Bir Geçirgen Membran Ekle tabanlı Enfeksiyon Sisteminin Uygulanması memeli konakçı hücreleri üzerinde salgılanan Bakteriyel Toksinler Etkilerinin Eğitim için

Bu geçirgen membran eki tabanlı enfeksiyon sisteminin genel amacı, salgılanan bakteri toksinlerinin enfeksiyon sırasında konakçı hücreler üzerindeki etkilerini incelemektir. Bu yöntem, spesifik salgılanan bakteriyel bileşenlerin bakteriyel enfeksiyon sırasında konak hücre tepkilerine nasıl katkıda bulunduğu gibi konakçı-patojen etkileşimleri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, salgılanan bakteri bileşenlerinin incelenmesine izin vermesi ve insan enfeksiyonu bağlamında fizyolojik olarak ilgili bir konakçı-patojen ortamını daha yakından modellemesidir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan son sınıf bir yüksek lisans öğrencisi olan Rebecca Flaherty olacak. İzojenik yabani tip A grubu streptokok veya GAS ve GAS M1T1 5448 mutant suşları hazırlamak için, beş ila 10 mililitre Todd Hewitt suyu aşılayarak ve 37 santigrat derecede 16 saat inkübe ederek gece boyunca sıvı kültürlere başlayın. Gece boyunca bakteri kültürlerini santrifüjleyin ve peleti yeniden süspanse etmek için orijinal hacimdeki taze bakteri ortamını kullanın.

Daha sonra, aynı OD600'e ulaşmak için yeniden süspanse edilmiş kültürleri ek ortamda seyrelterek bakteri kültürlerini eşit başlangıç konsantrasyonlarına normalleştirin. Sinyalizasyon analizi ve ATP belirleme tahlillerini gerçekleştirmek için lizatları toplamak için, HaCaT hücrelerini altı oyuklu tabaklarda oyuk başına yaklaşık üç kez 10 ila beşinci hücre oturma yoğunluğunda plakalayın ve %90'a kadar birleşene kadar kültürleyin. Etidyum homodimer membran geçirgenliği ve laktat dehidrojenaz salım deneylerini gerçekleştirmek için, HaCaT hücrelerini 24 oyuklu tabaklarda oyuk başına yaklaşık beş kez 10 ila dördüncü hücre oturma yoğunluğunda kaplayın ve %90 birleşmeye kadar büyütün.

Tedaviden hemen önce, hücreleri yıkamak için 1x PBS kullanın. Daha sonra, altı oyuklu plakalara farmakolojik tedavi olsun veya olmasın iki mililitre taze büyüme ortamı veya 24 oyuklu plakaların kuyucuklarına 0,5 mililitre ortam uygulayın. Daha sonra, laminer bir akış başlığı altında, her bir oyuğa steril bir 0.4 mikron geçirgen membran ekini dikkatlice yerleştirmek için steril forseps kullanın.

Enfeksiyon hazırlığı sırasında geçirgen eklerin nazik ve steril bir şekilde kullanılması, bu işlem sırasında membranın tehlikeye girmesini veya kontamine olmasını önlemek için kritik öneme sahiptir. Üreticinin talimatlarına göre her bir oyuğun üst odasına taze hücre kültürleri ortamı uygulayın. Daha sonra, geçirgen membran yerleştirme sisteminin üst odasına uygun bir hacimde normalleştirilmiş bakteri kültürü uygulayın ve kontrol kuyularına bakteri ortamı uygulayın.

Bakterilerin üst odaya dikkatli bir şekilde eklenmesi ve enfekte olmuş hücrelerin inkübatöre nazikçe taşınması kritik öneme sahiptir, çünkü deney düzeneği sırasında bakterilerin alt odayı kontamine etmemesi esastır. Salgılanan konak proteinlerini değerlendirmek için, geçirgen membran ekini dikkatlice çıkarmak için steril forseps kullanın. Daha sonra, hücrelerin tek tabakasını rahatsız etmeden, ortamı alt odadan 1.5 mililitrelik tüplere toplayın.

Hücresel kalıntıları peletlemek için numuneleri 14.000 RCF'de ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatantın 50 mikrolitresi hariç hepsini çıkarın, 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın veya hemen kullanın. Konak hücre lizatlarının değerlendirilmesi için, konakçı hücreleri rahatsız etmeden ortamı tek tabakanın üzerine nazikçe aspire edin.

Ardından, hücreleri bir kez durulamak için PBS kullanın. PBS'yi nazikçe aspire edin ve örneğin mililitre başına 0.5 ila 1.5 miligramlık bir protein konsantrasyonu elde etmek için hemen bir miktar buz gibi soğuk lizis tamponu uygulayın. Ardından, numuneleri 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Daha sonra, hücreleri her bir oyuğun plaka yüzeyinden ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın ve her bir oluğun tüm içeriğini 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Ardından, numuneleri 14.000 RCF'de ve 20 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin. Çözünür listat bileşenlerini değerlendirmek için, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın veya hemen kullanın.

Nükleer veya diğer çözünmeyen lizat bileşenlerini değerlendirmek için peleti ayırın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın veya hemen kullanın. İmmünofloresan görüntüleme ile değerlendirme için, ortamı aspire edin ve hücreleri yıkamak için 1x soğuk PBS kullanın. Ardından, %4 PFA ve PBS ile hücreleri gece boyunca sabitleyin.

Metin protokolüne göre daha fazla analiz yapın. Burada gösterilen western blot verileri, streptolizin S veya SLS üreten gaz suşlarının varlığında önemli ölçüde artmış p38 MAP kinaz aktivasyonu ve keratinositleri gösterir, bu da bu sistemin temastan bağımsız konak sinyal proteinlerinin aktivasyonundaki değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabileceğini gösterir. Bu şekilde, aktivasyon üzerine sitoplazmadan çekirdeğe yer değiştiren anahtar inflamatuar mediatör nükleer faktör-kappa B'nin SLS'ye bağlı aktivasyonu gösterilmiştir, bu da bu sistemin salgılanan bakteriyel faktörlerin immünofloresan mikroskobu yaklaşımları kullanılarak konakçı protein yanıtları üzerindeki etkilerini görselleştirmek için kullanılabileceğini göstermektedir.

Burada, enfekte olmamış hücrelere veya SLS eksikliği olan bir suşa maruz kalan hücrelere kıyasla, SLS üreten gaz suşlarına maruz kaldıktan sonra hem membran geçirgenliğinde hem de konakçı hücrelerden LDH salınımında önemli artışlar gösterilmiştir. Bu sonuçlar, bu sistemin konak sitotoksisitesindeki toksine bağlı değişiklikleri değerlendirebileceğini göstermektedir. Bu deneyde, keratinositlerdeki ATP düzeyleri ve gaz enfeksiyonuna yanıt belirlendi.

Enfeksiyondan 16 saat sonra, ATP'de önemli bir azalma gözlendi ve ATP kaybı, SLS varlığında daha belirgindi, bu da konakçı stres yanıtı sinyali ve toksisitesindeki toksine bağlı artışlarla tutarlıydı. Bir kez kurulduktan sonra, bu teknik, çeşitli konakçı hücre tipleri üzerinde salgılanan herhangi bir mikrobiyal faktörün spesifik tepkilerini incelemek için kullanılabilir. Bu prosedürü uygularken, deney kurulum adımları boyunca steril tekniği uygulamak ve hem ilk kurulum sırasında hem de numune toplama sırasında geçirgen membran eklerinin dikkatli bir şekilde kullanılmasını sağlamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, ilgilenilen bakteri faktörünün sinyal kaskadlarındaki değişikliklere nasıl katkıda bulunduğunu ve enfeksiyon sırasında genel sitotoksisiteyi nasıl etkilediğini belirlemek için western blotlama, immünofloresan görüntüleme ve membran geçirgenlik testleri gibi yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, belirli bir salgılanan bakteri faktörüne maruz kaldıktan sonra çeşitli konak hücre tepkilerinin değerlendirilmesi için konak hücre örneklerinin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Bakteriyel patojenler gibi biyolojik olarak tehlikeli maddelerin kullanılmasının belirli güvenlik hususları gerektirdiğini unutmayın.

Bu deneylerin güvenli bir şekilde gerçekleştirilmesi için koruyucu gözlüklerin, eldivenlerin ve laboratuvar önlüklerinin uygun kullanımı ile birlikte bir biyogüvenlik başlığının uygun kullanımı gereklidir.