Name: Tümör mikroçevresinin A Mimik: Hücreler arası İletişim Zenginleştirilmiş hücre popülasyonları oluşturma ve incelenmesi için Basit Bir Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Öğrenin tümör mikroçevresini taklit eden basit bir in vitro kookültür modeli ile hücre popülasyonlarını zenginleştirmeyi ve hücreler arası iletişimi incelemeyi. Bu yöntem kanser ve radyobiyoloji araştırmalarında değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, New Jersey Kanser Araştırmaları Komisyonu (Doktora Öncesi Burs DFHS13PPCO17), Ulusal Sağlık Enstitüleri (CA049062) ve Ulusal Havacılık ve Uzay Dairesi (NNX15AD62G) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.

Kültür Medya ve Hücre 1. Hazırlık <ol><li> Eagle minimum zorunlu% 12.5 (hacim / hacim) ile desteklenen ortamda ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), 2 mM L-alanil-L-glutamin ve penisilin 100 birim 500 ml ml streptomisin, 100 ug hazırlayın. Not: büyüme ortamı ve ek (ler) i, kolayca diğer hücre suşlan veya hücre hatları büyüme gereksinimleri için değiştirilebilir. </li><li> her bir ek (6-çukurlu format insert) hücre kültür ortamının 70 ul hazırlayın: bir Eagle minimum zorunlu ortam% 50 (hacim / hacim) ısı ile inaktive edilmiş FBS, 2 mM L-alanil-L-glutamin ve 100 birim ile desteklenmiş penisilin ve ml streptomisin, 100 ug. Not: orta parçanın alt tarafında (yani, alt) hücre bağlanmasını kolaylaştırmak için% 50 FBS ile takviye edilmektedir. Büyüme ortamı, ve ek (ler) i, kolayca diğer hücre suşlan veya hücre hatları büyüme gereksinimleri için değiştirilebilir. </li><li>parçanın alt tarafında kaplama olan tahsis edilmiş hücrelerin bir hücre süspansiyonu. NOT: Burada, sonuçları AG1522 75 cm 2 hücre kültürü şişeleri yetiştirilen normal insan fibroblastlar kullanılarak elde edildi ve bu hücreler bu nedenle hücre süspansiyonu hazırlık açıklamasının odak noktası olacaktır. </li><li> hücreleri toplamak için, büyüme ortamı çıkarın ve 5 mi 1X fosfat tamponlu salin (PBS) ile hücre mono tabakasının 2x yıkayın. </li><li> PBS çıkarın ve RT (oda sıcaklığı), 2 dakika için bir hücre boyunca oda sıcaklığında (RT) önceden ısıtılmış 2.21 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), tripsin,% 0.25 (hacim / hacim) 1 ml yayın. </li><li> (Adım 1.1 hazırlandı) tam büyüme ortamında 9 ml tripsin aktivitesinin sönmesi yavaşça şişeye 10x yüzeyi üzerine hücre süspansiyonu pipetle hücreleri toplamak. </li><li> Hemasitometre veya elektronik sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin ve provid olacak hücre süspansiyonu hacmi pipetE, bir steril 15 ml santrifüj borusu ile ekleme başına 250.000 hücre. </li><li> Santrifüjle hücre süspansiyonu (800 xg, 2 dakika) sonra pelet. 70 ul başına 250.000 hücre konsantrasyonu elde etmek için (adım 1.2 &#39;de elde edilmiş) büyüme ortamı hücre pelletini süspanse edin. Not: geçiren mikro gözenekli membran uçlar hücre kültürü 2B alt tabakalar göre gibi hücreleri başlangıçta bağlanmasını kolaylaştırmak için% 50 (hacim / hacim) FBS ihtiva eden bir ortam içinde askıya alınmalıdır hariç Hücre Serpilmesi benzer şekilde gerçekleştirilir. </li></ol> Ek&#39;lerin 2. Hazırlık NOT: hücre kültürüne adanmış bir laminer akış biyolojik güvenlik kabininde steril koşullar, çalışmasını sağlamak için. <ol><li> 0.4 um membran gözenek boyutu, 1 mikron ya da 3 uM seçin uçlar ile (gözenek büyüklüğü deney çıkar (ler) ile tespit, hücreler arası iletişim farklı mod rolünü araştırmak için kullanılabilir). NOT: 0,4 mikron gözenek smal olduğunuYeterince l uç zarın her iki tarafında hücreler arasında işlevsel boşluk bağlantıları oluşumunu sınırlamak ve salgılanan faktörlerle arası iletişim incelemek için kullanılabilir. Oysa, 1 um ile 3 um gözenekler, fonksiyonel boşluk bağlantıları oluşumuna izin verecek kadar büyüktür ve boşluk bağlantıları ve salgılanan faktörler hem arası iletişim incelemek için kullanılabilir. </li><li> ambalajından bireysel ekler çıkarın ve eşit büyüklükteki çok iyi çanak içine yerleştirin. NOT: Uçlar belirli uygulama ihtiyaçlarını karşılamak üzere çeşitli membran yüzey alanları mevcuttur (örneğin, 6-kuyu, 12-kuyu ve 24 kuyu ekler.). Burada, sonuçlar 6-kuyu insert kullanılarak elde edildi ve bu nedenle modeli açıklaması odak noktası olacaktır. </li><li> çanak kapaklı ekler içeren, çanak örtün. Iki eliyle çok iyi yemek Holding, yavaşça ekleme dipleri (yani, alt) artık yukarı bakacak şekilde çanak ters çevirin. </li><li> th kaldırinsertlerin alt tarafına maruz bırakılması çok çukurlu tabak E taban. Bir defada bir ekleme ile çalışarak, forseps steril bir çifti kullanmak ve yavaşça yerine insert tutun. serbest el ile 250,000 hücre ihtiva eden bir hücre süspansiyonu (adımları 1.3-1.8 hazırlandı) 70 ul çekmek için bir geniş ağızlı uç, bir pipet kullanın. </li><li> Hücreleri plaka, Ucun zarının ortasına hafifçe pipet ucu yerleştirin ve yavaş yavaş zarın yüzeyi etrafında pipet hareket ederken yavaş yavaş hücre süspansiyonu 70 ul pipet. ucun kenarına pipet ve hücre süspansiyonu uzatmak için dikkatli olun. Not: ekleme kenarına temas birleştirilmesi esnasında kurutma hücrelerine yol açmakta ve hücre süspansiyonu kapiler gerilimi kaybına neden olabilir. </li><li> bakım icra olmamak olası mikrobiyal kontaminasyonu önlemek maruz kalan uçlar üzerinde doğrudan çalışmak için birlikte kalan uçlar için tekrarlayın. </li><li> Yavaşça çok-iyi dönüşçanak alt ekler kapsayacak. Ters uçlar ile çanak tutulması, 30-45 dakika süreyle 37 ° C de% 5 (hacim / hacim) CO2 bulunan nemli bir hava atmosferinde inkübe edin. NOT: insert temas kuyunun alt hücre süspansiyonu, dikkatle çanak altını kaldırın ve hafif bir açı oluşturur ve çanak yüzeyi arasında daha fazla ayrılık yaratır, böylece yemeğin üstüne kenarında onu dinlenme halinde ve (hücreler numaralı seribaşı) ekler alt tarafı. Bu yerine geçmenin gözlerin yüzlerine takılarak hücreleri engeller. </li><li> 30-45 dk inkübasyon süresi sonrasında nazikçe ekler içeren çanak kaldırmak ve laminer akış biyolojik güvenlik kabini yerleştirin. </li><li> İki elleri ve sıkı çanak kapağı tutulması ile yavaşça ekli hücreleri içeren ekler alt tarafı şimdi aşağı bakacak şekilde çanak yeniden ters çevirin. </li><li> 3 mikron gözenek Migrati önlemek için ekler için yavaş ve dikkatli 2 ml (1 ml ekleyinekin alt kısmı batırılır ve böylece önceden ısıtılmış tam ortam insert gözenek) içinden hücre ile (her bir oyuğa adım 1.1), bkz. </li><li> ekler içeren tüm kuyularda büyüme ortamı ekledikten sonra, nemlendirilmiş bir inkübatör geri çanak yerleştirin. </li><li> uçlar 48 saat boyunca inkübatör rahatça durmasına izin verin. 48 saat sonra, kuyunun dibinden ortam 2 ml aspire ve taze büyüme ortamına 2 ml ekleyerek hücreleri beslenir. </li><li> Bunlar için (daha önce alt tarafta artan ilk hücre nüfusu insert, üst tarafında ikinci hücre popülasyonunun süspansiyonu (~ 250,000 hücre / ml) de, tohum, 1 ml alt taze ortam ilave edildikten sonra deneyler, AG1522 (kontrol) hücreleri veya kanser (deney) hücreleri) eklentilerin alt tarafında büyüyen, cafs olmaya aday önce AG1522 hücrelerine sahip ekler, üst üste yerleştirilir. nemlendirilmiş bir inkübatör geri tabak koyun. NOT: Eğer işekin alt de uygun olmayan hücrelerle ing, bu hücreler sokma üst tarafında yetiştirilebilir. </li><li> de insertinin alt ve üst, orta aspire ucun üst tarafına hücre popülasyonu ikinci bir tohumlama sonra 24, 72, orta ve 96 saat değiştirin. Yavaşça, çukurun tabanına ucun üst tarafına taze ortam 1 ml ve 2 ml ekleyin. İki hücre popülasyonları 120 saat boyunca geçirgen, mikro gözenekli membran çanağı her iki tarafında ko-kültür kalmasına izin verir. </li></ol> 3. Trypsinization tarafından Ekle gelen Hücreleri Toplama Not: zenginleştirilmiş hücre popülasyonu elde etmek kolaylığı ek olarak, uç TME modeli aynı zamanda benzer bir deneysel tedavi için (örn, kimyasal maddeler, yukarıda belirtilen ya da çevre atmosferinde aşağıdaki oksijen koşullarına maruz, iyonize radyasyon tedavisi, vb inkübasyon) halinde diğer in vitro </em&gt; TME ko-kültür modelleri. Ayrıca, geçirgen uç ko-kültür substratı önce standart 2D doku kültürü modelleri için gelişmiş işlemler ile analiz edilebilir. Örneğin, hücreler (in situ imüno-algılama, Batı beneklenmesinde örneğin) daha sonra bitiş noktası analizi için kullanılabilir zenginleştirilmiş popülasyonları elde etmek üzere uç zarın her iki tarafında hasat edilebilir ve daha sonraki deneyler 36 için yayılabilir. <ol><li> hücreleri toplamak için, büyüme ortamından parçayı çıkarın ve 1 ml PBS içeren 35 mm hücre kültürü çanak içine yerleştirin. 1 ml PBS ile uç 1x alt ve üst tarafı yıkanır. </li><li> PBS çıkarın ve% 0.25 2.21 mM EDTA, tripsin (hacim / hacim), 200 ul, oda sıcaklığına kadar ön ısıtılmıştır. <ol><li> parçanın alt tarafında yetiştirilen hücreler toplanması için, 35 mm çanak içine tripsin solüsyonu yerleştirin ve yavaşça oda sıcaklığında 2 dakika boyunca tripsin solüsyonu içine ucun alt tarafının. </li><li> hücrenin toplanması halindeekin üst tarafında yetiştirilen s, 35 mm tabak içine ekleme yeri ve ekin üstüne tripsin solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edilir. </li></ol></li><li> tam büyüme ortamında 800 ul ekleyerek tripsin aktivitesinin sönmesi. <ol><li> ekin alt yetiştirilen hücreler toplanması için, 35 mm çanak büyüme ortamı ilave edin ve yavaşça Hafifçe tutulmakta olan, ucun 10 kat yüzeyi üzerine hücre süspansiyonu 1 ml pipetleme hücreleri toplamak açı, hücre süspansiyonu çanak içine toplar şekilde. </li><li> ucun üst tarafından hücrelerin toplanması, üst tarafına bir büyüme ortamı ilave edin ve yavaşça insertin 10x yüzeyi üzerine hücre süspansiyonu 1 ml pipetle. </li></ol></li></ol> Akış Sitometrisi ile Hücre Saflık 4. Karakterizasyonu Not: t saflığını korumak için geçirgen, mikro gözenekli membran ekler karakterize etme kabiliyetini120 saat kadar bölümler 1-3, yeşil floresan protein (GFP) ile yapıldı (yani üst ve alt), iki hücre popülasyonları MDA-MB-231 hücreleri ucun üst tarafına kaplanan etiketli ve olmayan GFP etiketli AG1522 hücreleri, 0.4 μm- alt tarafındaki 1 μm- veya 3 mikron gözenek uçlar kaplanan. <ol><li> Parçanın alt taraftan hücreleri (yöntem Bölüm 3&#39;te tarif edilmiştir) toplandı bir kez santrifüj ile hücre süspansiyonu (500 g, 30 sn) pelet. </li><li> Süpernatantı ve% 1 (hacim / hacim) FBS ile desteklenmiş Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde 400 ul hücre pelletini askıya. </li><li> GFP ve GFP foton emisyonu 37 algılamak için 530/30 bir bant geçirici filtresi heyecanlandırmak için sitometresinde bir 488 nm lazer ile donatılmış bir akış sitometrik analizi yapın. </li><li> Hücre tanımlama amacıyla, akış sitometresinde ileri ayarlamak için AG1522 kontrol hücre popülasyonları ve yan dağılım gerilimleri kullanın. ayarlamakGFP kanal voltaj GFP sinyali için alt saptama eşiği olarak hücresel otofloresans değerini ayarlamak için. </li><li> Kontrol hücreleri kullanılarak eşik yolluk belirleyin. kontrole karşı GFP pozitif hücrelerinin varlığı göre her hücrelerinin saflığı değerlendirmek. NOT: Saf nüfus tespit hiçbir GPF-pozitif hücrelerin yansıtıcı olacaktır. </li></ol> Yerinde imünofloresansta tarafından Hücreleri 5. Karakterizasyonu <ol><li> Ekin hücreleri tripsinizasyon sonra (bölüm 3) hücreleri toplamak, levha 5 x 10 4, steril cam kapak slipleri 250 ul büyüme ortamı (adım 1.1) hücreleri ve bir nemli hava atmosferinde 1 st için takmak için izin 37 ° C inkübatör% 5 (hacim / hacim) CO2. </li><li> İnkübasyonun sonunda, yumuşak lamel ihtiva eden tabağı çıkarın ve bir laminer akış biyolojik güvenlik kabinine yerleştirin. </li><li> Dikkatle (adıma bakın önceden ısıtılmış tam orta 2 ml ekleyin1.1) tabakların her birine, böylece lamel batırılır. </li><li> Lamelleri içeren tüm yemekler için büyüme ortamı ilave edildikten sonra, 48 saat için bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C &#39;de% 5 (hacim / hacim) CO2 nemlendirilmiş hava atmosferine geri yemekler döndürür. </li><li> 48 saat inkübe edildikten sonra, PBS ile örnek 3x yıkama ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde% 4 (ağırlık / hacim) formaldehid ile tespit edin. </li><li> Tris tamponlu tuz (TBS: 50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCI) ile 5x yıkayın ve daha sonra 5 dk için 0.25,% (hacim / hacim) Triton X-100,% 0.1 (ağırlık / hacim) bir saponin ile geçirgen hale RT. </li><li> spesifik olmayan% 2 (hacim / hacim) normal keçi serumu (NGS),% 1 (ağırlık / hacim) sığır serum albümini (BSA),% 0.1 (hacim / hacim) TBS içinde Triton X-100 ile bağlanma sitesi bloğu (bloke oda sıcaklığında 1 saat için çözelti). </li><li> gece boyunca 4 ° C&#39;da, çözelti engelleme: birincil antikor (1.000 anti-Caveolin 1 (CAV1), 1) kuluçkalayın. </li><li> % 0.2 NGS (hacim / hacim),% 1 (ağırlık / hacim) BSA,% 0.1, bağlanmamış birincil antikor (3x, 5 dak / yıkama) yıkayın (voL / hacim) TBS içinde Triton X-100 (yıkama çözeltisi). </li><li> bloke etme çözeltisi 1 saat süre ile, oda sıcaklığında, ikincil antikor ile inkübe (bölüm 5.4). </li><li> ilişkisiz ikincil antikor yıkama solüsyonu ile (3x, 5 dakika / yıkama) yıkayın (adım 5.6). </li><li> Dağı 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren bir anti-solmaya montaj orta ile bir slayt lamelleri ve tırnak cilası ile mühür. </li><li> floresans uyarma için harici bir ışık kaynağı ile donatılmış bir inverted mikroskop üzerinde 63X petrol büyütme objektif kullanarak hücrelerin gözlemlemek ve sonraki analiz için bağlı bir dijital kamera kullanarak görüntü yakalamak. </li></ol> Western Blot ile hücrelerin 6. Karakterizasyonu NOT: Western blot süreciyle başka 38 tarif edilmiştir. Kısa bir anahat burada tarif edilir: <ol><li> Trypsinization tarafından Ovülden hücrelerin ayrılmasını takiben, (bkz bölüm 3) santrifüj (500 gr, 30 sn) ile hücre süspansiyonu pelet. </li><li> Süpernatantı ve 100 ul PBS ile hücre topağı 2x askıya. </li><li> değiştirilmiş Radyoimmunopresipitasyon tahlilinde 50 ul süpernatan ve lize hücreleri çıkarın (RIPA) tamponu (Tris pH 7.5, 50 mM NaCl 150 mM, NP-40,% 1 (hacim / hacim), sodyum deoksikolat monohidrat (DOC)% 0.5 (hacim / hacim), sodyum dodesil sülfat (SDS),% 0.1 (hacim / hacim)), proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyl ihtiva etmektedir. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 19,000 g&#39;de buz ve santrifüj 20 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> RIPA tamponu içinde deterjan uyumlu bir protein optik yoğunluk deneyi kullanılarak süpernatan protein konsantrasyonunu belirleyin. </li><li> 0.2 um nitroselüloz zar üzerine elektroblot, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) tarafından ayrı proteinler. </li><li> % 0.1 (hacim / hacim) Tween-20 (TBST) ve% 4 (ağırlık / hacim) içeren TBS içerisinde zarlar inkübe 60 dakika süre ile, süt (engelleme çözelti) yağsız ve (bir gece boyunca 4 ° C&#39;de ana antikorla reaksiyona antiCAV1, 1: 1,000). </li><li> RT (5 dk / yıkama) de TBST ile zar 3x yıkayın. </li><li> yaban turpu peroksidazı (HRP) (: 5.000: 1) ile konjuge edilmiş bir anti-fare ikincil antikoru içeren çözelti bloke 30 dakika boyunca zarların inkübe edin. </li><li> RT (5 dk / yıkama) de TBST ile zar 3x yıkayın. </li><li> Bir Western lekeleme algılama sistemi kullanarak kemilüminesans ile reaksiyon ürünleri gözünüzde canlandırın. </li></ol> Akış Sitometrisi ile Hücreler arası İletişimin 7. Karakterizasyonu NOT: geçirgen mikro gözenekli membran uyum karakterize etmek için hücreler arası iletişimi (örneğin, salgılanan faktörler, gap junction) farklı mod incelemek için ekler. Bölümler 1-2,12 floresan olmayan AG1522 hücreleri 0.4 μm- alt tarafı, 1 μm- veya 3 um gözenekli ekler ile kaplanan ile yapıldı. <ol><li> Kültür, Bölüm 1.1&#39;de tarif edilen ortam kullanılarak% 90 konfluansa kadar 35 mm çanak AG1522 hücreleri etiketli olmayan. </li><li> RINSE hücreleri HBSS 1 ml 1x. </li><li> Kalsein AM ile 30 | im ihtiva eden HBSS içinde hücrelerin inkübe edilmesi ile Calcein AM Yük hücreleri. </li><li> 37 ° C de% 5 (hacim / hacim) CO2 bulunan nemli bir hava atmosferinde 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Yıkama hücresi HBSS 1 ml 2x. </li><li> Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 2.21 mM EDTA,% 0.25 tripsin 200 ul çözelti (hacim / hacim) ilave edilerek Hücreleri tripsinize edin. </li><li> % 12.5 içeren tam bir ortam (hacim / hacim) FBS, 800 ul ekleyerek tripsin aktivitesinin sönmesi. </li><li> tekrarlanan pipetleme süspansiyon içine hücreleri getirin. </li><li> Hemasitometre veya elektronik sayaç kullanılarak hücre konsantrasyonunu belirlemek önce alt tarafta büyüyen AG1522 hücrelerine sahip eklerin üst tarafına kalsein AM ile yüklendi 250.000 hücre plaka. </li><li> 37 ° C de% 5 CO2 bulunan nemli bir hava atmosferinde uçlar inkübe 6 saat. </li><li> tarif edildiği gibi 6 saat sonra, ara parça alt tarafından hücreleri toplamak3. bölümde. </li><li> santrifüjle hücre süspansiyonu (500 g, 30 saniye) sonra pelet. </li><li> Süpernatantı ve% 1 (hacim / hacim) FBS ile desteklenmiş HBSS 400 ul hücre pelletini askıya. </li><li> lazer ile donatılmış bir sitometresindeki hücreleri analiz ve heyecan verici yeteneğine sahip filtre ve üretici protokol uyarınca, Calcein (496 nm ve 516 nm, sırasıyla) emisyonunu tespit. </li><li> Hücre tanımlama amacıyla, akış sitometresinde ileri ve yan dağılım gerilimleri ayarlamak için bir lekesiz AG1522 kontrol hücre popülasyonu kullanın. Calcein sinyali için alt saptama eşiği olarak hücresel otofloresans değerini ayarlamak için Calcein kanal gerilimini ayarlamak. </li><li> Calcein yüklü kontrol hücreleri kullanılarak üst eşik sınırını belirleyin. kontrole karşı Kalsein-pozitif hücrelerinin varlığı temelinde her bir hücre ekleme için iletişim değerlendirmek. </li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip veya çakışan çıkarları olduğunu beyan ederim.

Burada açıklanan protokol geçirgen bir mikro gözenekli membran geçme heterotipik hücre ko-kültür zenginleştirilmiş bir hücre popülasyonlarının üretmek için kullanıldığı bir basit, in vitro prosedür adapte edilebilir (Şekil 1). Belirgin bir şekilde, örnek arası çeşitli iletişim modu araştırılması için uygundur. kritik adımlar üst tarafında ikinci bir hücre popülasyonu tohumlama,% 50 FBS ile takviye edilmiş ortam içinde parçanın alt tarafında, ilk hücre popülasyonunu tohumlama, spesifik deneysel ...

tümör mikro (TME) arada var ve ev sahibi stroma yanında gelişmeye karsinom hücreleri oluşan son derece karmaşık bir sistemdir. Bu stromal bileşeni, tipik olarak fibroblastlar, miyofibroblastlar, endotel hücreleri, çeşitli bağışıklık bileşenlerinin, hem de hücre dışı bir matris 1 oluşur. Önemli bir bileşen, bu stroma genellikle çoğu, aktive edilmiş fibroblastlar, sıklıkla kanserle ilişkili fibroblast veya karsinoma ile ilişkili fibroblastlar (CAF) 2,3 olarak adlandırılır. Normal, aktif olmayan fibroblastlar aksine cafs meme, prostat, akciğer, pankreas, deri, kolon, özofagus olmak üzere karsinom, çok çeşitli tümör başlaması, ilerlemesi, anjiyogenez, invazyon, metastaz ve nüks 4-11 katkı ve 5,6,12-17 yumurtalık. Oysa, kanser patogenezinde boyunca cafs katkısı kesin doğası yetersiz tanımlanmış kalır. Ayrıca, klinik kanıtlar cafs bir prognostik değeri göstermiştirYüksek dereceli maligniteler, tedavi yetmezliği ve genel olarak kötü prognoz 10,18,19 kendi varlığını ilişkilendirilmesi. Açıkçası, CAF geliştirme başlatılması olaylar yanı sıra TME içindeki rollerini aracılık hücrelerarası iletişim anlayışımızı geliştirerek, hasta sonuçlarını geliştirmek heyecan verici yeni tedavi hedefleri ve gelişmiş stratejileri sağlayabilir. Bu amaca yönelik olarak, in vivo ve in vitro modellerde çok geliştirilmiştir. In vivo yaklaşımlar hastaların TME daha yansıtıcı olmakla birlikte, içinde ve tümörler arasında hem muazzam karmaşıklığı ve heterojenliği dahil sınırlamalar sahiptirler. Ayrıca, insan denekler tümör örnekleri genellikle oldukça TME geliştirilen temsil ve TME başlatılması olayların bir anlayış izin vermez. Deneysel hayvan çalışmaları nedeniyle fiziksel durumları farklılıklardan ancak insanlara hayvan verilerinin genelleme dikkatli yapılmalıdır bazı avantajlar sunarBu tür kemirgenlerde (örn tiyol kimya 20, metabolizma hızı 21 tolerans vb 22 vurgulamak) olarak insanlar ve hayvanlar arasında ology. Ayrıca, doğada genetik olarak heterojen olan insan nüfusunun, aksine, laboratuvar hayvanları genellikle homojenlik için yetiştirilmektedir. Ayrıca, geçici fizyolojik değişimleri ve hücre fenotip değişiklikleri incelemek için, yanı sıra, kemirgenler gibi hayvan kullanarak belirli deneysel parametrelerin kontrol etmek için çoğu zaman zordur. Bu nedenle, in vitro, 2- ve 3-boyutlu (2D ve 3D) doku kültürü modelinde sık TME gelişmenin temel anlayışı ilerletmek için kullanılmaktadır. In vivo sistemlerinin karmaşıklığı doğru bir canlandırdığı onların eksikliği rağmen, bu modeller büyük ölçüde mekanik soruşturma kolaylaştırmak avantajlar sunmaktadır. In vitro modeller TME daha basitleştirilmiş odaklı ve uygun maliyetli analizi için, bu sayede istatistiksel olarak anlamlı izin veri oluşturulabilirhayvanlarda ortaya çıkan sistemik varyasyonlar serbest hücreleri. In vitro sistemlerinde birçok çeşidi vardır. En sık kullanılan iki TME in vitro model karışık tek tabaka ya da sferoit hücre kültürleri içerir. Hem kültür yöntemleri arası etkileşimleri ve çeşitli TME spesifik hücre fenotipi değişikliklerin analizi için (tümör hücreleri ile, örneğin, normal hücreler) temel çalışmaları için avantajlıdır (örneğin normal fibroblastlardan kanserle ilişkili fibroblastlar ortaya çıkması). Ayrıca, küremsi TME daha yansıtıcı doku benzeri bir yapı oluşturmak edebiliyoruz, ve tümör heterojenliği 23 temsilcisi olabilir. Ancak sferoidler genellikle deneysel sonuçlar 24 zorlaştırabilir katmanlar arasında büyük ölçüde değişen oksijen basıncı geçişlerini, üretirler. Ne yazık ki, iki model son derece ko- aşağıdaki ileri karakterizasyon ve çalışma için saf hücre popülasyonlarının izole etme yeteneği sınırlıdırkültür. bu nedenle floresan etiketli veya tespit makinesi ile etiketlenmiş ve daha sonra hücre popülasyonları ayırmak için ayırma geniş işleme ve hücreye ko-kültür karıştırılır tabi olması için en azından bir hücre tipi gerektirecektir yapmak. Hücre sıralayıcı oldukça saf bir hücre popülasyonu izole edebilen birlikte, bir selüler stres ve muhtemel mikroplu kirliliklere farkında 25 riski olmalıdır. Hücrelerarası iletişimi anlaşılmasını kolaylaştırmak için, büyük çabalar geliştirmek ve basitleştirilmiş bir yaklaşım izin yakından, in vivo ortamda taklit in vitro sistemlerde optimize edilmesine yönelik tahsis edilmiştir. Böyle bir alet geçirgen mikro gözenekli insert, ilk 1953 26 yılında geliştirilen ve daha sonra farklı uygulamalar ve çalışmalar (örneğin, hücre polarite 27 endositoz 28, uyuşturucu taşımacılığı 29, doku modelleme 30, fert için adapte edilmiş bir zar substratyonu 31 seyirci kalma etkisi 32,33, vs.). Bu sistem geçirgen olmayan plasticware üzerinde kültürlendiklerinde gözlenmez 34,35 işaretleyicileri in vivo birçok in vivo benzeri anatomik ve fonksiyonel farklılaşma hücrelerin büyümesini, hem de ifadeyi verir. Ayrıca, son derece ince gözenekli membran (10 mikron kalınlığında) in vivo ortamda taklit ve hem üst ve taban hücre etki bağımsız hücre işleyişini izin moleküller ve dengeleme kez hızlı difüzyon izin verir. zar, gözenekler içinden içi çeşitli iletişim modu koruyarak TME sistemi olarak ucun yardımcı ilave bir avantajı, aynı çevre koşulları zarın her iki tarafında yetiştirilen iki heterotipik hücre popülasyonlarının fiziksel olarak ayrılmasıdır. Fiziksel olarak ayrılmış olmasına rağmen, iki hücre popülasyonları metabolik de olduğu gibi, salgılanan elemanları üzerinden bağlandığı veAyrıca boşluk kavşak kanallardan, burada tarif. Ayrıca, in vivo kısmi oksijen basıncı da ekler (PO 2) sürdürerek, model diğer sistemlerde gözlenen oksijen ve kimyasal geçişlerini komplikasyonlarını azaltır. Aksine, bu TME kontrol doğal mekanizmaların anlaşılması artırır. Özellikle, iki hücre popülasyonları kolaylıkla eş-kültür uzun süreler aşağıdaki flüoresan etiketleme ve / veya hücre sıralama olmaksızın, yüksek saflıkta izole edilebilir. Burada membran gözenekleri sayesinde, sürekli iki-yönlü iletişim henüz insan meme karsinoma hücreleri ve geçirgen bir mikro gözenekli membran geçme her iki tarafında sırasıyla yetişkin insan fibroblastlarında oluşan bir in vitro TME protokol açıklar ama. Biz gösteriyor ki gelişimine farklı gözenek boyutları ile, hücrelerarası iletişimi belirli bir tip katkısı (gap junction karşı, örneğin salgılanan faktörler) membranlar kullanılarakTME araştırılabilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Hücre Kültürü için< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AG01522 (yani , AG1522) insan diploid fibroblast</td><td>Coriell</td><td>107661</td><td>Geçit 8-13</td></tr><tr><td>MDA-MB-231-luc-D3H1 meme adenokarsinomu hücre hattı</td><td>PerkinElmer</td><td>119261</td><td>Ebeveyn hattı: ATCC (#HTB-26)</td></tr> <tr><td>MDA-MB-231 / GFP meme adenokarsinomu hücre hattı</td><td>Hücre Biyolaboratuvarları</td><td>AKR-201</td><td></td></tr><tr><td>Eagle'ın minimal esansiyel ortamı (MEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS), Nitelikli</td><td>Sigma</td><td>F6178-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Corning Glutagro Takviyesi (200 mM L-alanil-L-glutamin)</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-015-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin Çözeltisi, 100x</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Transwell Ekleme (yani , geçirgen mikro gözenekli membran ekleme) (0.4 & mu; m gözenek)</td><td>Costar</td><td>3450</td><td></td></tr><tr><td>Transwell Uç (yani , geçirgen mikro gözenekli membran uç) (1 & mu; m gözenek)</td><td>Greiner bio-one</td><td>657610</td><td></td></tr><tr><td>Transwell Ek Parçası (yani , geçirgen mikro gözenekli membran ek parçası) (3 & mu; m gözenek)</td><td>Costar</td><td>3452</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu Kültür Plakası</td><td>Greiner Bio-One Cellstar</td><td>657160-01</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 hücre kültürü şişesi</td><td>CellStar</td><td>658 170</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS), 1x</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td>, <td>kalsiyum ve magnezyum içermez</td></tr><tr><td>%0,25 (hacim/hacim) Tripsin, 2,21 mM EDTA, 1x</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-Cl</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Santrifüj Tüpü</td><td>CellTreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Hücre Kültürü Kabı</td><td>Greiner bio-one</td><td>627 160</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</strong</td></tr><tr><td>>İmmünofloresan Mikroskobu için</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Caveolin 1</td><td>BD Transdüksiyon Laboratuvarları</td><td>610406</td><td>In situ İmmünofloresan - 1:5.000</td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG (H+L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 488 konjuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11029</td><td> Yerinde İmmünofloresan - 1:2.000</td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini - Fraksiyon V</td><td>Rockland</td><td>BSA-50</td><td>İmmünoglobulin ve proteaz içermez</td></tr><tr><td>%16 (ağırlık/hacim) Formaldehit</td><td>Çözeltisi ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td> 1x PBS Premium Kapak Camı (22 mm x 22 mm No.1) <td>ile %4'e seyreltin</td></tr> <tr><td></td><td>Fisher</td><td>12548B</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Invitrogen</td><td>S36938</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ile SlowFade Gold antifade reaktifiName</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td> Akış Sitometrik Analizi için</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein,</td><td>Moleküler Problar</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</strong<></td>strong<td>>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Western Blot Analizi için</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Caveolin 1</td><td>BD Transdüksiyon Laboratuvarları</td><td>610406</td><td>Western Blot - 1:1,000</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioRad</td><td>170-6531</td><td></td></tr><tr><td>Nitroselüloz Membran (0.2 &mu; m)</td><td>BioRad</td><td>162-0112</td><td></td></tr><tr><td>Western Lightning Plus-ECL</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>BioRad DC Protein Testi</td><td>BioRad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat (SDS)</td><td>BioRad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat monohidrat (DOC)</td><td>Sigma</td><td>D5670</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>% 30 Akrilamid/Bis Çözeltisi, 37.5: 1</td><td>BioRad</td><td>161-0158</td><td></td></tr></tbody></table>

tümör mikroçevresinin a mimik: hücreler arası İletişim zenginleştirilmiş hücre popülasyonları oluşturma ve incelenmesi için basit bir yöntem

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

kanser hücreleri ve çevresindeki kanserli olmayan stroma arasındaki erken heterotypic etkileşimleri anlamak stromal aktivasyonu ve tümör mikro-(TME) kurulmasına yol açan olaylar durulaştırmada önemlidir. In vitro ve TME vivo modellerde çeşitli geliştirilmiştir; Bununla birlikte, genel olarak bu modeller hali hazırda daha fazla çalışma, bozucu olmayan koşullar altında, tek tek hücre popülasyonlarının izole izin vermez. Bu zorluğu aşmak için, uzun bir co Ucun zarın her iki tarafında ayrı ayrı iyice büyümüş zenginleştirilmiş hücre popülasyonlarının kolay üretilmesi, fakat izin veren bir geçirgen mikro gözenekli membran geçme oluşan bir hücre büyütme alt-tabaka kullanılarak bir in vitro TME modeli kullanmışlardır -Kültür kez. Bu modelin kullanımı sayesinde, normal diploid insan fibroblastlarında den (CAF) popülasyonu aşağıdaki önemli ölçüde zenginleştirilmiş kanserle ilişkili fibroblast üretme yeteneğine sahiptirFloresan etiketleme ve / veya hücre sıralama kullanılmadan yüksek düzeyde metastatik insan göğüs karsinom hücreleri ile birlikte-kültür (120 saat). Ayrıca, ekin gözenek boyutu modüle ederek, biz gelişimini altında yatan mekanizmaların soruşturma izin iki heterotypic hücre popülasyonları arasındaki hücrelerarası iletişimi (örneğin, boşluk kavşak iletişim, salgılanan faktörler) modu için kontrol edebilirsiniz gap junction geçirgenliği rolü de dahil olmak üzere TME,. Bu model kanser stroma başlatılması, TME erken evrimi ve terapötik ajanlar kanser hücrelerinin yanıtları stroma modüle etkisi yol açan ilk olayların anlayışımızı arttırmak değerli bir araç olarak hizmet vermektedir.

Burada in vivo tümör mikro-(Şekil 1) taklit eden bir in vitro heterotipik hücresi eş-kültür sistemi geliştirmek için geçirgen bir mikro gözenekli membran inserti adapte. İki farklı hücre popülasyonları (eden kullanım sırasında, 120 saat kadar) uzun zaman süreleri için ucun gözenekli membranın her iki tarafındaki yetiştirilmeye Bu sistem sağlar. 0.4-, 1- veya 3 m gözenekli eklerin üst tarafında GFP etiketli, MDA-MB-231 hücreleri kaplama ve bunların büyüm...

Tümör mikroçevresini (TME) taklit etmek için geçirgen bir mikro gözenekli membran ekini uyarladık. Model, karışık bir hücre kültüründen oluşur, floresan etiketleme veya hücre sıralama kullanmadan yüksek oranda zenginleştirilmiş bireysel hücre popülasyonlarının basitleştirilmiş üretimine izin verir ve normal veya stres koşulları altında TME içinde hücreler arası iletişimin incelenmesine izin verir.

Tümör mikroçevresinin A Mimik: Hücreler arası İletişim Zenginleştirilmiş hücre popülasyonları oluşturma ve incelenmesi için Basit Bir Yöntem

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

Bu basit in vitro kokültür modelinin genel amacı, in vivo tümör mikroçevresinin özelliklerini taklit etmek, bireysel hücre popülasyonlarını zenginleştirmek ve hücreler arası iletişimin çeşitli modlarını incelemektir. Bu yöntem, kanser ve radyobiyoloji alanlarındaki temel soruların, özellikle kanserle ilişkili fibroblastların oluşumunun altında yatan faktörlerin ve terapötik ajanlara verilen yanıtların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, stresle tetiklenen floresan işaretleme veya hücre ayırma işlemi olmadan, karma hücre kültüründen bireysel hücre popülasyonlarının oluşturulmasına olanak tanımasıdır.İlgilenilen hücre kültürünü beş mililitre PBS ile iki kez yıkayarak başlayın. İkinci yıkamadan sonra, hücreleri oda sıcaklığındaki bir mililitre trypsin-EDTA ile oda sıcaklığında iki dakika boyunca ayırın. Ardından, hücreleri çözmek için medium'u flask yüzeyine 10 kez nazikçe pipetleyerek reaksiyonu dokuz mililitre komple büyüme medyumu ile durdurun.Sayım işleminden sonra, hücreleri taze ortamda 2,5 x 10⁵ hücre/mL konsantrasyona seyrelterek steril 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri santrifügasyonla çöktürün ve pelletlemiş hücreleri, %50 fetal bovi

a-mimic-tumor-microenvironment-simple-method-for-generating-enriched

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Glioblastoma multiforme'nin hasta kaynaklı ksenogreftleri, 3D insan biyojel kültür sistemi kullanılarak canlı mikrotümörlere minyatürleştirilebilir. Bu in vivo benzeri 3D tümör testi, kinom analizi de dahil olmak üzere ilaç yanıt testi ve moleküler profilleme için uygundur.

Kinomic Profil Yöntemi ve İlaç Tepki Testi için 3D İnsan BIOGEL Kültür Sisteminin Kullanılması Microtumors ve Hasta kaynaklı Glioblastom Hücreleri Üretimi

Kanser hücreleri bir kollajen jele gömülür ve daha sonra uydu tümörlerinin invazivliği ve oluşumunun izlenebileceği bir 3D kültür sistemi oluşturmak için bir aselüler fibrin jeli içine sıkıştırılır.

Kanser hücre istilası ve Uydu Tümör oluşumu keşfedin Kültür Testi Üç Boyutlu

Burada ayırmak ve kurulan subkutan tümörler tümör bağışıklık ve non-immün microenvironment bileşenlerinin zenginleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik tümör bağışıklık sızmak ve tümör bağışıklık microenvironment kapsamlı karakterizasyonu izin verebilir non-immün tümör kesirler ayrı analiz için sağlar.

Zenginleştirme ve kurulan subkutan fare tümör tümör bağışıklık ve Non-immün Microenvironments karakterizasyonu

Parakrin ve juxtacrine hücresel etkileşimlerin tümör ilerleme, bağışıklık yanıtı, anjiogenez ve geliştirme de dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçlerinde önemli bir rol oynamaktadır. Burada, proksimal kültür yöntemi parakrin sinyal incelemek için doğrudan hücresel temas engelleyen sırasında salgılanan faktörler yerelleştirilmiş konsantrasyonları nerede saklanır kullanılır.

Parakrin hücreler arasında sinyal çalışmaya proksimal kültür yöntemi

Burada sunulan yöntemin amacı, mikroortam mikrodiziler (Mema) nasıl imal edilebilir ve kültürlü hücrelerin fenotürü üzerinde basit Kombinatoryal mikroortamlar binlerce etkisini sorgulamak için kullanılan göstermek için.

Kanser hücresel Phenotypes üzerinde Mikroçevresel etki Interrogate için Microdiziler kullanma

Sunulan yaklaşım aynı anda 3D spheroid tahliller ve T-hücre sitotoksisite kanser hücresi invazyonu değerlendirir. Spheroids bir iskele-free agarose multi-microwell döküm oluşturulur. Eş-kültür ve tip I kollajen matris gömme kanser hücresi invazyonu ve T-hücre aracılı sitotoksisite izlemek için izin veren aynı cihaz içinde gerçekleştirilir.

3D Kültürde Kanser Hücre İstilası ve T-Hücre Sitotoksisitesi İzleme

İmmünoterapi ve tek hücreli genomik profilleme çağında, kanser biyolojisi, tümör-bağışıklık arayüzünü uygun bir mekansal zamansal bağlamda araştırmak için yeni in vitro ve hesaplama araçları gerektirir. Hücresel fonksiyonların dinamik, multiparametrik izlenmesi ile uyumlu, 2D ve 3D ortamlarda tümör-immün mikroakışkan ko-kültürlerden yararlanmak için protokolleri açıklıyoruz.

İn vitro tümör mikroortamlarında immün yanıtı diseksiyon için mikroakışkan ko-kültür modelleri

İnvaziv hücre alt popülasyonlarını gerçek zamanlı olarak tespit etmek ve yakalamak için bir yaklaşım açıklıyoruz. Deneysel tasarım, hücrelerin elektrik empedansındaki değişiklikleri izleyerek Gerçek Zamanlı Hücresel Analiz kullanır. Kompleks dokulardaki invaziv kanser, immün, endotel veya stromal hücreler yakalanabilir ve ko-kültürlerin etkisi değerlendirilebilir.

Ko-kültürlerden İnvaziv Hücre Alt Popülasyonlarının Gerçek Zamanlı Tespiti ve Yakalanması

Burada, kanser-bağışıklık döngüsünü oluşturan adımları izlemek ve karakterize etmek için basit, hızlı ve güvenilir bir multiparametrik akış sitometrisi ve çip üzerinde tümör destekli protokolü detaylandırıyoruz. Gerçekten de, kanser ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimlerin kapsamlı bir şekilde anlaşılması, tümörleri alt etmek ve klinik bakıma rehberlik etmek için kritik bilgiler sağlar.

Kanser-Bağışıklık Döngüsünü Çoğaltmak için İn Vitro Sistemlerde Ko-Kültür

Burada, mikrofizyolojik bir sistemde kollajen ve kollajen-agaroz matrisleri kullanarak 3D hücre kültürlerinin uygulanması için talimatları detaylandıran protokoller sunuyoruz. Bu protokoller, renal proksimal tübül ve renal hücreli karsinom sferoidlerinin ko-kültürünü destekleyerek in vivo koşulları simüle eder ve böbrek kanseri hücre etkileşimlerinin ileri düzeyde araştırılmasını sağlar.

Böbrek Kanseri İlerlemesini Modellemek için Renal Sağlıklı ve Tümör Epitelinin Mikroakışkan Ko-kültürü

Kanser metastazını incelemek için heteroselüler karışmayı yakalayan 3D kanser modellerine kritik bir ihtiyaç vardır. Çalışmamız, invazyon ve hücresel mekansal dağılımları incelemek için kullanılabilecek iskele ve iskelesiz bir ortamda heteromultisellüler stromal-epitel oluşumunu sunmaktadır.

İstilayı Yönlendirmek İçin Epitelyal Kanser Hücrelerinin İskelesiz 3D Kültürlerinde Heteromultihücreli Stromal Hücreler

Öğrenin tümör mikroçevresini taklit eden basit bir in vitro kookültür modeli ile hücre popülasyonlarını zenginleştirmeyi ve hücreler arası iletişimi incelemeyi. Bu yöntem kanser ve radyobiyoloji araştırmalarında değerli bir araçtır.

Tümör mikroçevresinin A Mimik: Hücreler arası İletişim Zenginleştirilmiş hücre popülasyonları oluşturma ve incelenmesi için Basit Bir Yöntem (Video) | JoVE Journal

Tümör mikroçevresinin A Mimik: Hücreler arası İletişim Zenginleştirilmiş hücre popülasyonları oluşturma ve incelenmesi için Basit Bir Yöntem

Daha fazla video keşfet