Kordalı embriyo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon Ciona intestinalis

Ciona embriyolarında geçici transfeksiyon tekniklerinin genel amacı, kordat omurgasızlarının kökenleri hakkında fikir edinmek için kurbağa yavrusu benzeri larvalar oluşturmak için gereken gen regülasyonunu ve işlevini, değişmez hücresel soylarından ve kompakt omurgasız genomundan yararlanarak incelemektir. Bu yöntem, kök hücre araştırmaları ve ilaç keşfi ile ilgili kordat geliştirme programının korunmuş mekanizmaları gibi moleküler genetik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, embriyo elektroporasyonu ile bir günde yüzlerce veya binlerce senkronize embriyoyu işleyebilmenizdir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişi, kırılgan embriyonun dekoryonasyonu nedeniyle ve etkili bir mikro enjeksiyon tekniği geliştirmek zor olduğu için mücadele edecektir. Ciona yetişkinlerini 18 santigrat derece soğutulmuş bir embriyo odasında diseksiyon yaparak başlayın. Sifonların karşı ucunda ve altında yumurta kanalı ve sperm kanalının bulunduğu daha kısa sifonun yanında bir kesi yapmak için küçük makas kullanın.

Yumurta kanalını ortaya çıkarmak için kesiği uzatın. Ardından, yumurta kanalında hassas bir kesi yapmak için makasın ucunu kullanın. Kapalı makasla yumurta kanalına hafifçe bastırın ve yumurtaları çıkarın.

Yumurtaların doğrudan HEPES ile yapay deniz suyu içeren altı oyuklu bir plakaya düşmesine izin verin. Kalan yumurtaları toplamak ve aktarmak için ASWH ile önceden durulanmış bir pastör pipeti kullanın. Sperm toplamak için sperm kanalını makasla kesin, ardından konsantre spermi toplamak için ayrı bir pastör pipeti kullanın ve 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde bir mililitre ASWH ve 50 mikrolitre Tris'i birleştirerek spermi aktive edin. Daha sonra 20 mikrolitre konsantre sperm ekleyin, kapağı kapatın ve tüpü ters çevirerek veya bir pastör pipeti kullanarak hafifçe karıştırın. Daha sonra, her bir yumurta oyuğuna 100 ila 200 mikrolitre aktive edilmiş sperm çözeltisi ekleyin ve yumurtaların ortamda yüzmesi için yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.

Zigotları toplayıp cam tüplere dağıtarak dekoryonasyona başlayın. El santrifüjü ile zigotları yaklaşık 20 saniye boyunca bin iki yüz kez G'de döndürün, ardından santrifüjü yavaşça durdurun. ASWH'yi bir pastör pipeti ile peletlerden çıkarın.

Her tüpteki pelete dört mililitre aktif dekoriyonasyon çözeltisi ekleyin. Küçük bir kauçuk armutla kaplanmış musluk suyuyla muamele edilmiş bir pastör pipeti kullanarak nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyerek zigotları askıya alın. Çözelti 1 ila 3 dakika sonra sarımsı hale gelmelidir.

Dekoryonasyon sırasında, pastör pipetini kullanarak dekoryonasyon süspansiyonunun küçük bir alikotunu çıkarın. Bir slaytın üzerine bir damla bırakın ve diseksiyon mikroskobu altında gözlemleyin. Zigot süspansiyonunu yukarı ve aşağı pipetleyin ve slaytı her 20 ila 30 saniyede bir kontrol edin.

Önce folikül hücreleri ayrılır, sonra koryon sararır ve opak olur ve son olarak zigotlardan ayrılır. Pembe dekoryonlu zigotlar cam tüpün dibine batacaktır. Zigotların% 50'sinden fazlası dekoryona uğradığında, tüpü ASWH ile doldurun.

Yaklaşık 10 ila 15 saniye boyunca çok nazikçe santrifüjleyin, sadece dekoryonlu zigotları çökeltmeye yetecek kadar. Santrifüjü yavaşça durdurun. Yüzen herhangi bir malzeme de dahil olmak üzere cam tüpteki neredeyse tüm sıvıyı çıkarın ve ASWH ile değiştirin.

Yıkamak için yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin ve ardından daha önce olduğu gibi nazikçe santrifüjleyin. Koryon kalıntısı kalmayana kadar tekrar yıkayın. Yerçekimi tortusu, silikonize 1.5 mililitrelik tüplerde dekoryonlu zigotlara yıkama.

Sedimantasyondan sonra, ASWH'yi tüp üzerindeki 100 mikrolitre işaretine kadar çıkarın. Şimdi bir pastör pipeti kullanarak mannitol çözeltisinde önceden hazırlanmış 250 mikrolitre DNA'yı bir tüp zigota ekleyin. Yavaşça karıştırın ve karışımı hemen dört milimetrelik bir elektroporasyon küvetine aktarın.

Küveti elektroporasyon tutucusuna yerleştirin ve 50 voltta 16 milisaniyelik tek bir darbe verin. Daha sonra aynı pastör pipetini kullanarak zigotları küvetten çıkarın ve taze, filtrelenmiş ASWH içeren bir kültür kabına atın. Zigotları yaymak için tabağı çalkalayın.

Pipeti bir ASWH kabında durulayın ve ardından bir sonraki örneğe geçin. Tüm zigotları elekrokroden ettikten sonra, zigotları 15 ila 20 santigrat derecede kültürleyin. Mikro manipülatörü 18 santigrat derece soğutulmuş bir odaya kurun.

Plastik boruyu ve iğne tutucuyu mineral yağ ile doldurulmuş 10 mililitrelik bir cam şırıngaya bağlayın. Boruyu ve iğne tutucuyu yağla doldurun ve hava kabarcıklarını dışarı atın. Enjeksiyon iğnesini, iğne tutucusuna yeşil hayati boya ile 0,5 mikrolitre enjeksiyon çözeltisi ekleyin.

Ve tutucuyu mikro manipülatörün üzerine yerleştirin. İğne tutucuyu, yüzeye göre 45 derecelik bir açıyla düz bir çizgi boyunca hareket edecek şekilde ayarlayın. Dekoryonlu yumurtaları küçük bir agaroz kaplı kültür kabına bir girinti boyunca yönlendirin, böylece yumurtalar diseksiyon mikroskobu altında tek tek enjekte edilebilir.

Gerekirse, iğneyi agaroz üzerine yerleştirilmiş bir cam kapak kızağına hafifçe iterek iğne ucunu kırın. İğne ucunun açık olduğunu doğrulamak için hafif bir baskı uygulayın. Döllenmemiş yumurtaları tek tek enjekte edin, önce iğneyi yumurtanın içine sokun ve yumurta zarını kırmak için hafifçe aspire edin.

Ardından, yeşil enjeksiyon solüsyonunu yumurtanın ortasına, hücre çapının en fazla üçte birine kadar enjekte edin. Tüm yumurtaları enjekte ettikten sonra iğneyi çıkarın, enjekte edilmiş, döllenmemiş yumurtaları taze bir kültür kabına aktarın ve döllenene kadar 15 ila 18 santigrat derecede inkübe edin. Ciona intestinalis miyelin transkripsiyon faktörünün veya MyT'nin Ciona embriyolarının gastrula aşamasında düzenlenmesini incelemek için mikro enjeksiyon kullanıldı.

İnsitu hibridizasyon ile izlenen endojen ekspresyon, vahşi tipte altıncı sıra nöral plaka öncülerinde gözlenir. Bir transkripsiyon faktörü olan Forkhead box A gibi erken embriyonik faktörleri yıkmak için morfolinoların mikro enjeksiyonu, genel MyT ekspresyonunu ortadan kaldırır. Tersine, MyT ekspresyonu, nodalın aşağı regülasyonu üzerine ektopik olarak aktive edilir, bu da nodalın normalde bu lateral sinir kordonu öncülerinde MyT ekspresyonunu baskıladığını düşündürür.

Transkripsiyon faktörü GATAa, bir Venüs etiketi ile etiketlendi ve bir pfog sürücüsü ile ektodermal blastomerlere elektropore edildi. Burada görüldüğü gibi, GATAa, bir transkripsiyon faktörü için beklendiği gibi, çoğunlukla çekirdeklere lokalizedir. Oysa Venüs ifadesi her yerdedir.

Bu videoyu izledikten sonra, senkronize Ciona zigotlarına elektroporasyon yoluyla geçici transfeksiyonun nasıl yapılacağını, kırılgan dekoryonlu embriyoların nasıl ele alınacağını ve doğru mikro enjeksiyon açısının nasıl bulunacağını iyi anlamış olmalısınız. Geliştirildikten sonra, bu teknikler fonksiyonel genomiklere giden yolu açmıştır. Gen fonksiyonunu, gen düzenleyici ağları keşfetmek ve insanlarda da doku oluşumu için önemli olan gelişimsel modülleri korumak.