bir su-içinde-yağ emülsiyonu santrifüj Dev veziküller Kapsüllenen Mikrokürelerin hazırlanması

Bu yağda su emülsiyonu santrifüjleme yönteminin genel amacı, ince bir tabaka dev vezikülü kolayca hazırlamaktır. Bu yöntem, dev bir veziküle dayalı yapay bir hücrenin yaratılması gibi sentetik biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedüre başlamak için, kloroformda 25 milimolar stok DOPC çözeltisi ve sıfır noktası iki milimolar stok Texas Red DHPE stok çözeltisi hazırlayın.

Daha sonra, akan nitrojen gazı altında DOPC ve Texas Red DHPE stok çözeltilerinin bir karışımını buharlaştırarak beş mililitrelik bir cam şişenin iç yüzeyinde bir lipit filmi oluşturun. Filmi gece boyunca düşük basınç altında inkübe ettikten sonra, şişeye bir mililitre sıvı parafin ekleyin. Şişeyi alüminyum folyoya sarın ve karışımı gece boyunca 80 santigrat derecede inkübe edin.

Bir nokta beş mililitre kapaklı bir mikrotüpte, 237 nokta beş mikrolitre bir mikrometre floresan olmayan mikroküre ve 12 nokta beş mikrolitre bir mikrometre floresan mikroküre karışımı. Şimdi mikrotüpe 64 miligram sükroz, ardından 125 mikrolitre bir molar Tris tamponlu çözelti ve 875 mikrolitre deiyonize su ekleyin. Karışımı 30 saniye boyunca girdaplayın, ardından 10 dakika boyunca sonikasyon yapın.

10 mililitre Tris tamponlu çözelti hazırlandıktan sonra, bir nokta beş mililitre kapaklı mikrotüpe bir mililitre yerleştirin. Çözelti girdaplandıktan ve sonikasyona uğratıldıktan sonra, bir mililitre yağ çözeltisini 300 mikrolitre iç sulu çözelti ile bir nokta beş mililitrelik bir mikrotüpte karıştırın. Oda sıcaklığında iki dakika boyunca 10.000 rpm'de çalıştırılan mekanik bir homojenizatör kullanarak mikrotüp içindeki iki bileşeni emülsifiye edin.

Daha sonra, 300 mikrolitre yağda su emülsiyonunu, bir nokta beş mililitre kapaklı bir mikrotüpte dört santigrat derecede bir mililitre dış sulu çözeltinin üst yüzeyine nazikçe katmanlayın. Mikrotüpü 10 dakika soğuttuktan hemen sonra, karışımı 30 dakika boyunca 18.000 kez G'de santrifüjleyin. Bittiğinde, mikrotüpün altını bir itme pimi ile delerek ve sterilize edilmiş bir nokta beş mililitrelik mikrotüpte bir damlacık toplayarak çökelmiş dev vezikülleri veya GV'leri elde edin.

NC iki polimeraz zincir reaksiyonu ve hibridizasyon için bir mikroskop kapak camının üzerine yapışkan bir inkübasyon odası yerleştirin. Bir mikropipet kullanarak, seyreltilmiş önceden belirlenmiş GV'lerden 25 mikrolitreyi numune alanına bırakın ve hemen inkübasyon odasının üzerine beş milimetre kalınlığında bir sıfır noktası kapak camı yerleştirin. Veziküllerin mikroskopi görüntülerini kaydettikten sonra, önce UFBNA ve UFMCHE floresan ayna ünitelerini mikroskoba yerleştirerek floresan mikroskobu yapın.

Daha sonra analiz için üniteleri uyarma filtreleri ve emisyon filtreleri ile donatın. Yağ içinde su yönteminin başarısının en önemli belirleyicisi, GV'lerin santrifüjleme sırasında çökelmesi için iç sulu çözeltinin özgül ağırlığının dış sulu çözeltininkinden daha büyük olması gerektiğidir. Mikroküreciksiz ve mikrokürecikli GV'lerin diferansiyel girişim mikroskobu ve floresan mikroskobu, düşük lamelliteye sahip GV'lerin oluştuğunu doğruladı.

Elde edilen 160 GV'den 55'i kapsüllenmiş mikroküre ve 105'i boştu ve bu da %34'lük bir kapsülleme oranı veriyordu. GV'lerdeki mikrokürelerin hacim fraksiyonunun yaklaşık 11 artı veya eksi hacim yüzdesi olduğu tahmin edildi ve hesaplanan hacim fraksiyonunun kesinliği %10 ila %30 idi. Aynı dış sulu çözelti kullanılarak diğer malzemelerin yüzde 100 mol DOPC GV'lere kapsüllenmesi ve aynı protokol, diferansiyel girişim mikroskobu ve floresan mikroskobu ile gösterildiği gibi başarılı oldu. Bu prosedürü takiben, modellenen hücrenin aydınlatılması gibi ek soruları yanıtlamak için akış sitometrisi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, kapsüllenmiş malzemelerle dev veziküllerin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.