Name: bir su-içinde-yağ emülsiyonu santrifüj Dev veziküller Kapsüllenen Mikrokürelerin hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Öğrenin su-içinde-yağ emülsiyon santrifüj yöntemiyle dev veziküller hazırlamayı. Bu teknik, sentetik biyolojide yapay hücre oluşturma ve mikroküre kapsüllenmesi için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Şekil 1&#39;de şematik görüntüsünü çizim Tomoko Yamaguchi teşekkür ederiz. Bu çalışma Fen Bilimleri theNational Enstitüleri Bütünleştirici Bioscience için Okazaki Enstitüsü Okazaki ORION Projesi (NINS) tarafından desteklenmiştir; Astrobiyoloji Merkezi Projesi NINS ve (. No AB281010) tarafından; (. No 25102008) Yenilikçi Alanları Bilimsel Araştırma (entegre fonksiyonları oluşturulması için biyomoleküler sistemlerin dinamik sipariş) Bilim Teşvik Japonya Derneği için bir Grant-in-Aid (JSPS) tarafından; Genç Bilginler bir Grant-in-Aid (B) (KK, 15K17850 no.) JSP&#39;lerden; andby bir Grant-in-Aid Araştırma Etkinlik Başlangıç ​​için (YN için, hayır. 15H06653) JSP&#39;lerden. Ek destek Noguchi Enstitüsü, Fen Kao Vakfı tarafından sağlanan hibe ve Kurita Su ve Çevre Vakfı hibe hibe sağlanmıştır.

Su / Yağ emülsiyonu santrifügasyon yöntemi ile GVs hazırlanması 1. <ol><li> 1,2-dioleoil-sn -glisero-3-fosfokolin bir stok çözeltisi (DOPC, 25 mM) ve Texas Red 1,2-dihexadecanoyl- sn -glisero-3-fosfoetanolamin bir stok solüsyonu, trietilamonyum tuzu (Texas Red hazırlanması DHPE, 0.20 kloroform içinde mM) ve -20 ° C&#39;de stok solüsyonları saklayın. </li><li> Bir yağ çözeltisi hazırlayın. <ol><li> DOPC stok çözeltisi (51.0 ul ve azot gazı akışı altında Texas Red DHPE stok çözeltisi (19.2 ul) oluşan bir karışım buharlaştırılır ile 5 ml&#39;lik bir cam şişenin iç yüzeyinde bir lipid filmi oluşturmak. </li><li> Gece boyunca indirgenmiş basınç altında bir film inkübe ve sonra, (g / cm3 0.86-0.89) şişeye sıvı parafin 1.0 ml. alüminyum folyo şişeyi sarın ve geri kalanı 80 ° CO / N it at kuluçkaya yatmaktadır. 3 mM - DOPC ve Texas Red DHPE son konsantrasyonları 1.3 ve 3.8 x 10 vardırVe sırasıyla DOPC: 0.3: Texas Red DHPE mol oranı 100&#39;dür. </li></ol></li><li> İç sulu dispersiyonu hazırlanır. <ol><li> 1.5 ml kapaklı mikrotüp, 1.0 um nonfluorescent mikroküreler (2.5 hacim%) ve 1.0 mikron floresan mikroküreler (2.5 hacim%) içindeki bir dispersiyonun 12.5 ul dispersiyonun 237.5 ul karıştırın; Floresan mikrosferler nonfluorescent 5 (h / h) oranında bu 95 karşılık gelir. </li><li> Tris tamponlu solüsyon 125 ul (TBS, 1 M) ve deiyonize su 875 ul ve ardından sükroz, 64 mg ekleyin. mikrosferlerinin nihai hacim fraksiyonu 0.5 hacim% olduğu, ve Tris-HCl (pH 7.5) ve sukroz nihai konsantrasyonları sırası ile, 0.1 ve 0.15 M vardır. </li><li> Vorteks 30 saniye boyunca mikrotüp ve daha sonra 10 dakika için sonikasyon. </li></ol></li><li> Dış bir sulu çözelti hazırlayın. <ol><li> Tris-tamponlu bir çözelti, 10 ml hazırlanmasından sonra (0.1 M Tris-HCI [pH 7.5], 0.15 M glukozitOSE) iç sulu ortam ile aynı prosedürde, mikrotüp kapaklı 1.5 ml çözeltinin 1 mi yerleştirin. Vorteks 30 saniye boyunca mikrotüp ve daha sonra 10 dakika için sonikasyon. </li></ol></li><li> Mikro küreleri içeren w / o emülsiyonu hazırlayın. <ol><li> 1.5 ml&#39;lik bir mikrotüp iç sulu çözelti 300 ul yağ çözeltisi (sıvı parafin ihtiva eden DOPC ve Texas Kırmızı DHPE) 1 ml karıştırın. </li><li> mekanik homojenleştirici (yüksek hızda dönerler bıçaklı bir karıştırıcı) kullanılarak mikrotüp iki bileşeni emülsifiye oda sıcaklığında 2 dakika için 10,000 rpm&#39;de çalıştırılan. </li></ol></li><li> GV hızlandırabilir. <ol><li> Yavaşça mikrotüp kapaklı 1.5 ml, 4 ° C de, dış sulu çözelti, 1 ml üst yüzeyinde s / y emülsiyonunun 300 ul tabaka. 4 ° C&#39;de 10 dakika süre ile, mikrotüpü Chill. </li></ol></li><li> GV toplayın. <ol><li> Hemen mikrotüp ürpertici sonra,30 dakika süre ile 18,000 x g de santrifüjlenir. Bir raptiye ile mikrotüp alt piercing ve sterilize 1.5 ml mikrotüp bir damlacık toplayarak çöktürülmüş Gvs elde edin. </li><li> Elde edilen GV gözlem zorlaştırmak için yeterince büyük miktarlarda elde edilmesi durumunda seyreltilir çökelen GV dış sulu çözeltisi ile hacim olarak 10-100 misli damlacıklara bölünür. </li></ol></li></ol> GVs 2. Mikroskopi Gözlem <ol><li> Mikroskopi numune hazırlamak. <ol><li> Bir mikroskop kapak cam üstüne yerinde polimeraz zincir reaksiyonu ve melezleme (kamara boyutu kalınlığında 9 mm x 9 mm x 0.3 mm) bir yapıştırıcı kuluçka odasına yerleştirin. </li><li> bir mikropipet kullanarak, seyreltilmiş mevduat 25 ul numune alan üzerinde Gvs çöktürülmüş ve hemen kuluçka odasının üstüne başka cam kapak (yaklaşık 0,15 mm kalınlığında) yerleştirin. </li></ol></li><li> Kayıt diferansiyel girişim contrasGVs t mikroskobu görüntüleri. <ol><li> Bir 12V100WHAL-L halojen lambası ile donatılmış bir mikroskop (10X, 20X ve 40X hedefleri) ile veziküllerin rekor mikroskobu görüntüleri. </li></ol></li><li> Floresan mikroskobu incelemelerde bulunmak. <ol><li> mikroskop içine U-FBNA ve U-FMCHE floresan ayna birimleri yerleştirin. ve sırasıyla, 510-550 nm ve 600-690 nm ışık iletimi radyasyon filtreleri 470-495 nm ve 565-585 nm eksitasyon filtreleri üniteleri yerleştirin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLuisi%2C+PL+%22The+emergence+of+life%3A+from+chemical+origins+to+synthetic+biology%22">The emergence of life: from chemical origins to synthetic biology</a>. , Cambridge University Press. (2006).</li>
<li>Luisi, P. L., Stano, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLuisi%2C+PL+%22The+minimal+cell%3A+the+biophysics+of+cell+compartment+and+the+origin+of+cell%22">The minimal cell: the biophysics of cell compartment and the origin of cell</a>. , Springer. (2011).</li>
<li>Rasmussen, S., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRasmussen%2C+S+%22Protocells%3A+Bridging+nonliving+and+living+matter%22">Protocells: Bridging nonliving and living matter</a>. , The MIT Press. (2008).</li>
<li>Luisi, P. L., Walde, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLuisi%2C+PL+%22Giant+vesicles%3A+perspectives+in+supramolecular+chemistry%22">Giant vesicles: perspectives in supramolecular chemistry</a>. , Wiley-Interscience. (2000).</li>
<li>Kita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+genetic+information+with+self-encoded+replicase+in+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Replication of genetic information with self-encoded replicase in liposomes.</a> Chem Bio Chem. 9 (15), 2403-2410 (2008).</li>
<li>Nomura, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+within+cell-sized+lipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Gene expression within cell-sized lipid vesicles.</a> Chem Bio Chem. 4 (11), 1172-1175 (2003).</li>
<li>Oberholzer, T., Albrizio, M., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction+in+liposome%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction in liposome.</a> Chem Biol. 2 (10), 677-682 (1995).</li>
<li>Shohda, K., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2011/sm/c0sm01463j#!divAbstract">Compartment size dependence of performance of polymerase chain reaction inside giant vesicle.</a> Soft Matter. 7 (8), 3750-3753 (2011).</li>
<li>Kurihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-reproduction+of+supramolecular+giant+vesicles+combined+with+the+amplification+of+encapsulated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA.</a> Nat Chem. 3 (10), 775-781 (2011).</li>
<li>Kurihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recursive+vesicle-based+model+protocell+with+a+primitive+model+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">A recursive vesicle-based model protocell with a primitive model cell cycle.</a> Nat Comm. 6, 8352(2015).</li>
<li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+vesicles%3A+preparations+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Giant vesicles: preparations and applications.</a> Chem Bio Chem. 11 (7), 848-865 (2010).</li>
<li>Reeves, J. P., Dowben, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+properties+of+thin-walled+phospholipid+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Formation and properties of thin-walled phospholipid Vesicles.</a> J Cell Physiol. 73 (1), 49-60 (1969).</li>
<li>Needham, D., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanical+properties+of+giant+lipid+%28DMPC%29+vesicle+bilayers+from+20+%C2%B0C+below+to+10+%C2%B0C+above+the+liquid+crystal-crystalline+phase+transition+at+24+%C2%B0C%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanical properties of giant lipid (DMPC) vesicle bilayers from 20 °C below to 10 °C above the liquid crystal-crystalline phase transition at 24 °C.</a> Biochemistry. 27 (21), 8261-8269 (1988).</li>
<li>Oku, N., MacDonald, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+alkali+metal+chlorides+on+formation+of+giant+liposomes+by+freezing+and+thawing+and+by+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Differential effects of alkali metal chlorides on formation of giant liposomes by freezing and thawing and by dialysis.</a> Biochemistry. 22 (4), 855-863 (1983).</li>
<li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/1986/DC/dc9868100303#!divAbstract">Liposome electroformation.</a> Far Disc Chem Soc. 81, 303-311 (1986).</li>
<li>Dimitrov, D. S., Angelova, M. I. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/chapter/10.1007%2F3-798-50724-4_62">Lipid swelling and liposome formation on solid surfaces in external electric fields.</a> New Trends Coll Sci. 73, 48-56 (1987).</li>
<li>Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja074029f">Formation of giant lipid vesicle like compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow.</a> J Am Chem Soc. 129 (42), 12608-12609 (2007).</li>
<li>Stachowiak, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilamellar+vesicle+formation+and+encapsulation+by+microfluidic+jetting%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (12), 4697-4702 (2008).</li>
<li>Ellis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+crowding%3A+obvious+but+underappreciated%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Macromolecular crowding: obvious but underappreciated.</a> Trends Biochem Sci. 26 (10), 597-604 (2001).</li>
<li>Ellis, R. J., Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v425/n6953/full/425027a.html">Cell biology: join the crowd.</a> Nature. 425 (6953), 27-28 (2003).</li>
<li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/la026100v">Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li>
<li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.pnas.org/content/100/19/10718.abstract">Engineering asymmetric vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (19), 10718-10721 (2003).</li>
<li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+analysis+of+structural+properties+of+giant+liposomes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Population analysis of structural properties of giant liposomes by flow cytometry.</a> Langmuir. 25 (18), 10439-10443 (2009).</li>
<li>Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+lamellarity+of+giant+liposomes+prepared+by+the+inverted+emulsion+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method.</a> Biophys J. 107 (2), 346-354 (2014).</li>
<li>Cabré, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+division+proteins+FtsZ+and+ZipA+induce+vesicle+shrinkage+and+cell+membrane+invagination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Bacterial division proteins FtsZ and ZipA induce vesicle shrinkage and cell membrane invagination.</a> J Biol Chem. 288, 26625-26634 (2013).</li>
<li>Osawa, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+division+by+a+simple+bacterial+division+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Liposome division by a simple bacterial division machinery.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (27), 11000-11004 (2013).</li>
<li>Hayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+morphological+control+of+tubulin-encapsulating+giant+liposomes+by+hydrostatic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Reversible morphological control of tubulin-encapsulating giant liposomes by hydrostatic pressure.</a> Langmuir. 32 (15), 3794-3802 (2016).</li>
<li>Terasawa, H., Nishimura, K., Suzuki, H., Matsuura, T., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+the+fusion+and+budding+of+giant+phospholipid+vesicles+containing+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Coupling of the fusion and budding of giant phospholipid vesicles containing macromolecules.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (16), 5942-5947 (2012).</li>
<li>Natsume, Y., Toyota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetrical+polyhedral+configuration+of+giant+vesicles+induced+by+orderly+array+of+encapsulated+colloidal+particles%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Asymmetrical polyhedral configuration of giant vesicles induced by orderly array of encapsulated colloidal particles.</a> PLOS ONE. 11 (1), e0146683(2016).</li>
<li>Natsume, Y., Toyota, T. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/303780392_Appearance_of_Crystalline_Pattern_for_Colloidal_Particles_Encapsulated_in_Giant_Vesicles_-Direct_Cross-sectional_Observation_of_Ordered_and_Disordered_Phases-">Appearance of crystalline pattern for colloidal particles encapsulated in giant vesicles: direct cross-sectional observation of ordered and disordered phases.</a> Trans Mater Res Soc Jpn. 41 (2), 147-149 (2016).</li>
<li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li>
<li>Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Kazuta, Y., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evolution+of+%CE%B1-hemolysin+using+a+liposome+display%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In vitro evolution of α-hemolysin using a liposome display.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (42), 16796-16801 (2013).</li>
<li>Whittenton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+asymmetric+liposomal+nanoparticles+for+encapsulation+of+polynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides.</a> Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).</li>
<li>Natsume, Y., Toyota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+vesicles+containing+microspheres+with+high+volume+fraction+prepared+by+water-in-oil+emulsion+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Giant vesicles containing microspheres with high volume fraction prepared by water-in-oil emulsion centrifugation.</a> Chem Lett. 42 (3), 295-297 (2013).</li>
<li>Pontani, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+an+actin+cortex+inside+a+liposome%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of an actin cortex inside a liposome.</a> Biophys J. 96 (1), 192-198 (2009).</li>
<li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+inside+giant+unilamellar+vesicles+analyzed+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry.</a> Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).</li>
<li>Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Nishikawa, T., Kazuta, Y., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+display+for+in+vitro+selection+and+evolution+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoco%22%5BJournal%5D)">Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins.</a> Nat Protoco. 9 (7), 1578-1591 (2014).</li>
<li>Hamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+asymmetric+cell-sized+lipid+vesicles+from+lipid-coated+water-in-oil+microdroplets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Construction of asymmetric cell-sized lipid vesicles from lipid-coated water-in-oil microdroplets.</a> J Phys Chem B. 112 (47), 14678-14681 (2008).</li>
<li>Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+characterization+of+liposome-encapsulated+plasmid+DNA+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery.</a> Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).</li>
<li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+tracking+of+a+minimum+gene+expression+system+reconstituted+in+giant+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Time-resolved tracking of a minimum gene expression system reconstituted in giant liposomes.</a> ChemBioChem. 10 (10), 1640-1643 (2009).</li>
<li>Yanagisawa, M., Iwamoto, M., Kato, A., Yoshikawa, K., Oiki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+reconstitution+of+a+membrane+protein+in+a+giant+unilamellar+vesicle%3A+experimental+verification+with+the+potassium+channel+KcsA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Oriented reconstitution of a membrane protein in a giant unilamellar vesicle: experimental verification with the potassium channel KcsA.</a> J Am Chem Soc. 133 (30), 11774-11779 (2011).</li>
<li>Saito, A. C., Ogura, T., Fujiwara, K., Murata, S., Nomura, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+micrometer-sized+artificial+objects+into+live+cells%3A+a+method+for+cell-giant+unilamellar+vesicle+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Introducing micrometer-sized artificial objects into live cells: a method for cell-giant unilamellar vesicle electrofusion.</a> PLOS ONE. 9 (9), e106853(2014).</li>
<li>Murata, S., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Hagiya, M. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s00354-012-0121-z">Molecular robotics: a new paradigm for artifacts.</a> New Gener Comput. 31 (1), 27-45 (2013).</li>
<li>Hagiya, M., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Murata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+robots+with+sensors+and+intelligence%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular robots with sensors and intelligence.</a> Acc Chem Res. 47 (6), 1681-1690 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

<html> İç sulu bir dispersiyon ortamı ve dış sulu çözelti Özgül ağırlıklar dikkatle seçilmelidir. s / y emülsiyonu santrifüj sırasında dış sulu çözelti içine çökmesi için, bir iç sulu dispersiyon ortamının belirli özgül ağırlığı, dış sulu solüsyon daha büyük olması gerekir. Biz şeker olmadan iç ve dış çözümleri kullanılarak Gvs hazırlamak için çalıştı, ama iç sulu çözelti iki faz arasındaki paraziti geçmeye yeterli kütleye sahip değildi çünkü biz, bu koşullar altında hiçbir Gvs aldı. küçültmek veya yırtılması olabilir dış sulu çözelti içine çökelti iki çözümleri, GVs arasında büyük bir ozmotik basınç farkı varsa. Bu nedenle, iç ve GVs dışında ozmotik basıncı eşit olmalıdır. Bunu gerçekleştirmek için, dış sulu çözelti içinde çözünen olarak iç sulu dispersiyon ve glikoz bir çözünen olarak sukroz kullanılır; Her iki şekerler aynı konsantrasyonda edildi. Hem tuzP = &quot;xref&quot;&gt; 22 ve şeker 23, 35, 38 bu amaçlar için kullanılmaktadır, ancak bu daha az toksik ve tuz daha çözünür olduğu için, şeker, genellikle kullanılır. Çok fazla şeker ilave edilir Ancak, GVs kapak cam ve çöküşün alt ile temas edebilir. Bu kaçınmak için çeşitli stratejiler vardır. Bir strateji, GV, ılımlı koşullar altında çökeltilmesi için, iç ve dış sulu çözeltiler arasındaki yoğunluk farkı azaltmak için; özel olarak ise, çökeltilmiş GV dispersiyon yüzer kaldırma kuvveti sonucu kapak camı yapışma yoluyla veziküler kopma ihtimalini azaltmak için, iç sulu çözeltiye aynı olan bir çözelti ile değiştirilebilir. Başka bir strateji ince lipid filmine 29 kapak gözlük hem ön kaplama etmektir. emülsiyonun hazırlamayı ve kuluçka edilirönemli. Petrol çözeltisi hazırlamak için, sıvı parafin kullanılır. Madeni yağ 26, 31, 21 dodekan, 33 ve skualen 33, 39, genellikle bir çözücü yağ olarak kullanılır. Bu malzemeler, belirli yoğunluk, viskozite ve yüzey gerilimi değişiklik gösterdiğinden aynı santrifüj şartları 33 kullanıldığı zaman, veziküller farklı sayıda daha oluştururlar. Hedef özelliklere sahip veziküller elde etmek için, özgül ağırlığı ve iç ve dış sulu çözeltilerin viskozitesi ve yağ fazının santrifüj acceleration.For hazırlanmasını optimize esastır, inkübasyon yüksek sıcaklıkta ve kuru gerçekleşmelidir çevre bir kuluçka veya dehydrator gibi. Bu çalışmada, tamamen lipit molecules.In ilave çözmek için 80 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı sıvı parafin, emülsiyon olmalıdırgerekli ve o hazırlanan hemen sonra kararsız olduğu ve çünkü hemen santrifüj tabi olması gerektiği gibi sadece hazırlanacak damlacıkları kolayca birbirine kaynaştırmak w / o. Emülsiyon sonikasyon, vorteks veya dokunarak büyük miktarlarda elde edilebilir. Bununla birlikte, bir homojenleştirici kullanılarak yüksek viskozitede yağ içinde emülsiyon büyük miktarlarda hızlı hazırlanması ve daha kolay emülsiyon sağlar. Emülsiyon yumuşak ve hızlı bir şekilde ve 4 ° C&#39;de, sonra soğutulmuş dış sulu çözeltisi üzerine yerleştirilmiş olması da önemlidir. emülsifikasyon ve santrifüj ile süresini kısaltmak için, yağ dış sulu çözelti sistemi emülsiyonu üzerinde katmanlı önce önceden soğutulmuş edilebilir beyaz türbidite hızlı veya daha yavaş normalden daha mekanik görünür immediately.If tüm sistemi daha sonra santrifüj edilebilir homojenleştirici iyice temizlik deterjanları kaldırmak için durulanması gerekir. Buna ek olarak, emülsiyon haline getirilmesinden önce, yağ çözeltisi, bir iç sulu bir çözeltisi ve emülsiyon yapıcı R olmalıdırOda sıcaklığına eturned. Uygun merkezkaç ivme de önemlidir. 18,000 x g&#39;da santrifüjleme ile, yüksek bir konsantrasyonda kapsüllenmiş tek bir iç malzeme ile GVs hazırlamak mümkün. birden fazla malzeme kapsülleme gerekli olduğunda, santrifüj ivme azaltmak için daha iyidir. Örneğin, yedi bileşikleri içine alan bir aktin montaj sistemi en az 350 x g 35 santrifüjleme ile elde edildi. Santrifüj arzu olduğu durumlarda, GVs şeker konsantrasyonu ayarlanarak ya da kendi kütlesinin 38, 40, 41 etkisi altında emülsiyonun çökeltilmesiyle elde edilebilir. Burada bildirilen yöntem iki önemli sınırlamalar vardır. Weit tarafından işaret edildiği gibi bir GV zar içinde çözülmüş olabilir (bu durumda, parafin) petrol moleküllerz grubu 21. GV membran içine bir zar proteini yerleştirilmesi istendiğinde, protein üzerindeki eşlik eden yağ moleküllerinin dikkate alınmalıdır. diğer sınırlama hacim fraksiyonu çeşididir. Bu çalışmada, GVs mikrosfer hacmi fraksiyonları 4-30 Vol% arasında değişmektedir tahmin; birim fraksiyonlar GV hazırlanması için kullanılan iç sulu çözeltinin hacmi fraksiyonuna denk değildi. Bu mikroskop gözlem için yeterince yüksek bir hacim fraksiyonu en GVs içinde mikro-kapsüllenmesi için mümkün olmakla birlikte, bu yöntem, bir homojen hacim fraksiyonu dağılımı GVs hazırlanması için uygun değildir. Mikrosfer kesrinin dağılımı santrifüj 34 boyunca değişen bildirilmiştir. s / y emülsiyonu santrifiij yöntemi yaygın olarak kapsüllenmiş malzemeler içeren GVs oluşumu için kullanılır. Ancak, az sayıda rapor p nitelendirdilermikro malzemeleri 34, 42 encapsulating GVs onarımı. Son zamanlarda, bir kapsüllenmiş DNA, aygıtı veya bir Moleküler Device içeren moleküler robotlar, 44 43 inşa edilmiştir. bölmeli GV uygulamalar bu tür için ilk seçenektir; Bu nedenle, çok çeşitli yüzey işlevsellik manyetik mikro-küreler ve mikro-kapsüllenmesi için kullanılabilir bizim gibi teknikler, 44 yararlı olması beklenebilir.

<html> yapıcı, ya da sentetik biyoloji yaklaşımı yaşam arasındaki sınırı keşfetmek ve konuyu cansız için büyüleyici bir cadde. Hücre yaşam için gerekli asgari birim olduğundan şu anda anladığımız gibi çeşitli araştırmacılar, yapay hücrelerin içinde meydana gelen olaylar ele alınabilir ve böylece açıklık nihai hedefi, basit, iyi anlaşılmış kimyasallardan yapay hücreleri oluşturmak için çalıştılar hayatın kökeni ve canlı hücreler 1, 2, 3 temel fonksiyonları okuyor. Özellikle, 4 veziküller, amfifilik moleküllerden oluşan küresel microcompartments ve bu tür proteinlerin 5, 6 ve DNA 7, 8, 9 biyolojik moleküllerin kapsülleyen olanlass = &quot;xref&quot;&gt; 10, genellikle biyolojik membranların model olarak kullanılmıştır. Vesiküller, büyük (çapı &lt;1 um), veya dev (çapı&gt; 1 um) (&lt;100 nm arasında bir çapa sahip olarak tanımlanmıştır), küçük olarak sınıflandırılabilir. bu boyut, şekil ve yapıda canlı hücreler benzer çünkü Dev veziküller (GV) yaygın olarak incelenmiştir. GVs büyüklüğü nedeniyle, GV membran morfolojik değişiklikleri kolayca bir optik mikroskop altında, gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilir. GV hazırlanması için bir çok yöntem sıvı alımı yöntemi 12, 13, donma-çözülme yöntemi 14, electroformation yöntemi 15, 16 ve sıvısal cihaz yöntemi 17, 18 dahil olmak üzere, 11 bildirilmiştir. Bununla birlikte, kapsülleme proteinler ve diğer MACROMBu yöntemler vasıtasıyla yüksek konsantrasyonlarda GVs bölgesindeki olecules zordur. Özellikle, hücre 19, 20 içinde kalabalık bir ortamda taklit etmek için yeterli miktarda (20-30 hacim olarak%) biyolojik malzemelerin kapsüllenmesi için son derece zordur. GV anında Weitz ve çalışma arkadaşları, emülsiyon santrifügasyon yöntemi 21, 22 (w / o), bir su-içinde-yağ tesis oluşturmak. Bu yöntem, beş önemli özelliklere sahiptir. Bu yöntemle hazırlanan GVs düşük lameller 23, 24, çünkü İlk olarak, kendi membranlar kolayca deforme olabilir, böylece ince. FtsZ (bakteriyel hücre bölünmesi proteini), tübülin ve diğer makromoleküller tarafından uyarılan GV membran deformasyon, 27, 26, 25 28 incelenmiştir, ve polyhe gözlenen<html> mikro-29, 30 kapsüllenmesi ile indüklenen GV membran Dron benzeri deformasyon. İkinci olarak, zar proteinleri zorluk 31 ile de olsa, bu yöntemle, veziküler membran içine sokulabilir. Örneğin, Yomo grup membran proteini α-hemolizin 32 in vitro sentezini ve gözenek oluşturucu etkinliğini incelemek için bu yöntem kullanılır. Üçüncü olarak, iç ve dış broşür lipid bileşenleri, farklı 22 olan asimetrik GVs üretmek mümkündür. Örneğin, Whittenton ve diğ. negatif yüklü polinükleotidleri saklanması iç talimatında katyonik lipidler, ve dış broşürde nötr lipidler ile oluşturulan asimetrik GV toksisite ve nonspesifik hücresel alımı 33 azaltmak için. Dördüncü olarak, GVs içindeki maddelerin konsantrasyon ve hacim fraksiyonu nispeten yüksek olabilirs = &quot;xref&quot;&gt; 28, 34. Beşinci olarak, malzeme birden fazla türde 35 kapsüllenebilir. Örneğin, Nishimura ve diğ. GVs içine bir in vitro transkripsiyon-translasyon sistemi kapsüllenmiş ve GVs 36 olan yeşil flüoresan protein (GFP) ifade etmek için sistem kullanılır. Bu beş özellik emülsiyon santrifüj hücre taklit Gvs üretmek için vazgeçilmez bir yöntem w / o olun. Önceki çalışmada, santrifüj ile oluşturulan GVs nihai sulu çözeltinin 22 bazı içeren uzun 16 G, paslanmaz çelik bir iğne ile donatılmış bir şırınga vasıtasıyla toplanmıştır. deneyimsiz teknisyenleri elinde, bu toplama yöntemi kolayca yağ bazı GV kirlenmesine neden olabilir. Bu çalışmada,, Yomo grup 23, 37 tarafından geliştirilen s / y emülsiyonu santrifüj protokolü kullanılanbir delik de hazırlanmış olan santrifüj tüpünün tabanına açılan yoluyla hangi çökelmiş GVs toplanır. Biz hücre içi organellere boyutunda benzer 1.0 mikron mikroküreler, kapsülleme Gvs hazırladı. mikroküreler kullanımı bize onların hacim fraksiyonu hesaplayarak kendi konsantrasyonunu tahmin etmek izin verdi. Malzemeler yoğun şekilde paketlenmiş edildiği GVs hazırlanması için bir yöntemin oluşturulması yapay hücreleri oluşturmak için önemli bir adımdır. İç malzeme türleri için protokol yararını teyit etmek için, daha da GFP ve küçük bir suda çözünür floresan molekül (Uranine) GVs kapsüllenmiş edilebilir olduğunu göstermiştir.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > REAKTİFLER: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1,2-Dioleoil- sn -glisero-3-fosfokolin (DOPC)</td> <td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850375C</td><td>Veziküler membran molekülü</td></tr><tr><td>Texas Red 1,2-dihekzadekanoil-sn -glisero-3-fosfoetanolamin, trietilamonyum tuzu (Texas Red DHPE)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T1395MP</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 7.5)</td><td>Nippon Gene Co.</td><td>318-90225</td><td>Tampon çözelti</td></tr><tr><td>D (+) - Glikoz</td><td>Wako Saf Kimya Endüstrileri</td><td>049-31165</td><td>Dış su çözeltisi için</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Wako Saf Kimya Endüstrileri</td><td>196-00015</td><td>İç su çözeltisi için</td></tr><tr><td>Poliboncuk karboksilat mikroküreler 1.0 ve mikro; m</td><td>Polysciences</td><td>08226-15</td><td>Floresan olmayan, 2R = 1.0 &mikro; m</td></tr><tr><td>Floresbrit YG karboksilat mikroküreler 1.0 ve mikro; m</td><td>Polysciences</td><td>15702-10</td><td>Floresan, 2R = 1.0 &mikro; m</td></tr><tr><td>Floresbrit YG karboksilat mikrokürecikleri 0.10 ve mikro; m</td><td>Polysciences</td><td>16662-10</td><td>Floresan, 2R = 0.10 &mikro; m</td></tr><tr><td>Floresein sodyum tuzu (idrar)</td><td>Sigma Aldrich Japonya</td><td>F6377-100G</td><td></td></tr><tr><td>GFP standardı (rekombinant)</td><td>Vector Laboratories</td><td>MB-0752</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>EKİPMANLAR: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5427R</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5409000233</td><td>Santrifüj rotoru: FA-45-48-11</td></tr><tr><td>Physcotron</td><td>Microtec Co.</td><td>NS-310EIII</td><td>Kullanışlı mikrohomojenizatör</td></tr><tr><td>Jeneratör mili</td><td>Microtec Co.</td><td>NS-4</td><td>Homojenizatör ataşmanı</td></tr><tr><td>yerinde PCR ve hibridizasyon için Frame-Seal inkübasyon odaları</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>SLF0201</td><td>Hibridizasyon odası hacmi: 25 & mikro; L Oda boyutu: 9 ve kez; 9 & kez; </td></tr><tr><td>in situ PCR ve hibridizasyon için 0,3 mm Frame-Seal inkübasyon odaları</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>SLF0601</td><td>Hibridizasyon odası hacmi: 65 & mikro; L&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Oda boyutu: 15 ve kez; 15 & kez; Viskoz sıvı için 0,3 mm</td></tr><tr><td>Microman E</td><td>Gilson</td><td>FD10006</td><td>Pipeti. Bunu kullanarak sıvı parafin ölçtük.</td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Olympus Co.</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Ayna ünitesi</td><td>Olympus Co.</td><td>U-FBNA</td><td>Uyarma filtresi: 470 - 495 nm Emisyon filtresi: 510 - 550 nm</td></tr><tr><td>Ayna ünitesi</td><td>Olympus Co.</td><td>U-FMCHE</td><td>Uyarma filtresi: 565 - 585 nm Emisyon filtresi: 600 - 690 nm</td></tr></tbody></table>

bir su-içinde-yağ emülsiyonu santrifüj dev veziküller kapsüllenen mikrokürelerin hazırlanması

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

yapıcı biyoloji ve yapay bir yaşam oluşturmak için sentetik biyoloji yaklaşımı biyolojik veya biyolojik olmayan materyallerin aşağıdan yukarıya düzeneğini içerir. Bu tür yaklaşımlar yaşam ve cansız madde arasındaki sınırda araştırma önem aldık ve son yirmi yılda yapay hücreleri oluşturmak için kullanılır olmuştur. Özellikle, Dev veziküller (GV) çoğu zaman yapay hücre membran olarak kullanılmıştır. Bu yazıda, son derece yoğun biyomoleküllerin içeren hücrelerin bir model olarak oldukça dolu mikroküreler encapsulating GVs hazırlanmasını tarif etmektedir. GV basit bir su-içinde-yağ emülsiyonu santrifügasyon yöntemi ile hazırlanmıştır. Spesifik olarak, bir homojenleştirici malzeme kapsüllenecek ihtiva eden sulu bir çözelti ve çözünmüş fosfolipid ihtiva eden bir yağ emülsiyon haline getirmek için kullanılan ve elde edilen emülsiyon bir sulu çözeltinin yüzey dikkatle tabakalanmıştır. Tabakalı sistem, ardından t santrifüjlenmiştiro GV oluşturmak. Bu güçlü yöntem, küçük moleküllerden mikrosferler kadar maddeleri kapsüllemek için kullanılmıştır.

S / y emülsiyonu santrifiij yöntemi, Şekil 1 &#39;de fotografik ve şematik olarak gösterilmiştir. Şekil 1 &#39;de şematik bir görüntüsü Bu yöntemin başarısı en önemli belirleyicisi GVs santrifüj sırasında çökelmesi böylece iç sulu çözeltinin özgül ağırlığı, dış sulu çözeltisi daha büyük olması gerektiğini olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, su / yağ ara yüzeyinde bir lipid tek tabaka oluşumu emülsiyonu dış sulu çözeltisi üzerine yerleştirilmiş sonra sistemin 10 dakika için soğutulmuş gerektirir. W / O arayüzü boyunca emülsiyon damlacıklarının transferi ile GV formu için, iç ve dış sulu tabakalar ozmotik basınç aynı olması gerekir. Bir kontrol deneyinde olduğu gibi, işlem vasıtasıyla herhangi bir mikro küreleri içeren da hazırlanabilir GVs, Şekil 1 &#39;de gösterilen ve iç sulu çözelti olması dışında, 1.3 adımmikro-olmadan hazırlandı. Santrifüj işleminden sonra çökelen GVs toplanması, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Mikrotüp en altındaki yarı saydam faza ek olarak, aynı zamanda, dış sulu bir çözeltisi (Şekil 2a), beyaz bir bulanık ara faz görülmektedir. Alt faz GVS içerdiği oysa Bu ara aşama, mikroküreler ve petrol toplanmaları zengin oldu. Bu nedenle, bir iğnenin (Şekil 2b) ile mikrotüp alt delici sonra GVs büyük miktarda ihtiva sadece ilk damla (Şekil 2c) toplandı. En fazla iki damla toplanır emin olmak için önemlidir; Başka damla GVs daha düşük bir yoğunluğa neden olur mikrosferler ve lipid toplamalardan içerebilir. Elde edilen veziküllü dispersiyon genellikle GVs dışında kapsüllenmiş malzemeler ihtiva ofte GVs nedeniylesantrifüj sırasında n rüptürü. Sadece GV elde edilmesi için, diyaliz, jel filtrasyonu ya da floresans ile aktive edilen hücre gibi bir ayırma yöntemi kapsülleme malzemelerinin boyutları nedeniyle seçilmelidir sıralama. Çökelen GV kullanılacak olan amaç için Gerekirse, dış sulu çözelti ile seyreltilebilir. Bazı durumlarda, ara faz oluşan herhangi bir veziküller yağ ile bir arada tutulduğunu gösteren, tüpün altına uzatılabilir. Bu mikro-olmayan GV diferansiyel girişim mikroskopisi ve floresan mikroskobu görüntülerini elde (Şekil 3a, 3b) ve mikrosferler ile (Şekil 3C -3, f). Daha önceki raporlarda 23, 37 ile uyumlu olarak, düşük bir lameller olan GV eden protokol ile oluşturulmuştur. Kırmızı Fluores yayar Texas Red DHPE, konjuge Lipidlerbu vezikül oluşumu doğrudan ince zarın görselleştirme ile doğrulanabilir böylece artmasına neden olmuştur, kullanılmıştır. Elde 160 GV, 55 kapsüllü mikroküreler ve 105% 34 kapsül oranını veren boştu. Aşağıdaki yöntemi ile GVs mikrosfer hacmi fraksiyonu (j, hacimce%) belirlendi. Her GV birkaç yüz mikro küreler onlarca içerdiğinden, bir optik mikroskop altında mikro küreler sayımı zordur. Bu nedenle, manüel olarak floresans mikroskop altında sayıldı flüoresan mikro-küçük bir miktar ile nonfluorescent 1.0 um mikro küreler karıştırılır. Kapsüllenmiş mikro-sayısı (K), 20 el ile sayılmıştır flüoresan mikro-sayısı (n) çarpılmasıyla hesaplanmıştır (: floresan mikrosferler nonfluorescent 5 [h / h] &#39;ye oranı, orijinal 95 göre). Değeri66; sonra v mikro kürelerin hacmidir ve V ise, herbir GV hacmi Nv 100 / V olarak tahmin edilmiştir. N, N olduğu tahmini sayımı hatalara neden olur not edin ve φ hesaplanırken bu hatalar dikkate alınmalıdır. Φ değeri doğrudan 20 N olarak hesaplanmıştır N, tahmin edilen, ve bu da φ olasılık ile sonuçlanmıştır doğru gerçek değeri% 50 &lt;olduğunu gösterir. Aslında, N 20 N etrafında bir ölçüde dalgalanır, bu yüzden ben n hata olduğu, (n i ±) 20 olarak dikkate almak gerekir. Bu bir N olasılığı bir Poisson dağılımına dayanarak elde edilen% 50 den fazla olabilir ± sırayla i tahmin etmiştir. Biz buna bize 20 hesaplamak (n i ±) ve değerleri için izin, hangi i tahmin66; Bu 10 ve 15 um (Tablo 1) çapları GVs hatalarını sayma dahildir. Bu prosedüre göre, Şekil 3C&#39;de gösterildiği GV mikro-hacim oranı 11 ± 3 hacim% olarak tahmin edilmiştir. hesaplanan hacim fraksiyonu hassas% 10-30 idi. Bizim sonuçlarımız başarılı bir yüksek hacimli kısmını GVs 1 mikron mikroküreler kapsüllü olduğunu göstermektedir. Aynı dış sulu çözelti ve aynı protokol (Şekil 4) kullanılarak da 100 mol% DOPC GVs içine diğer malzemeleri saklanması başardık. Özel olarak, 0.1 um mikro küreler içeren GV 0.1 M Tris-HCl 1.0 mikron mikro küreler içeren GVs için tarif edilen protokol ile (pH 7.5), 0.15 M sukroz ve 0.5 hacim% flüoresan mikro küreleri içeren (bir Tris-tamponlu çözelti hazırlandı Şekil 4a). protokol açıklanan abov ardındanE, GFP (0.1 M Tris-HCI [pH 7.5], 0.15 M sukroz ve 100 ug / mL GFP Şekil 4b) ihtiva eden DOPC GV ve Uranine ihtiva GVs (0.1 M Tris-HCI [pH 7.5], 0.15 M sukroz, 30 uM Uranine Şekil 4c) de hazırlanmıştır. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> n </td><td> N </td><td> φ (10 um çapında) </td><td> φ (15 um çapında) </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 60 ± 20 </td><td> 6.0 ± 2.0 </td><td> 1.8 ± 0.6 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 80 ± 20 </td><td> 8.0 ± 2.0 </td><td> 2.4 ± 0.6 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 100 ± 20 </td><td> 10 ± 2 </td><td> 3.0 ± 0.6 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 120 ± 30 </td><td> 12 ± 4 </td><td> 3.6 ± 1.2 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 200 ± 32 </td><td> 20 ± 3 </td><td> 5.9 ± 0.9 </td></tr><tr><td> 20 </td><td> 400 ± 45 </td><td> 40 ± 5 </td><td> 12 ± 2 </td></tr><tr><td> 30 </td><td> 600 ± 55 </td><td> - </td><td> 18 ± 2 </td></tr><tr><td colspan="4"> metinde tarif edilen bir hatalar belirlendi; n = elle sayıldı mikro-sayısı; kapsüllü mikroküreler N = toplam sayısı. </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Mikrokürelerinin bir Sayıları ve Ses Kesirler (φ, hacimce%). metinde tarif edilen bir hatalar belirlendi; n = elle sayıldı mikro-sayısı; Kapsüllü mikroküreler N = toplam sayısı. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55282/55282fig1.jpg" /> Şekil 1: Akış Ch<html> sanat ve / W O Emülsiyon Santrifüj Yöntemi şematik tasviri. (A) DOPC ve Texas Kırmızı DHPE oluşan yağ çözeltisi: sıvı parafin (100 0.3 mol oranı). (B) Tris-HCI tamponu içinde sükroz ve mikro-oluşan iç sulu dispersiyon. (C) Tris-HCI tamponu içinde glikozdan oluşan dış sulu çözeltisi. (D), yağ çözeltisi, 1 ml ve iç sulu dispersiyon 300 ul karışımı. Bir homojenizer (10.000 rpm, 2 dakika) ile (E) Buharlaşma. (F) W / O emülsiyonu. Dış sulu çözelti, 1 ml emülsiyon 300 ul (g) Katmanlama. (H) çöktürülmüş GV hemen sonra santrifüj. (I) s / y emülsiyonu santrifügasyon yöntemi prensibi şematik olarak gösterilmesi. Siyah ok merkezkaç ivme yönünü gösterir..jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55282/55282fig2.jpg" /> Şekil 2: mikrotüp Piercing. (A) çöktürülmüş GV sadece (ayrıca Şekil 1 saat tasvir) santrifüj sonra. Kırmızı elips Çökelen GV dispersiyon damlacığı gösterir. Bir raptiye ile mikrotüp (b) Pirsing. GVS içeren pelet bir raptiye ile dibe yakın mikrotüp piercing ve delikten damlacıkları toplanmasıyla elde edilmiştir. Dış sulu çözelti ile seyreltilmiştir, Seyreltilmiş dispersiyonun (sarı ok ile belirtilen) tortulaşan GVs (c) Damlacık. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig2.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 3: GV Mikroskopi Görüntüler. Mikro-olmayan bir GV (a), farklılık belirleyici kontrast mikroskopi görüntüsü. GV çapı yaklaşık 10 um idi. Ölçek çubuğu 10 mikron =. Mikroküreler olmadan GV (b) Floresan mikroskobu görüntüsü. kırmızı floresans Texas Red DHPE tarafından yayılan edildi. Mikro küreleri içeren bir GV (c), farklılık belirleyici kontrast mikroskopi görüntüsü. Bir GV içindeki 1.0 um mikro küreler (YG karboksilat mikrosferler) (d) floresan mikroskobu görüntüsü. Sayılır flüoresan mikroküreler (n) sayısı, bir Poisson dağılımına göre hataları (i = 2) yaklaşık 6 idi. Sonra ((n i ±) N = 20) iç mikro kürelerin toplam sayısını tahmin 120 ± 40 idi. O hesaplanmıştırGV h mikrosferler hacmidir ve V GVs hacmi yaklaşık 11 ± 3 hacim olarak%, bir hacim fraksiyonu (φ = Nv 100 / V) de 1.0 um mikro küreler ihtiva etmiştir. Bir GV membran (e) floresan mikroskobu görüntüsü. kırmızı floresans Texas Red DHPE tarafından yayılan edildi. (F) paneller d ve e görüntülerin görüntü Birleştirilmiş. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55282/55282fig4.jpg" /> Şekil 4: Farklı Encapsulated Malzemelerle GVs Diferansiyel Girişim Kontrast ve Floresan Mikroskopi Görüntüler. Farklılık belirleyici kontrast mikroskobu (üst) ve floresan mikroskobu (alt) görüntüleri(A) 0.1 um mikro küreler, (B) GFP ve (c) Uranine ihtiva GVs. Ölçek çubukları 10 mikron =. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Yüksek oranda paketlenmiş mikrometre boyutunda bileşenler içeren dev kesecikler kullanışlı hücre modelleridir. Yağda su emülsiyonu santrifüjleme yöntemi, kapsüllenmiş malzemelerle dev veziküllerin hazırlanması için basit ve güçlü bir araçtır.

bir su-içinde-yağ emülsiyonu santrifüj Dev veziküller Kapsüllenen Mikrokürelerin hazırlanması

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Bu su-içinde-yağ emülsiyon santrifüjleme yönteminin genel amacı, kolayca ince tabakalı dev bir vezikül hazırlamaktır. Bu yöntem, dev bir veziküle dayalı yapay bir hücrenin oluşturulması gibi sentetik biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedüre başlamak için, kloroform içerisinde 25 millimolar DOPC stok çözeltisi ve sıfır nokta iki millimolar Texas Red DHPE stok çözeltisi hazırlayın.Ardından, DOPC ve Texas Red DHPE stok çözelti karışımını akan azot gazı altında buharlaştırarak beş mililitrelik bir cam şişenin iç yüzeyinde bir lipid film oluşturun. Filmi indirgenmiş basınç altında gece boyunca inkübe ettikten sonra, şişeye bir mililitre sıvı parafin ekleyin. Şişeyi alüminyum folyoyla sarın ve karışımı 80 °C'de gece boyunca inkübe edin.Kapaklı bir 1,5 mL mikrotüpte, 237,5 µL 1 µm non-floresan mikroküre ile 12,5 µL 1 µm floresan mikroküreyi karıştırın. Ardından mikrotübe 64 mg sükroz, ardından 125 µL 1 M Tris tamponlu çözelti ve 875 µL deiyonize su ekleyin. Karışımı 30 saniye boyunca vorteksleyin, ardından 10 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun.10 mililitre Tris tamponlu çözelti hazırlandıktan sonra, bir mililitresini kapaklı 1,5 mililitrelik bir mikrotüpe yerleştirin. Çözelti vortekslenip sonikasyona tabi tutulduğunda, bir mililitre yağ çözeltisini 1,5 mililitrelik bir mikrotüpte 300 mikrolitre iç sulu çözelti ile karıştırın. İki bileşeni, oda sıcaklığında iki dakika boyunca 10.000 rpm hızda çalışan mekanik bir homojenizatör kullanarak mikrotüp içinde emülsiye edin.Ardından, 1,5 mL kapaklı bir mikro tüp içinde, 4 °C'deki 1 mL dış sulu çözeltinin üst yüzeyine 300 µL su-içinde-yağ emülsiyonunu nazikçe katmanlar halinde ekleyin. Mikro tüpü 10 dakika soğuttuktan hemen sonra, karışımı 18.000 ×g'de 30 minutes boyunca santrifüjleyin. İşlem tamamlandığında, mikro tüpün altını bir raptiye ile delip tek bir damlayı sterilize edilmiş 1,5 mL'lik bir mikro tüpe toplayarak çöktürülmüş dev vezikülleri veya GV'leri elde edin.NC iki polimeraz zincir reaksiyonu ve hibridizasyon için kullanılan yapışkan bir inkübasyon odasını mikroskop lamelinin üzerine yerleştirin. Bir mikropipet kullanarak, seyreltilmiş çöktürülmüş GV'lerden 25 µL'yi numune alanına damlatın ve hemen inkübasyon odasının üzerine 0,15 mm kalınlığında bir lamel yerleştirin. Veziküllerin mikroskopi görüntüleri kaydedildikten sonra, önce UFBNA ve UFMCHE floresan ayna ünitelerini mikroskoba yerleştirerek floresan mikroskopisi gerçekleştirin.Ardından, analiz için birimleri eksitasyon filtreleri ve emisyon filtreleri ile donatın. Su-içinde-yağ yönteminin başarısının en önemli belirleyicisi, santrifüj sırasında GV'lerin çökelmesi için iç sulu çözeltinin özgül ağırlığının dış sulu çözeltinininkinden daha büyük olması gerektiğidir. Mikrosfer içermeyen ve mikrosfer içeren GV'lerin diferansiyel girişim mikroskobisi ve floresan mikroskobisi ile incelenmesi, düşük lamellariteye sahip GV'lerin oluştuğunu doğrulamıştır.Elde edilen 160 GV'den 55'i mikroküreleri kapsüllemişti ve 105'i boştu; bu da %34'lük bir enkapsülasyon oranı verdi. GV'lerdeki mikrokürelerin hacim oranının yaklaşık %11 ± 3 olduğu tahmin edildi ve hesaplanan hacim oranının hassasiyeti %10 ile %30 arasındaydı. Aynı dış sulu çözelti ve aynı protokol kullanılarak diğer maddelerin %100 mol yüzdesi DOPC GV'lere enkapsülasyonu, diferansiyel girişim mikroskobisi ve floresan mikroskobisi ile gösterildiği üzere başarılı olmuştur. Bu prosedürün ardından, modellenmiş hücrenin aydınlatılması gibi ek soruları yanıtlamak için akış sitometrisi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, enkapsüle edilmiş materyaller içeren dev veziküllerin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

preparation-giant-vesicles-encapsulating-microspheres-centrifugation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Hücre ve parçacıkların eylemsizlik sıralamayı kümil potasyum başlatıcısı varlığında damla nesil birleştirerek, biz kHz fiyatlara tek bir damla hücre veya parçacıkların İstediğiniz bir numarayı kapsüllemek için bir yöntem tarif. Biz iki kez tek ve çift-parçacık damla sırasız encapsulation geçecek verimlilik göstermektedir.

Yüksek Verim Micro-encapsulation Tek hücreli ve Çoklu-hücre

Bu protokol, homojen bir yüksek derecede mikronaltı boyutlarda lipid kesecikler hazırlanması için bir çekme yöntemi açıklar. Bu yöntem, lipozom preparatı için kontrollü bir nitrojen akışı hızları ile bir basınç kontrol sistemi kullanır. Lipid...

Nano ölçekli Lipid Vesiküller Hazırlanması için Sabit Basınç kontrollü Ekstrüzyon Yöntemi

Burada hedef lipid bilayers postfusion bilayer içine bu membran proteinlerinin deterjan ücretsiz teslim etmek için ile ultrafast protokollerinden membran proteinlerinin fusogenic proteoliposomes içine sulandırma ve böyle proteoliposomes füzyonu için mevcut. Bu yaklaşımlardan birleşimini karmaşık çok bileşenli Membran sistemleri hızlı ve kolayca kontrollü montaj sağlar.

Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine.

Biz bir teknik veziküller, temassız embriyolardan için yerelleştirilmiş kalsiyum iyon degradeler kullanarak mevcut. Bir dev lipid vezikül, çevresinde bir kalsiyum iyon eriyik mikroenjeksiyon membran borulu çıkıntılar üretiminde kaynaklanan lipit membran yeni model için kullanılmaktadır.

Yanıt olarak lokalize kalsiyum iyon degradeler dev veziküller membran Remodeling

Bu çalışmada nanopartikül karakterizasyonu takip nanoliposome hazırlık için ince lipid film yöntemi kullanılarak klasik hidrasyon açıklanır. A 47 kDa-hidrofilik ve küresel protein, tarin, başarıyla istikrarı artırmak için bir strateji olarak kapsüllenir, hızlı açıklık önlemek, ve kontrollü salınımı teşvik. Bu yöntem hidrofobik moleküllerkapsülasyonuna adapte edilebilir.

Biyoaktif Hidrofilik Globüler Proteinlerin Tuzakları Için Nanoliposomes Hazırlanması ve Karakterizasyonu

Protokolün amacı, dev veziküllerin membran mekanik özelliklerini mikropipet aspirasyonu ile güvenilir bir şekilde ölçmektir.

Dev Unilamellar Hibrid Veziküllerin Elektroformasyon ile Obtention ve Mikropipet Aspirasyon ile Mekanik Özelliklerinin Ölçümü

Bu makalede, kapsüllenmiş sitoiskelet proteinleri ile dev unilamellar veziküllerin hızlı üretimi için basit bir yöntem tanıtılmaktadır. Yöntemin, hapsetmede ve sitoiskelet-membran etkileşimlerinde sitoiskelet yapılarının aşağıdan yukarıya doğru resulaştırılmasında yararlı olduğu kanıtlanmıştır.

Yeniden Yapılandırılmış Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Hızlı Kapsüllenmesi

Bu yazıda, F-aktin sitoiskeletini dev unilamellar lipid veziküllerine (lipozomlar olarak da adlandırılır) kapsüllemek için deneysel teknikleri ve lipozom zarının iç broşüründe korteks-biyomimik yapan bir F-aktin tabakası oluşturma yöntemini göstereceğiz.

İn Vitro Aktin Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Yeniden Sulandırılması

Membran proteinlerinin yeniden yapılandırılması ve enzimlerin ve diğer suda çözünür bileşenlerin mikrometre altı ve mikrometre boyutundaki lipid veziküllerinde kapsüllenmesi için bir protokol sunuyoruz.

Nano ve Mikrometre Boyutlu Veziküllerde Denge Dışı Metabolik Ağların İnşası

Bu yeni başlayanlar kılavuzu, damlacık transfer yöntemi yoluyla Dev Tek Katmanlı Veziküllerin (GUV'ler) hazırlanması için genel bir protokol sunar, kritik adımları tartışır ve sentetik biyoloji ve mikrorobotik dahil olmak üzere farklı uygulamalar için gerekli olası ayarlamalara yardımcı olacak bilgiler sağlar.

Dev tek katmanlı vezikülleri güvenilir bir şekilde hazırlamak için damlacık transfer yöntemini kullanma

Bu makale, fazla ayrılmış dev veziküller içindeki hücre iskeleti ağlarının basit bir tek kap sulandırmasını tanıtmaktadır. Yöntem genelleştirilebilir ve çok çeşitli biyomoleküllerin kapsüllenmesi veya hapsedilmesi için uygulanabilir.

Laboratuvar ortamında Fazla Ayrılmış Dev Unilamellar Veziküller (GUV'ler) İçindeki Hücre İskeleti Ağlarının Sulandırılması

Öğrenin su-içinde-yağ emülsiyon santrifüj yöntemiyle dev veziküller hazırlamayı. Bu teknik, sentetik biyolojide yapay hücre oluşturma ve mikroküre kapsüllenmesi için kullanılır.

bir su-içinde-yağ emülsiyonu santrifüj Dev veziküller Kapsüllenen Mikrokürelerin hazırlanması

Daha fazla video keşfet