependent+interactions+with+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubules orient the mitotic spindle in yeast through dynein-dependent interactions with the cell cortex.</a> J Cell Biol. 138 (3), 629-641 (1997).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, T., Afshar, K., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+cortical+dynein+and+G+alpha+proteins+mediates+spindle+positioning+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coupling of cortical dynein and G alpha proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Cell Biol. 9 (11), 1294-1302 (2007).</li>
<li>Moore, J. K., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+mitosis+with+cell+polarity%3A+Molecular+motors+at+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).</li>
<li>Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+production+by+disassembling+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Force production by disassembling microtubules.</a> Nature. 438 (7066), 384-388 (2005).</li>
<li>Toba, S., Watanabe, T. M., Yamaguchi-Okimoto, L., Toyoshima, Y. Y., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+hand-over-hand+mechanism+of+single+molecular+motility+of+cytoplasmic+dynein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Overlapping hand-over-hand mechanism of single molecular motility of cytoplasmic dynein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (15), 5741-5745 (2006).</li>
<li>Ten Hoopen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+astral+microtubule+capture+by+cortical+Bud6p+priming+spindle+polarity+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism for astral microtubule capture by cortical Bud6p priming spindle polarity in S. cerevisiae.</a> Curr Biol. 22 (12), 1075-1083 (2012).</li>
<li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bipolar+mitotic+kinesin+Eg5+moves+on+both+microtubules+that+it+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks.</a> Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).</li>
<li>van den Wildenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homotetrameric+kinesin-5+KLP61F+preferentially+crosslinks+microtubules+into+antiparallel+orientations%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The homotetrameric kinesin-5 KLP61F preferentially crosslinks microtubules into antiparallel orientations.</a> Curr Biol. 18 (23), 1860-1864 (2008).</li>
<li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> J Cell Biol. 182 (3), 421-428 (2008).</li>
<li>Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+functions+of+kinesin-5%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitotic functions of kinesin-5.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 255-259 (2010).</li>
<li>Schuyler, S. C., Liu, J. Y., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+function+of+Ase1p%3A+evidence+for+a+MAP-dependent+midzone-specific+spindle+matrix.+Microtubule-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular function of Ase1p: evidence for a MAP-dependent midzone-specific spindle matrix. Microtubule-associated proteins.</a> J Cell Biol. 160 (4), 517-528 (2003).</li>
<li>Loiodice, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ase1p+organizes+antiparallel+microtubule+arrays+during+interphase+and+mitosis+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Ase1p organizes antiparallel microtubule arrays during interphase and mitosis in fission yeast.</a> Mol Biol Cell. 16 (4), 1756-1768 (2005).</li>
<li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-driven+multimerization+recruits+ase1p+onto+overlapping+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule-driven multimerization recruits ase1p onto overlapping microtubules.</a> Curr Biol. 18 (21), 1713-1717 (2008).</li>
<li>Janson, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinkers+and+motors+organize+dynamic+microtubules+to+form+stable+bipolar+arrays+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast.</a> Cell. 128 (2), 357-368 (2007).</li>
<li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li>
<li>Mollinari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC1+is+a+microtubule+binding+and+bundling+protein+essential+to+maintain+the+mitotic+spindle+midzone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PRC1 is a microtubule binding and bundling protein essential to maintain the mitotic spindle midzone.</a> J Cell Biol. 157 (7), 1175-1186 (2002).</li>
<li>Braun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+braking+by+Ase1+prevents+overlapping+microtubules+from+sliding+completely+apart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptive braking by Ase1 prevents overlapping microtubules from sliding completely apart.</a> Nat Cell Biol. 13 (10), 1259-1264 (2011).</li>
<li>Lansky, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusible+crosslinkers+generate+directed+forces+in+microtubule+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Diffusible crosslinkers generate directed forces in microtubule networks.</a> Cell. 160 (6), 1159-1168 (2015).</li>
<li>Yamashita, A., Sato, M., Fujita, A., Yamamoto, M., Toda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+fission+yeast+ase1+in+mitotic+cell+division%2C+meiotic+nuclear+oscillation%2C+and+cytokinesis+checkpoint+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The roles of fission yeast ase1 in mitotic cell division, meiotic nuclear oscillation, and cytokinesis checkpoint signaling.</a> Mol Biol Cell. 16 (3), 1378-1395 (2005).</li>
<li>Roth, S., Laan, L., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cortical+Dynein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cortical Dynein function.</a> Methods Enzymol. 540, 205-230 (2014).</li>
<li>Moudjou, M., Bornens, M. Method of centrosome isolation from cultured animal cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoudjou%2C+M+%22Cell+Biology%3A+A+laboratory+handbook%22">Cell Biology: A laboratory handbook</a>. Celis, J. E. 2, 111-119 (1998).</li>
<li>Reck-Peterson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+dynein+processivity+and+stepping+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior.</a> Cell. 126 (2), 335-348 (2006).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Lancaster, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+rounding+alters+cell+geometry+to+ensure+efficient+bipolar+spindle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitotic rounding alters cell geometry to ensure efficient bipolar spindle formation.</a> Dev Cell. 25 (3), 270-283 (2013).</li>
<li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+volume+modulates+spindle+size+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis.</a> Science. 342 (6160), 856-860 (2013).</li>
<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin+and+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Avidin and streptavidin.</a> Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).</li>
<li>Moore, W., Zhang, C., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+RCC1+to+chromosomes+is+required+for+proper+mitotic+spindle+assembly+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeting of RCC1 to chromosomes is required for proper mitotic spindle assembly in human cells.</a> Curr Biol. 12 (16), 1442-1447 (2002).</li>
<li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+directly+stabilizes+reconstituted+kinetochore-microtubule+attachments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments.</a> Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).</li>
<li>Lawrimore, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+loops+generate+intracentromere+tension+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA loops generate intracentromere tension in mitosis.</a> J Cell Biol. 210 (4), 553-564 (2015).</li>
<li>Minc, N., Burgess, D., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cell+geometry+on+division-plane+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Influence of cell geometry on division-plane positioning.</a> Cell. 144 (3), 414-426 (2011).</li>
<li>Taberner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+systems+for+the+study+of+microtubule-based+cell+polarity+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro systems for the study of microtubule-based cell polarity in fission yeast.</a> Methods Cell Biol. 128, 1-22 (2015).</li>
<li>Boukellal, H., Selimovic, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+robust+storage+of+drops+and+fluids+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple robust storage of drops and fluids in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

yöntemleri su içinde yağ emülsiyonu damlacıkları temel mitotik iğ sulandırmak için burada mevcut son çabaları anlattı. geometrik sınırları içinde mili takımını okuyan birçok avantaj sağlamaktadır. Önemli geribildirim mekanizmaları mitotik iğin mikrotübüllerin ve monte edildiği geometrik kısıtlamaları arasında var. Mikrotübülüsler onlar mitotik iğ yerinden neden olabilir geometrik sınırları içine büyüyünce kuvvetleri itme üretebilir. Buna ek olarak, fiziksel bir engel büyüyen mikrotübül felaketler neden olabilir. Ayrıca, dar bir geometriye olan aks takımı da doğrudan mikrotübül büyüme oranı 36 etki gibi tübülin müstakil bileşenler, kademeli bir tükenmesine neden olabilir. Bunlar burada tarif edilen deneyler kullanılarak ele alınabilir mili montaj tüm temel belirleyicileri vardır. tarif edilen deneyler, küçük bir konsantrasyon differe çok duyarlıdırDamlacık bileşenleri nces. Bu küçük konsantrasyon farklılıkları ya da çok yavaş ya da çok hızlı bir mikrotübül büyümesiyle sonuçlanır tubulin, için de geçerlidir. Bu durumda, mikrotübül büyüme oranları genellikle de Deneyin birinci ~ 30 dakika boyunca sıcaklığı ayarlanarak düzeltilebilir. Mitotik iğ takımı ve yerleştirilmesi de (kortikal) kuvveti jeneratör konsantrasyonundaki değişikliklere çok hassastır. Bu temizlenmiş bileşenlerin konsantrasyonu, saflık ve aktivitesine bağlıdır olasıdır ve her yeni saflaştırılmış protein için dikkatle takip edilmesi gerekmektedir. Buna ek olarak, belirli bir dengeler tahlilin doğasına bağlı olarak, görüntüleme ayarlarında yapılmalıdır. Başlangıçta, çözünür floresan tübülin dimerleri yüksek seviyede görüntü bireysel mikrotübüllere güçleştirmektedir. mikrotübüller uzun büyümek ve çözünür tübülin yavaş yavaş tükenmiş gibi, sinyal-gürültü oranı giderek yüksek olur ve individu görüntülenmesine olanak tanımaktadıral mikrotübülüsler. Açık sistemlerde kurulumları aksine, geometrik sınırlandırıcı önemli bir ağartma sonuçlanan bir kütle rezervuar içinde floresan moleküller ve oksijen temizleme sistemi bileşenlerinin alışverişini önler. Özellikle, zaman içinde mili montaj ve yerleştirme kontrolü için, bu da güçlü bir oksijen tutucu sisteminin varlığında, düşük ışık yoğunlukları ile görüntü için gereklidir. Bu yöntemler in vitro basitleştirilmiş aks-benzeri yapıların aşağıdan yukarı sulandırma sağlar. Burada tanıtılan bileşenlere ek olarak, diğer birçok faktöre vb 3 çift kutuplu spiralin teşekkülünün, konumlandırma, yönlendirme, şekillendirme, etkilemek için tarif edilmiştir. Bu sistem ayrıca ilave kuvvet jeneratörler bireysel ve kombine etkilerini incelemek için genişletilebilir. Bu sistem şu anda bulunmadığına iğ oluşumuna önemli katkıda mitotik kromozom vardır. Mitotik kromatin gösterilmiştir&#39;polar-çıkarma kuvvetleri&#39; 3, (2) kromatin bağlı RanGEF RCC1 38 tarafından RanGTP degrade oluşumu, (3) kinetokorlar (depolimerizasyon ile etkileşimde bulunabilirsiniz sözde meydana getirebilirler (1) chromokinesins doğrudan mili oluşumu ) mikrotübüller 39 ve (4) karşıt mikrotübüllerin 40 arasında-mekanik bir yay gibi işlev görebilir kromatin kendisi. Son olarak, açıklanan sistem şu anda sınırlı zamansal ve mekansal aktivite üzerinde kontrol ve tanıtılan kuvvet jeneratörlerin lokalizasyonu sağlar. hücrelerinde, bir çok mil takımı faktörler, belirli bölümlerinde lokalize veya sınırlı bir zaman aralığı içinde etkilidir. Çarpıcı bir örnek özellikle C arka tarafında zenginleştirilmiş dinein aktivitesi olduğunu elegans tek hücreli aşamada embriyo asimetrik iğ konumlandırma ve hücre bölünmesini teşvik etmek. Bu sistemde, şu anda böyle bir t taklit olasılığını araştırıyoropto genetik tekniklerle ödünç emporal ve asimetrik aktivite kullanarak yöntemleri. Buna ek olarak, aynı C için geçerlidir elegans embriyo ve sert hücre duvarı ile hücreler, birçok hücre mitoz kadar yuvarlak değil. Geometrik hapsi şekli miline 41 üzerinde etkili kuvvetlerin üzerinde temel bir etkiye sahip olacaktır. Nedenle potansiyel olarak şekillendirme ve emülsiyon depolanması 42,43 damlacıkları izin daha karmaşık mikroakışkan sistemleri kullanarak, hem de küresel olmayan damlacıkları mili montaj ve konumlandırma sulandırmak için önemli olacaktır. Son olarak, doku, hücre-hücre ve hücre-alt-tabaka sinyal ve bağlantı genellikle epitel hücrelerinde olduğu gibi, yönlendirilmiş mili yönünde çevrilebilir dış işaretlere sağlar ve kök hücreleri. Bu özel tüm yönleriyle bu çalışmada dikkate alınmamıştır ve mitotik iğ assemb in vivo benzeri daha reconstitutions doğru inşa etmek için gelecek zorlukları sağlayabilirly ve konumlandırma.

mitoz sırasında, çoğaltılan genom kromozomları yeni kurulan kızı hücreleri üzerinde kardeş kromozomlardalerde eşit dağılımını sağlamak için hücre ekvatorda düzenlenmektedir. Kromozom konumlandırma ve segregasyon iki karşıt sentrozom kaynaklanan mili mikrotübül onların eki aracılık eder. Sadık kromozom dağılımı sağlamanın yanı sıra, mitotik iğ yönü de hücre bölünmesi uçağı 1 belirler. Hücre bölünmesinin koordine yönlendirme gelişimi birçok aşamaları sırasında ve doku homeostazında 2 için gereklidir. Özellikle, düzenlenen mitotik iğ konumlandırma hücresel içeriği asimetrik dağılımı neden olabilir, hatta farklı boyutlarda 2 kızı hücrelerini üretirler. Mitotik iğ montaj ve oryantasyon profaz başlar ve işbirliği ve kuvvet-jeneratörler 3,4 karşısına arasındaki karmaşık bir etkileşim tarafından orkestra edildiği. kuvvetlerin b oluşuroth çekme ve itme kuvvetleri. Bu kuvvetler, hücre korteks ile iş mili kontaklar olarak silindirin içinde hem de üretildiği ve mikrotübül dinamiklerine göre yanı sıra moleküler motorlar ve çapraz bağlayıcıların (Şekil 1) tarafından oluşturulmuş olabilir. mikrotübülüsler hücre korteks gibi sert yapılara karşı büyüyünce Pushing kuvvetleri oluşturulabilir. Sistem içinde üretilen toplam direnç kuvveti bağlı olarak, bu mitotik iğ (düşük güçler) yeniden konumlandırılması ile sonuçlanabilir veya mikrotübül burkulma veya felaket (yüksek kuvvetler) 5-8 tetikleyebilir. Uzunluğu 9 mikrotübül burkulma güçlü bir belirleyici olduğu iterek oluşturulabilir kuvvetin miktarı, mikrotübül uzunluğuna bağlıdır. Buna ek olarak, tek bir sentrozom kaynaklanan mikrotübüller diğer sentrozom karşı erken profaz 3,10 içinde sentrozom ayırmanın gerçekleştirilmesi için öne sürülmüştür bir mekanizma itebilir. Reklamdabüyüyen mikrotübül tarafından oluşturulan kuvvetleri itme, mikrotübül temas biter hücre korteksine koşul da güçleri 11 çekerek arabuluculuk yapabilirsiniz. Birden laboratuvarların Çalışmalar kortikal kuvvet jeneratör kontrollü aktivite vivo 1 mitotik iğ asimetrik konumlandırma için gerekli olduğunu göstermiştir. Bu çekme kuvveti için gerekli (bundan böyle &#39;dinein &quot;olarak adlandırılır) korteks lokalize sitoplazmik dinein, eksi uç yönlendirilmiş mikrotübül motor proteinlerinden 8,12,13 olup. Örneğin, maya, korteks 14 boyunca kayar motora bağlı mikrotübül mikrotübül kafes sonucu kortikal dinein yanal etkileşimleri tomurcuklanmasına. Ancak, kortikal çekme kuvvetleri de Mikrotübülleri 8 depolimerizasyon için son ekleri oluşturmak için dinein yeteneği ile oluşturulabilir. Mikrotübül büzülme tarafından üretilen enerji genellikle daha yüksek büyüklükte bir sipariş kuvvetler yol açabilir (~ 50 pN (15 referans </syukarı&gt;)) bireysel motorlu proteinler tarafından oluşturulan kuvvetler daha (~ 7-8 pN (ref. 16)). Depolimerizasyon mikrotübül kortikal dinein sonu-on eki tomurcuklanan maya 17 ve C mili konumlandırma teşvik elegans 13. Motor bağımlı kayma ve mikrotübül depolimerizasyon tahrik hem kortikal çekme kuvvetleri işbirliği ya da in vivo birbirini dışlayan olup olmadığını mevcut bilinmeyen yer almaktadır. mikrotübül itme kuvvetleri ve dinein aracılı kortikal çekme kuvveti ek olarak, sentrozom konumlandırma çok sayıda başka proteinlerle mitotik iğ içinden kontrol edilir. Kinesin-5 motorlar, örneğin, dışarı doğru kayar kuvvetleri 18-20 üretimi ile sonuçlanan, antiparalel interpolar mikrotübülleri bağlantı çapraz tetramerler olarak mevcuttur. Kinesin-5 Motor ailesinin üyeleri C haricinde, incelenen tüm ökaryotlarda sentrozom ayırma ve çift kutuplu spiralin montaj için gerekli olan elegans<html> (referans 21 gözden). Ayrıca, ASE1 / PRC1 ailesinin yayılabilir çapraz bağlayıcılar de in vivo ve in vitro 22-27 interpolar mikrotübül mikrotübül bölgelerinin üst üste lokalize edilmesi için bilinmektedir. Örtüşen mikrotübül bölgenin ASE1 odaklı genleşme kuvvetlerin vitro 28,29 bölgesindeki kinesin-14 aracılı sürme kuvvetleri dengelemek için yeterince büyüktür. Hücrelerde, ASE1 / PRC1, mil orta sonda 25-27,30 mikrotübül bölgeleri üst üste yayılabilir çapraz bağlayıcılar tarafından oluşturulan kuvvetleri önemli derecede mili düzenlenmesine katkıda düşündüren kararlı oluşumu için gereklidir. Son olarak, mitoz kromatin gelen kuvvetler ve kinetokorlar çeşitli yollar 3 ile mitotik iğ montaj ve konumlandırma etkilemektedir. Bu bileşenler Burada tarif edilen sulandırma deneyleri parçası olmadığından, bunlar ayrıntılı olarak ele alınmayacaktır. jove_content &quot;&gt; Farklı teoriler yukarıda açıklanan farklı moleküler bileşenleri ve kuvvetler iğ montaj ve konumlandırma işbirliği nasıl var, ancak biz niceliksel bir anlayış hala uzağız. Buna ek olarak deneylere canlı hücrelerde, saflaştırılmış bileşenler ile in vitro deneyler güçlü sağlamak rota Bu hedefe ulaşmak için. Burada, temel iğ su-içinde-yağ emülsiyonu damlacıkları içinde yeniden edildiği en son yayınlanan yöntemlerin adapte edilmiş ve genişletilmiş versiyonu (Roth et al. 31), bir görsel bir kılavuz mevcut bulunduklarında, bir ile başlayan mikroakışkan teknikler kullanılarak bileşenleri minimum sayısıdır., küresel damlacıklar mitotik hücre karşılaştırılabilir boyutlarda oluşturulacak. bu damlacıklar içinde, saflaştırılmış sentrozom ve tübülin, mikrotübül aster dinamikleri üzerinde çalışmak üretimi ve aster-aster etkileşimleri zorlamak için birleştirilebilir. tarafından kortikal (örneğin dinein gibi) ve inter-polar (örneğin kinesin-5 / ASE1) kuvvet jeneratörler tanıtan, bizin vivo durumu benzemeye başlar giderek karmaşık mili benzeri yapılar sulandırmak.

<table><tbody><tr><td><Güçlü>1. Mikroakışkan çiplerin hazırlanması</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photomask (Film substratı üzerinde fotoğraf maskesi)</td><td>Selba S.A. İsviçre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silikon gofret (4 inç silikon gofret p/Bor < 1-0-0>10-20 &Omega;-cm, 500-550 &mu; m, SSP, 2 daireli)</td><td>WRS Malzemeleri</td><td>4P0SSP-005</td><td></td></tr><tr><td>Spin kaplayıcı&nbsp;</td><td>Polos</td><td>SPIN150I</td><td></td></tr><tr><td>PDMS pre-polimer RVT615 A + B</td><td>Lubribond</td><td>9481</td><td></td></tr><tr><td>Korona işleyici</td><td>Elektro-teknik ürünler</td><td>BD-20ACV</td><td></td></tr><tr><td>2. Mikroakışkan kurulum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>DOPS (1,2-Dioleoil-sn-glisero-3-fosfo-L-serin)</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-( biotinyl))</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>870285</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>Cam pipetler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Cam tüpler</td></tr><tr><td>Vakum pompası</td><td>Laboport</td><td>KNF</td><td></td></tr><tr><td>Vakum</td> odası <td>Kartell</td><td>Polipropilen Vakumlu Kurutucu</td><td></td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Yüzey Aktif Madde (Span80)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>Sonikatör</td><td>Branson</td><td>M2800H</td><td></td></tr><tr><td>Lameller</td><td></td><td></td><td>24 mm x 60 mm, kalınlık 1.5</td></tr><tr><td>Cam kızaklar</td><td></td><td></td><td>26 mm x 76 mm</td></tr><tr><td>Zımba</td><td>Harris Uni-Core</td><td>135840/135841/135843</td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvar sızdırmazlığı film</td><td>Parafilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Valap (eşit konsantrasyonlarda eritilmiş vazelin, lanolin, parafin mumu)</td><td></td><td></td><td>Ev yapımı</td></tr><tr><td>Brightfield Mikroskobu</td><td>Leica</td><td>PMIRB&nbsp;</td><td>Herhangi bir ters çevrilmiş parlak alan yeterli olacaktır</td></tr><tr><td>Basınç kontrol cihazı</td><td>Fluigent</td><td>MFCS-FLEX-4C-1000</td><td></td></tr><tr><td>PEEK Boru</td><td>Cluzeau Info. Labo, Fransa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroakışkan şişeleri (Tüpler Micrew 0.5 ml ve 1 ml)</td><td>VWR, Hollanda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3. Mil oluşumu ve konumlandırmanın yeniden yapılandırılması</güçlü>güçlü<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>güçlü>İsim<>güçlü<</td><td>güçlü>Şirket<>güçlü</td><td><güçlü>Katalog Numarası</güçlü></td><td>güçlü><Yorumlar</güçlü></td></tr><tr><td>Dekstran-647 nm (Dekstran, Alexa Fluor 647, 10.000 MW, Anyonik, Tamir Edilebilir)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA - Sığır serum albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glikoz (D- (+) - Glikoz)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz-oksidaz (Aspergillus niger'den glikoz oksidaz)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-ditioltheitol)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Katalaz (Katalaz sığır karaciğerinden oluşur)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin (Sığır beyninden tübülin)</td><td>Hücre İskeleti A.Ş.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubulin-488/561 (HiLyte-488 / Rodamin etiketli tübül, domuz beyninden)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GTP (Guanozin-'5-trifosfat, sodyum tuzu hidrat)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>&kappa; -kazein (&kappa; -sığır serum sütünden elde edilen kazein)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C0406</td><td></td></tr><tr><td>Airfuge (Hava tahrikli ultrasantrifüj)</td> <td>Beckman-Coulter</td><td>CLS</td><td></td></tr><tr><td>4. Mil montaj faktörlerinin tanıtılması< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Adı< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü</td> <td>> < güçlü > Yorumlar< / güçlü ></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenozin-'5-trifosfat, disodyum tuzu hidrat)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>PEP (Fosfo (enol) piruvik asit monosodyum tuzu hidrat & ge; % 97 (enzimatik))</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P0564</td><td></td></tr><tr><td>PK / LDH - (tavşan kasından piruvat kinaz / laktik dehidrojenaz enzimleri)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P0294</td><td></td></tr></tbody></table>

küresel emülsiyon damlacıkların temel mitotik mil sulandırma

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

Mitotik iğ düzeneği, konumlandırılması ve oryantasyonu, mikrotübül dinamiği, mikrotübül motor proteinleri ve çapraz bağlayıcılar tarafından üretilen birleşik kuvvetlere bağlıdır. Büyüyen mikrotübüller itme kuvvetleri üretebilirken, depolimerize mikrotübüller, örneğin kortikal dynein veya kromozomlara bağlandığında, mikrotübül büzülmesinden gelen enerjiyi çekme kuvvetlerine dönüştürebilir. Ek olarak, iş mili içindeki motor proteinler ve yayılabilir çapraz bağlayıcılar, anti-paralel mikrotübülleri birbirine bağlayarak ve kaydırarak iş mili mimarisine katkıda bulunur. İn vivo, bireysel oyuncuların genel güç dengesine göreceli katkısını çözmenin zor olduğu kanıtlanmıştır. Burada, temel mitotik iğcikleri aşağıdan yukarıya in vitro olarak yeniden oluşturma çabalarımızda yakın zamanda geliştirdiğimiz yöntemleri sunuyoruz. Mikroakışkan teknikler kullanılarak, sentrozomlar ve tübülin, yağda su emülsiyon damlacıkları içinde kapsüllenir ve geometrik olarak sınırlı (çift) mikrotübül asterlerinin oluşumuna yol açar. Ek olarak kortikal olarak ankrajlı dynein, artı uçlu yönlendirilmiş mikrotübül motorlar ve yayılabilir çapraz bağlayıcılar ekleyerek, bu sistem mil benzeri yapıları yeniden oluşturmak için kullanılır. Burada sunulan yöntemler, daha eksiksiz mitotik iğciklerin yeniden yapılandırılması için bir başlangıç noktası sağlar, her bir ayrı bileşenin katkısının ayrıntılı bir şekilde incelenmesine ve mitotik iğ içindeki kuvvet dengesinin entegre bir nicel görünümünün elde edilmesine olanak tanır.

Önceki bölümlerde sunulan yöntemler su-içinde-yağ emülsiyonu damlacıklarının geometrik tutulmasını kullanılarak karmaşıklığı arttıkça aks-benzeri yapıların tekrar oluşturulmasını sağlar. Bu bölümde niteliksel bu tahlillerin yeteneği gösteren temsili sonuçlarını açıklar. Bir çift kutuplu spiralin monte edildiğinde, mitoz sırasında, hücreler insan hücreleri için ölçülen yaklaşık 15 um bir çapı olan küreler oluşturmak için yuvarlak. Bu özellik mitotik hücre şekil kısıtlar hem iğ boyutunu ve yönlendirmesini 35,36 yönlendiren bir geometrik sınır sağlar. Mikroakışkan teknikleri, doğru canlı hücrelerde gözlenen durumun benzer ve bu nedenle in vitro mitotik iğ aşağıdan yukarıya yeniden izin geometrik hapsi düzeyi sağlamak. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-mikrotübül büyümesi geometrik sınırlarla kısıtlı olduğunda sayfa = &quot;1&quot;&gt; Mikrotubul asters zaten kendileri tarafından karmaşık davranış yeteneğine sahiptirler. mikrotübül büyüdükçe, yeni, tubulin dimerlerinden eklenmesi ile oluşturulan itme kuvvetleri emülsiyon damlacıklarının yanları iki sentrozom sürücü. İlk başta, sentrozomlar serbestçe sınırlı hacim (Şekil 4a, sol panel) içinde yaygın. yaklaşık 20-30 dakika sonra, ilk mikrotübül mikrotübül her yöne korteks karşı büyüdükçe görünür ve sentrozom difüzyon sınırlı olur olur. ara madde uzunlukta (damlacık çapının yaklaşık% 50) mikrotubul Asters (sterik) ve diğer sentrozom korteks birbirlerine karşı itme mikrotübüller ile birlikte, her biri başka bir dağılmasına neden olabilir. Bu birbirine (Şekil 4a, orta panel) karşıt iki sentrozom tipik bir &#39;bipolar&#39; iğ gibi düzenleme ile sonuçlanır. mikrotübül damlacık-dia ~% 50 daha uzun büyüyüncemetre, sentrozomlar damlacık korteks (Şekil 4a, sağ panel) boyunca büyüyen mikrotübül ile damlacık karşıt sınırları daha da itti olsun. Deneylerde mikrotübül büyüme oranları, sıcaklık ve tübülin konsantrasyonlarında hem çok hassas olduğunu not etmek önemlidir. çekirdeklenme ilk gözlendiğinde ve kararlı durum aster pozisyonları ulaşıldığında Bu parametreler, bu nedenle güçlü süresini etkiler. hücrelerde, kortikal çekme kuvvetleri mikrotübül artı sonları ve korteks ile ilişkili dinein arasındaki yük taşıyan ekleri oluşumu yoluyla oluşturulur. Hayvan hücrelerinde, bu ilişki Gαi 1 N-terminal miristoilasyon ile plazma membranına hedeflenen Gαi / LGN / numa kompleksi bağlıdır. Bu yeniden yapılanma tahlillerde, Gαi / LGN / numa kompleksinin gereksinimi doğrudan aracılığıyla biyotinile lipidler için dynein birleştirilmesi suretiyle atlanırbiyotin-streptavidin-biyotin kompleksleri oluşumu. Bu bağlar nispeten sabit (Kd ~ 10 -14 M) 37 ve hızla meydana (genellikle mikrotübül çekirdeklenme belirgin hale gelmeden önce, bir emülsiyon damlacık oluşumundan sonra, 10 dakika içinde) (Şekil 4b). Dinein yokluğunda, sentrozom damlacık korteks (Şekil 4c) karşıt kenarlarına itilir ise kortikal dinein mevcudiyetinde, sentrozom tipik haliyle, daha merkezi olarak korurlar. Biz Bunu önlemek ve mikrotübül iterek kuvvetleri karşı iki etkinin sonucudur muhakeme. (1) Dinein doğrudan mikrotübül felaketleri, böylece mikrotübül uzunluğu kısıtlayan ve aşırı mikrotübül burkulma önlenmesi ve (2) kortikal çekme kuvvetleri aster-aster itme kuvvetleri karşı bireysel asters 8, net merkezleme kuvvetlerine yol teşvik etmektedir. ASE1 f indükleyen yayılabilir çapraz bağlayıcıeğilimi orces anti-paralel mikrotübüllerin 29 örtüşen bölgeyi artırmak için. Bununla uyumlu olarak, (dinein ve yokluğu) ASE1 varlığında sentrozomlar ASE1 interpolar Mikrotübülleri (Şekil 4d) birlikte için lokalize ile birbirine yakın bulunmuştur. kinesin-5 aile fertleri (giriş bölümüne bakınız) mili içinden iterek güçleri sağlayarak sentrozom ayrımı sürücü. Cut7 (S. pombe kinesin-5 ortolog) varlığında, sentrozom da ASE1 (Şekil 4e) varlığında, emülsiyon damlacıklarının karşıt taraflarında itilir. kortikal ve inter-polar kuvvet jeneratörleri birleştirerek, karmaşıklık düzeyi daha nihayetinde bipolar mitotik iğ düzeneğinin kapsamlı bir anlayış neden bu deneylerde artırılabilir. Bu sonuçların detaylı niceliksel açıklamalar, gelecekte var olacak (Roth ve ark., Lığa). <p class="jove_content" fo:keep-together.within sayfa = &quot;1&quot;&gt; zaman içinde sabit anlarda sentrozom konumuna dikkat ve mikrotübül gözlenen uzunlukları davranışlarını ilgili ek olarak, değerli bilgiler üzerinden konumlandırma işlemi uygulayarak elde edilebilir zaman. etki süreleri ve lazer yoğunlukları azaltarak, sadece ~% 30 ağartılması ile en az 1 saat boyunca 2 dakikalık aralıklarla aster konumlandırma takip etmek mümkündür. Bu merkezi aracılığıyla serbestçe difüzyon sentrozom gelen aster montaj ve konumlandırma izleme (0 dak.) Izin verir (12 dk.) Ademi asters (36 dk ve daha fazla) (Şekil 5c) için. Bu kararlı hal davranışı ve mili montaj kinetik hem de çalışma kolaylaştırır. Aynı numunedeki farklı içeriklerle damlacıkların birleştirerek, örneğin, mümkün olan doğrudan (Şekil 5B) ve kortikal güç jeneratörleri olmayan damlacıklar halinde sentrozom konumlandırma ve mil düzeneği kinetiğinin karşılaştırılması vardır. Şekil 1: Kuvvetler Mitotik Mil üzerinde hareket Çeşitli kuvvet üreten moleküller iğ oluşumunu ve konumlandırma teşvik etmek için mitotik milin mikrotübüller hareket.. Hücre korteks içine büyümeye mikrotübül sentrozom bir itme kuvveti oluşturur. (Mor) Kortikal dinein depolimerizasyon mikrotübülleri yakalar ve sentrozom üzerine bir çekme kuvveti oluşturur. PRC1 / ASE1 ailesinin çapraz bağlayıcılar bir kuvvet sürgülü dışa karşı oluşturmak ise mili içinde, kinesin-5 / Cut7 motor proteinler, anti-paralel mikrotübüller üzerinde dışa doğru kayar kuvveti sağlamak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için tıklayınız .</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig2.jpg" /> Şekil 2:. 4 mikroakışkan çipleri içeren 4 inçlik photomask mikroakışkan Chip Tasarım (A) tasarımı. (B) tek bir yonga detaylı gösterimidir. Fişleri bir çıkış kanalı ve bir toz filtresi ve ardından üç giriş kanalı ihtiva eder. Giriş kanalı 1 su fazı içeren, lipit / Yağ fazında ve kanal 3 2 kanallı ilave lipit / yağ-fazı ile oluşturulan damlalar seyreltilmesi için de kullanılabilir. (C) (üstten ve alttan gelen) lipit / yağ fazı (soldan geliyor) su fazı ile bir araya geldi kavşak detaylı gösterimi. Kavşakta, damlacıklar oluşturacak ve sağdaki çıkış kanalına doğru akar. (D) 2 mikron kanallı bir toz filtresi detaylı gösterimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54278/54278fig3.jpg" /> Şekil 3:. Su içinde yağ emülsiyonu damla oluşumu için Yöntem (A) parlak alan mikroskop mikroakışkan çipi ve Mikroakiskan boru. Hem su ve lipid / yağ fazı tüpler, sırasıyla çip girişler 1 ve 2&#39;ye bağlıdır. Su ve lipid / yağ safhaları karşılayan Mikroakiskan yonga üzerinde (B) Kısıtlama. basınçları değiştirerek, damlacıklar büyüklüğü kontrol edilebilir. PDMS kaplı akış hücrelerinin (C) tasarımı. akış hücre içine damlacıklar yükledikten sonra, açık uçları ek valap ile kapatılır. (D) damla oluşumunun şematik. Damlacıklar sentrozom, tubulin ve mitotik iğ formasyonu için gerekli olan ek bileşenler kapsüllenmesi için kullanılmaktadır. Kortikal-dynein hedefleme (E) şematik. Biyotinile (Bio) dynein streptavidin (STRP) aracılığıyla biyotinile lipidler hedeflenmektedir. <a= &quot;Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot; href&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54278/54278fig4.jpg" /> Şekil 4:. Karmaşıklığı artırılması ile Mili-Reconstitutions Temsilcisi Sonuçlar (A), kısa, orta ve uzun mikrotübül örneklerini gösteren iki sentrozom içeren damlacıkların maksimum yoğunluğu projeksiyonları. Sentrozom ve mikrotübüller,% 10 HiLyte-488 tubulin etiketli ilave tarafından görüntülenmiştir. Ölçek çubukları 10 mikron =. (- Sol) ve streptavidin (STRP) varlığı (+, sağ) yokluğunda GFP biyotin-dinein-TMR (B) lokalizasyonu. Kortikal GFP-biotin-dynein-TMR (sağ +) - (sol) veya varlığı (C) Mikrotubul aster yokluğunda konumlandırma. (D) Mikrotubul aster (sol panel, green ASE1 varlığında) yerleştirme (orta panel, kırmızı). ASE1 ve Cut7 (kinesin-5) (orta panel, kırmızı) varlığında (E) Mikrotubul aster (sol panel, yeşil) konumlandırma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54278/54278fig5.jpg" /> Şekil 5: in vitro Görüntüleme Aster Konumlandırma Dinamikleri (A) birçok saat kadar için damlacık görüntüleme sağlayan bir PDMS fincan tasarımı.. (B) Üretimi, depolama ve damlacıkların görüntüleme floresan dekstran yokluğunda (solda) içerme (sağ) (Alexa 647) ile izah farklı içerikleri içeren (iletilen). (C) 60 dk time-lapse Tek düzlemi görüntüleri (2 dk aralıklarla) reklamın z-yığının (2 mikron mesafeler) alınanTek bir centrosome içeren roplet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Mitotik iğin montajı ve konumlandırılması, mikrotübül dinamiği, motor proteinler ve çapraz bağlayıcılar tarafından üretilen birleşik kuvvetlere bağlıdır. Burada, temel mitotik iğciklerin aşağıdan yukarıya yeniden yapılandırılması için küresel emülsiyon damlacıklarının geometrik olarak hapsedilmesinin kullanıldığı yakın zamanda geliştirilen yöntemlerimizi sunuyoruz.

Küresel emülsiyon damlacıkların Temel Mitotik Mil Sulandırma

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

Bu prosedürün genel amacı, su içinde yağ emülsiyon damlacıklarının geometrik sınırlaması dahilinde mitotik iğe benzeri yapıları yeniden oluşturmaktır. Bu yöntem, iğelerin nasıl konumlandığı ve kurulduğu ile tekil bileşenlerin bu süreçlere spesifik katkısının ne olduğu gibi, mitotik iğe kurulumu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mitotik bir hücrenin şeklini taklit eden geometrik sınırlama içerisinde iğe benzeri yapıları yeniden oluşturmak için aşağıdan yukarıya (bottom-up) bir yaklaşım kullanmamızdır.Bu yöntem, hücresel sınırlamaya bağımlı olan diğer süreçleri incelemek için de kullanılabilir. Yaklaşık 40 gram toplam kütlede, 10 birim PDMS ön-polimeri ile bir birim kürleme ajanını karıştırın. Ardından, hava kabarcıklarını gidermek için karışımı yaklaşık 30 dakika boyunca bir vakum odasına yerleştirin.Bu sırada, kalıbın etrafını alüminyum folyo ile sararak dört inç çapında ve bir santimetre derinliğinde bir kap oluşturun. Hazır olduğunda, PDMS karışımının yaklaşık 3/4'ünü kalıba dökün. Ardından, PDMS'i 30 dakika daha vakum odasına geri yerleştirin.Gaz giderme işleminin ardından, PDMS'i 100 °C'de bir saat boyunca kürleyin. Bu sırada, cam lamları basınçlı hava ile tozlarından temizleyerek spin kaplama için hazırlayın. Ardından, kalan PDMS karışımını lamların üzerine spin kaplama yöntemiyle uygulayın.PDMS'yi sertleştirmek için bu lamları 100 °C'de bir saat boyunca kürleyin. Ardından, PDMS şeritlerini bir jilet yardımıyla nazikçe soyun ve mikroakışkan çipler oluşturmak için PDMS şeritlerinden gerekli delikleri açın. Şimdi, mikroakışkan çipi ve PDMS kaplı bir cam lamı birkaç saniye boyunca korona işlemiyle değerlendirin.Son olarak, kanalları aşağı bakacak şekilde her bir lam üzerine bir mikroakışkan çip yerleştirin ve çipleri gece boyunca 100 °C'de fırınlayın. İlk olarak, kloroformla yıkanmış cam malzemeler kullanarak, kloroformda çözünmüş yaklaşık 250 µg lipid hazırlayın. Lipid karışımını inert gaz ile dikkatlice kurutun.Ardından, bir saat boyunca vakum odasına yerleştirin. Sonra, lipidleri mineral yağ ve %2,5 surfaktan içinde 0,5 mg/mL konsantrasyona (yaklaşık 500 µL) gelecek şekilde çözün. Lipidleri tamamen çözmek için karışımı 40 kHz'de 30 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun.Ardından, mikroskop objektifine uygun bir kalınlıkta PDMS'yi lamellere spin coat yöntemiyle kaplayın. Daha sonra, PDMS'yi cam lamlara spin coat yöntemiyle kaplayın. Şimdi, PDMS kaplı lamelleri ve cam lamları 100 °C'de bir saat boyunca kürleyin.Ardından, PDMS kaplı cam lamların üzerine ince laboratuvar sızdırmazlık filmi dilimlerini birbirine yakın şekilde yerleştirerek akış hücrelerini oluşturun. Üç milimetrelik şeritleri yaklaşık iki milimetre aralıklarla konumlandırın. Daha sonra, akış hücrelerini PDMS kaplı bir kapatma lamı ile örtün ve filmi 100 °C'de kısa bir dakika boyunca eriterek düzeneği mühürleyin.Isıttıktan sonra, lamelini nazikçe aşağı bastırın ve Valap ile mühürleyin. Ardından, uzun süreli görüntüleme için bir PDMS kap hazırlayın. 3 mm kalınlığındaki bir PDMS dilimine 4 mm çapında bir delik açın.Ardından, PDMS dilimine ve PDMS kaplı lamel camına korona işlemi uygulayın. İşlem tamamlandıktan sonra bunları üst üste yerleştirin ve düzeneği 100 °C'de gece boyunca pişirin. Damlacık oluşumunu ters aydınlık alan mikroskobunda izleyin.Lipit yağ fazını basınç kontrolörüne bağlayın ve yağın bir damlası peak tüpünden çıkana kadar basıncı artırın. Peak tüpünü mikroakışkan çipin ikinci girişine bağlayın. Ardından, mikroakışkan çipleri ikinci girişten lipit yağ fazı ile tamamen doldurun.Ardından, birinci girişi kullanarak MRB-80 bazlı su fazını ekleyin. Yaklaşık 15 mikron çapında damlacıklar oluşturmak için lipid yağ fazı ve su fazı basınçlarını değiştirerek damlacık boyutunu kontrol edin. Lipid yağ fazı için yaklaşık 800 millibar ve su fazı için 200 millibar uygun bir başlangıç noktasıdır.İstenen damlacık boyutu elde edildikten sonra, akış hücresini tamamen damlacıklarla doldurun. Bu damlacıklar, su fazının küçük hacimleri kullanılarak oluşturulur. Bu durum, doğru boyuttaki damlacıklar oluşmadan önce tüm su fazının tüketilmemesi için mikroakışkan düzeneğin hızlı çalışması gerektiği anlamına gelir.Doldurulduktan sonra, akış hücresinin uçlarını Valap kullanarak dikkatlice kapatın. Damlacıklar hareket etmeyi bırakmazsa, sızdırmazlık tamamlanmamış olabilir veya hava kabarcıkları girmiş olabilir. Uzun süreli görüntüleme için damlacıkları bir PDMS kaba aktarın ve bir yağ lipid karışımı tabakasıyla örtün.Sentrozomları oda sıcaklığında çözdürün ve uygun mikrotübül nükleasyonunu sağlamak için 37 °C'de 20 dakika bekletin. Bekleme süresinde, assay karışımını buz üzerinde hazırlayın. Bu karışım; tubulin, GTP, bir oksijen yakalayıcı sistem, mikrotübül çapraz bağlayıcıları gibi moleküler kuvvet üreteçleri, ATP ve ATP rejenerasyon sistemi içermelidir.Karıştırıldıktan sonra, örneği soğutulmuş Airfuge rotorunda 30 psi'da üç dakika boyunca döndürün. Ardından, önceden ısıtılmış sentrozomları karışıma ekleyin. Damla başına bir veya iki sentrozom elde etmek için eklenen sentrozom miktarını optimize edin.Ardından, daha önce açıklandığı şekilde emülsiyon damlacıkları üretmek için bu karışımı kullanın. Dynein proteinlerini damlacık korteksindeki biyotinillenmiş lipidlere çekmek için su fazına GFP-dynein TMR ve streptavidin ekleyin. Döner disk konfokal mikroskop ile 26 °C'de 30 dakika bekledikten sonra mikrotübül büyümesini görüntüleyin.Görüntüleme sırasında, sıcaklık 28 veya hatta 30 °C'ye yükseltilerek mikrotübül büyümesi teşvik edilebilir. Z-projeksiyonları için, damla başına yaklaşık 20 görüntü gerektirecek şekilde bir mikron aralıklarla yığınlar alın. Ana kamera paneline gidin, Edit Z'ye tıklayın ve Z Step değerini 1.0 olarak ayarlayın.Ayarları kaydetmek için İleri'ye tıklayın. Ardından, Edinme panelindeki Kamera sekmesine tıklayıp EM Gain çubuğunu 300'e getirerek maksimum doğrusal EM Gain değerini ayarlayın. Son olarak, aynı sekmede Pozlama Süresini 200 milisaniye olarak ayarlayın.Ayarları kaydetmek için Record'a tıklayın. Canlı görüntüleme deneyleri için, pozlama sürelerini yaklaşık 100 milisaniyeye düşürerek ve Z aralıklarını iki mikrona çıkararak iki saat boyunca her iki dakikada bir Z Projeksiyonları yapın. Canlı görüntüleme deneylerinde, örneğin maksimum immobilizasyonu için standart bir akış hücresi yerine PDMS kap kullanın.Tanımlanan protokoller kullanılarak, sentrozom içeren su ve yağ emülsiyon damlacıklarında aster oluşumu incelenmiştir. Başlangıçta sentrozomlar, sınırlı hacimler içerisinde serbestçe difüze olur. Yaklaşık 20 ila 30 dakika sonra ilk mikrotübüller görünür hale gelir ve mikrotübüller her yöne doğru kortekse karşı büyüdükçe sentrozom difüzyonu kısıtlanmaya başlar.Mikrotübüller damlacık çapının yarısından daha uzun olduğunda, sentrozomlar karşıt sınırlara doğru itilir ve mikrotübüller damlacık korteksi boyunca uzar. Streptavidin yokken, dynein damlacık içinde difüz haldedir. Ancak streptavidin varlığında, damlacık oluşumundan yaklaşık 10 dakika sonra, dynein biyotinize lipidlere bağlanır.Kortikal dinein varlığında floresan tubulin incelendiğinde, sentrozomların merkezi konumda olduğu açıkça görülmektedir. Dinein yokluğunda ise sentrozomlar damlacığın zıt taraflarına itilmektedir. Bu durum muhtemelen, dineinin mikrotübül katastroflarını ve kortikal çekme kuvvetlerini teşvik etmesinden kaynaklanmaktadır ve bu da asterlerin merkezlenmesiyle sonuçlanmaktadır.Bu videoyu izledikten sonra, küresel emülsiyon damlacıkları içinde iğsi yapılar oluşturmak için mikroakışkan teknolojilerinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Uzmanlaşıldığında, damlacık oluşturma ve görüntüleme işlemleri uygun şekilde gerçekleştirildiğinde iki ila üç saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür kullanılarak, iğ morphology ve konumlandırma üzerindeki etkilerini incelemek amacıyla diğer iğ montaj faktörleri de kapsüllenebilir.Kloroform veya PDMS kullanılırken her zaman eldiven giymek gibi önlemler alınmalıdır.

reconstitution-basic-mitotic-spindles-spherical-emulsion

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, lipid çift katmanları ile kaplanmış mikroküreler üzerinde septin protein düzeneğini inceleme tekniğini açıklar. Bu teknik, eğri yüzeyler üzerindeki eğriliğe bağlı protein düzeneklerinin anlaşılmasına yardımcı olur.

Küresel Destekli Lipid Çift Tabakalı Deney: Mikroküreler Üzerinde Septin Düzeneğini Gözlemlemek İçin Bir Teknik

Yüksek oranda paketlenmiş mikrometre boyutunda bileşenler içeren dev kesecikler kullanışlı hücre modelleridir. Yağda su emülsiyonu santrifüjleme yöntemi, kapsüllenmiş malzemelerle dev veziküllerin hazırlanması için basit ve güçlü bir araçtır.

bir su-içinde-yağ emülsiyonu santrifüj Dev veziküller Kapsüllenen Mikrokürelerin hazırlanması

Mevcut çalışma yöntemi micellar nanocrystals, nanobiomaterials, gelişmekte olan bir büyük sınıf imal açıklanır. Bu yöntem yukarıdan aşağıya electrospray, aşağıdan yukarıya kendinden montajlı birleştirir ve solvent bazlı yapı denetim. İmalat yöntemi büyük ölçüde süreklidir, yüksek kaliteli ürünler üretmek ve Yapı Denetim ucuz bir yol sahiptir.

Küresel ve solucan şeklinde Micellar Nanocrystals Electrospray, kendinden montajlı birleştirerek ve Solvent Bazlı Yapı Denetim imalatı

Biz petrol su microemulsions içinde Xenopus laevis yumurta özleri Kapsüllenen tarafından vitro kendini sürekli mitotik salınımlarını tek hücre düzeyinde nesil için bir yöntem mevcut.

Microemulsions boş hücre Xenopus yumurtanın hücre döngüsü salınımlarını sulandırma ayıklar

Yağdaki su damlacık tahlilleri analitik kimya, enzim evrimi ve tek hücre analizi için yararlıdır, ancak tipik olarak damlacıkları oluşturmak için mikroakışkanlar gerekir. Burada, damlacık tahlillerini gerçekleştirmek için mikroakışkan içermeyen bir yaklaşım olan parçacık şablonlu emülsifikasyonu açıklıyoruz.

Parçacık Şablonlu Emülsifikasyonu MikroakışkanSız Damlacık Tahlillerini Mümkün

Burada, tanımlanmış proteolipozomlarda tamamen saflaştırılmış bileşenlerle Msp1 ekstraksiyon aktivitesinin yeniden uzlaştırılması için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Msp1 Ayıklama Etkinliğinin Tamamen Saflaştırılmış Bileşenlerle Yeniden Uzlaştırılması

Burada, iki mikrotübül popülasyonunun dinamiklerini aynı anda ölçmek ve karşılaştırmak için TIRF mikroskopi tabanlı in vitro resusyon testi sunulmaktadır. Çapraz bağlı mikrotübül demetleri ve tek mikrotübüller üzerindeki çoklu mikrotübül ile ilişkili proteinlerin kolektif aktivitesini eşzamanlı olarak görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Çapraz Bağlı ve Tek Mikrotübüllerin Dinamiğinin In Vitro TIRF Mikroskobu ile Eşzamanlı Görselleştirilmesi

Bu yazıda, F-aktin sitoiskeletini dev unilamellar lipid veziküllerine (lipozomlar olarak da adlandırılır) kapsüllemek için deneysel teknikleri ve lipozom zarının iç broşüründe korteks-biyomimik yapan bir F-aktin tabakası oluşturma yöntemini göstereceğiz.

İn Vitro Aktin Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Yeniden Sulandırılması

Hücresiz resusyon, sitoiskelet düzeneğini anlamak için önemli bir araç olmuştur ve son on yıldaki çalışmalar, septin dinamiklerini minimal sistemlerde incelemek için yaklaşımlar oluşturmuştur. Burada septin montajını farklı membran bağlamlarında gözlemlemek için üç tamamlayıcı yöntem sunulmaktadır: düzlemsel çift katmanlılar, küresel destekler ve çubuk destekleri.

Biyofiziksel Özellikleri ve İşlevleri İncelemek için Membranlarda Septin Düzeneğinin Yeniden Sulandırılması

Bu protokol, hücre iskeletinin nükleer şekil ve fare oosit sistemindeki iç zarsız organeller üzerindeki fiziksel etkisini belgelemek için deneysel bir çerçeve sağlar. Çerçeve, diğer hücre türlerinde ve bağlamlarında kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Fare Oosit Çekirdeğinin Hücre İskeleti Tabanlı Ajitasyonunun Uzamsal Ölçeklerde Yakalanması

Bu makale, fazla ayrılmış dev veziküller içindeki hücre iskeleti ağlarının basit bir tek kap sulandırmasını tanıtmaktadır. Yöntem genelleştirilebilir ve çok çeşitli biyomoleküllerin kapsüllenmesi veya hapsedilmesi için uygulanabilir.

Laboratuvar ortamında Fazla Ayrılmış Dev Unilamellar Veziküller (GUV'ler) İçindeki Hücre İskeleti Ağlarının Sulandırılması

Öğrenin, su-içinde-yağ emülsiyon damlacıklarında mitotik mil benzeri yapıların geometrik kısıtlama altında nasıl yeniden oluşturulduğunu. Bu yöntem, mil konumlandırma ve hücre bölünmesi mekanizmalarını incelemek için güçlü bir platform sunar.

Küresel emülsiyon damlacıkların Temel Mitotik Mil Sulandırma

Daha fazla video keşfet