Tümör mikroçevresinin A Mimik: Hücreler arası İletişim Zenginleştirilmiş hücre popülasyonları oluşturma ve incelenmesi için Basit Bir Yöntem

Bu basit in vitro kokültür modelinin genel amacı, bir in vivo tümör mikro ortamının özelliklerini taklit etmek, bireysel hücre popülasyonlarını zenginleştirmek ve çeşitli hücreler arası iletişim modlarını araştırmaktır. Bu yöntem, kanser ve radyobiyoloji alanlarında, özellikle kanserle ilişkili fibroblastların oluşumunun altında yatan faktörler ve terapötik ajanlara verilen yanıtlar ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, strese neden olan floresan etiketleme veya hücre sıralama olmadan karışık bir hücre kültüründen bireysel hücre popülasyonlarının oluşturulmasına izin vermesidir.

İlgilenilen hücre kültürünü beş mililitre PBS ile iki kez yıkayarak başlayın. İkinci yıkamadan sonra, hücreleri bir mililitre oda sıcaklığında tripsin-EDTA ile oda sıcaklığında iki dakika boyunca ayırın. Daha sonra reaksiyonu dokuz mililitre tam büyüme ortamı ile söndürün, hücreleri ayırmak için ortamı şişenin yüzeyine 10 kez hafifçe pipetleyin.

Saydıktan sonra, hücreleri taze ortamda mililitre konsantrasyonda 2.5 kez 10 ila beşinci hücreye seyreltin ve hücreleri steril bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri santrifüjleme ile döndürün ve peleti, 70 mikrolitre orta konsantrasyon başına 2.5 kez 10 ila beşinci hücrelerde% 50 fetal sığır serumu ile desteklenmiş taze büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, uygun deneysel gözenek boyutuna sahip ekleri ambalajlarından çok kuyulu bir tabağın ayrı kuyucuklarına aktarın ve tabağı örtün.

Ardından tabağı iki elinizle tutarak, ek alt kısımlar yukarı bakacak şekilde tabağı hafifçe ters çevirin. Yemeğin altını çıkarın. Bir elinizde steril forseps kullanarak, bir parçayı yerinde tutun ve diğer elinizle 70 mikrolitre hücreyi bir mikropipet ucuna yavaşça aspire edin.

Ardından, hücreleri şu anda ekin üst tarafı olan yüzeyin yüzeyine yavaşça dağıtın. Eklerin her birini tohumladıktan sonra, kabın tabanını dikkatlice değiştirin ve ters çevrilmiş kabı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 30 ila 45 dakika nem altında inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, laminer akışlı bir biyolojik güvenlik kabininde, çanağı, eklerin alt kısımları şimdi aşağı bakacak şekilde dikkatlice yeniden ters çevirin.

Ardından, her bir parçanın altını yavaşça ve dikkatlice iki mililitre önceden ısıtılmış tam ortama daldırın ve tabağı tekrar nemlendirilmiş inkübatöre yerleştirin. 48 saat sonra, her bir kuyucuğun dibindeki ortamı iki mililitre taze büyüme ortamı ile değiştirin. Besiyerinin tamamı yenilendiğinde, ilgilenilen ikinci popülasyonun 2,5 çarpı 10 ila beşinci hücresine bir mililitre taze besiyerinde eklerin üstüne tohumlayın ve tabağı inkübatöre geri koyun.

24, 48 ve 96 saat sonra, her bir ek parçanın üst kısmındaki ortamı bir mililitre yeni tam orta ile değiştirin. Ve her kuyu dibindeki ortam, iki mililitre taze tam ortam ile. 120 saatlik kokültürden sonra, her seferinde bir ek parçayı, bir mililitre PBS içeren ayrı ayrı 35 milimetre hücre kültürü kaplarına aktarın.

Ve eklerin alt kısımlarını ve üst kısımlarını bir mililitre PBS ile yıkayın. Ek parçanın altında büyüyen hücreleri toplamak için, ekleri alt tarafı aşağı bakacak şekilde 200 mikrolitre oda sıcaklığında tripsin-EDTA'ya yerleştirin. Oda sıcaklığında iki dakika sonra, 800 mikrolitre tam büyüme ortamı ile reaksiyonu durdurun.

Daha sonra, eki hafif bir açıyla tutarak, süpernatanı hücrelerin yüzeyine 10 kez nazikçe pipetleyin ve hücreleri tabakta toplayın. Tüm ekler sıyrıldığında, hücreleri mililitre büyüme ortamı başına iki kez 10 ila beşinci hücre konsantrasyonunda yeniden süspanse edin. Ve steril ayrı cam lamellerin üzerine 250 mikrolitre hücre ekleyin.

Lamelleri bir saat boyunca nemlendirilmiş inkübatöre yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, laminer akışlı bir biyolojik güvenlik kabininde, tabağa dikkatlice iki mililitre tam büyüme ortamı ekleyin ve 48 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit oranında nem altında inkübe edin. Sonra hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.

Üçüncü yıkamadan sonra, hücreleri oda sıcaklığında on dakika boyunca PBS'de% 4 formaldehit içinde sabitleyin, ardından Tris tamponlu tuzlu su ile beş yıkama yapın. Son yıkamadan sonra, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 0.1 saponin ile desteklenmiş% 0.25 Triton X-100 ile geçirgen hale getirin, ardından oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edici çözelti içinde inkübe edin. Daha sonra, numuneleri, gece boyunca dört santigrat derecede bloke edici çözeltide ilgilenilen birincil antikor ile etiketleyin.

Ertesi sabah, bağlanmamış antikoru yıkama solüsyonunda üç dakikalık yıkamalarla çıkarın, ardından bloke edici solüsyonda uygun ikincil antikorda bir saatlik oda sıcaklığında inkübasyon yapın. İnkübasyonun sonunda, bağlanmamış ikincil antikoru az önce gösterildiği gibi yıkayın ve lamelleri DAPI içeren antifade montaj ortamı ile ayrı slaytlara monte edin. Lamel kenarlarını şeffaf oje ile kapatın.

Ardından, floresan uyarımı için harici bir ışık kaynağı ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskopta hücreleri 63x yağ büyütme altında görüntüleyin. Bu sistem, 0.4 veya bir mikron gözenekli ekler kullanıldığında, zarın her iki tarafındaki hücre popülasyonlarında %99'dan daha büyük bir saflığı koruyarak, hücre kültürü eklerinin gözenekli zarlarının her iki tarafında en az 120 saat boyunca iki farklı hücre popülasyonunun büyümesine izin verir. Bununla birlikte, üç mikron gözenekli ekler, GFP pozitif bir insan meme kanseri hücre hattı kullanılarak bu deneyde gözlemlendiği gibi, hücrelerin zar boyunca göç etmesine izin verecek kadar büyüktür.

0.4 mikron gözenekli ekler ayrıca, ekin her iki tarafındaki hücre kültürleri arasında fonksiyonel boşluk bağlantılarının oluşumunu sınırlayarak, salgılanan faktörlerle iletişimi kısıtlar. Bununla birlikte, bir ve üç mikron gözenekli ekler, bu kokültürlerde floresan etiketin zar boyunca aktarılmasıyla gösterildiği gibi, hücrelerin boşluk bağlantıları boyunca işlevsel olarak bağlanmasına izin verir. Daha da önemlisi, bu sistem, insan meme kanseri hücreleri ile birlikte kültürlenen fibroblastlar üzerindeki caveolin-1 ekspresyonunun azalmasıyla kanıtlandığı gibi, meme kanseri hücreleri ile kokültürasyonlarını takiben normal insan diploid fibroblastlarından kanserle ilişkili fibroblastları etkili bir şekilde üretmek için kullanılabilir.

Bu prosedürü denerken, araştırılan soru için yeterli gözenek boyutuna sahip eklerin seçilmesi önemlidir. Ve ekin alt tarafındaki ilk hücre popülasyonunu, bağlanmalarını kolaylaştıran ortamda görmek. Bu prosedürü takiben, protein ekspresyon değişiklikleri, invazyon ve migrasyondaki değişiklikler veya terapötik ajanlara yanıtlardaki farklılıklar hakkında ek soruları yanıtlamak için immünoblotlama, yerinde immünofloresan veya diğer birçok hücre bazlı test gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, kanser biyolojisi ve radyasyon biyolojisi alanındaki araştırmacıların, tümör mikroçevresinin gelişimine, evrimine ve bizim durumumuzda iyonlaştırıcı radyasyonun zararlı etkilerinin radyasyonla hedeflenen hücrelerden çevredeki seyirci hücrelere yayılmasına katkıda bulunan faktörleri keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, karışık hücreli bir kokültürün nasıl hazırlanacağını, kokültürün nasıl sürdürüleceğini ve daha fazla analiz için kokültürden yüksek saflıkta zenginleştirilmiş hücre popülasyonlarının nasıl hasat edileceğini iyi anlamış olmalısınız. İnsan hücre suşları veya hücre hatları ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun uygun kişisel koruma ekipmanının giyilmesi ve uygun biyogüvenlik düzenlemelerine uyulması gerektiğini unutmayın.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.