İnsan Kan BOS Bariyer A Koroid Pleksus Epitel Hücre bazlı Modeli bazolateral Side Bakteriyel Enfeksiyon Eğitim için

Bu yöntemin genel amacı, insan kan-beyin omurilik sıvısı bariyerinin koroid pleksus epitel hücresi tabanlı bir modelini oluşturmaktır. Bazal-lateral taraftan bakteriyel enfeksiyonların incelenmesini sağlamak. Bu yöntem, koroid pleksus epiteli ile bakteriyel etkileşimler sırasında hangi süreçlerin dahil olduğu gibi Merkezi Sinir Sisteminin bulaşıcı hastalıkları hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, patojenlerin epitel hücrelerinin bazal lateral siyah tarafı ile etkileşimlerinin analizine izin vermesidir. Bu yöntem aynı zamanda, koroid pleksus epiteli boyunca bağışıklık hücrelerinin ve tümör hücrelerinin transgrasyonunun araştırılması gibi diğer çalışmalara da uygulanabilir. Bu yöntem için insan korkoid pleksus papillomasını veya HIBCCP hücrelerini kullanma fikri ilk olarak Shibata et.al'ın 2005 el yazmasını okuduğumda aklıma geldi.

hücre çizgisini tanımlamak. 0.33 santimetre kare büyüme alanlı hücre kültürü filtre eklerini yerleştirmek için steril forseps kullanarak, üç mikron boyutunda gözenekler baş aşağı on iki oyuklu bir plakanın ayrı oyuklarına yerleştirerek başlayın. Daha sonra, serolojik bir pipetle, kuyuyu önceden ısıtılmış ortamın yaklaşık üç mililitresi ile doldurun ve alt bölme dolana kadar herhangi bir ekstra çözeltiyi aspire edin.

Daha sonra, filtrenin üstüne yüzde on FCS ile desteklenmiş 100 mikrometre 37 derece alt kültür ortamı ekleyin. Ortamı eklerken, kabarcıklar hücrelerin yeterince beslenmesini önleyeceğinden, hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek çok önemlidir. Ortam tüm eklere eklendiğinde, plakayı kapatın ve ekleri 37 santigrat derece yüzde beş CO2 inkübatöre aktarın.

Şimdi, bir şişe HIBCPP hücresi on mililitre PVS ile, iki kez dönerek yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, hücrelere üç mililitre yüzde 0.25 tripsyn EDTA ekleyin ve şişeyi döndürün. Ardından, hücreleri yaklaşık yirmi dakika inkübe edin.

İnkübasyonun sonunda, hücrelerin şişenin dibinden kalktığını ve yuvarlak bir şekil gösterdiğini onaylayın. Hücreler birbirinden tamamen ayrılmazlar ve genellikle aglomeralarda bulunurlar. Reaksiyonu durdurmak için kültürü 17 mililitre ortam ile yeniden askıya alın ve süspansiyonu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Daha sonra, hücreleri döndürün ve peleti saymak için uygun bir hacimde yeniden askıya alın. Daha sonra, hücreleri mililitre konsantrasyonda bir kez on ila altıncı hücreye seyreltin ve hücreleri eşit şekilde dağıtmak için tüpü ters çevirin. Ardından, her bir filtre ekinin üstüne 80 mikro litre hücre ekleyin.

Tüm ekler tohumlandığında, plakayı örtün ve gece boyunca kültür için inkübatöre geri koyun. Ertesi gün, 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bir mililitre orta ekleyin. Daha sonra, forseps kullanarak, her bir eki kaldırın ve içindeki ortamı atın, ekleri sağ tarafı yukarı bakacak şekilde 24 oyuklu plakanın ayrı oyuklarına yerleştirin.

Filtre ekleri 12 oyuklu plakadan 24 oyuklu plakaya çevrildiğinde, hücreler üstte büyürken filtre zarına dokunmamaya dikkat edin. Ekleri 0,5 mililitre taze ortamla doldurun ve plakayı inkübatöre geri koyun. Ekleri her iki günde bir taze besiyeri olan 24 oyuklu yeni bir plakaya aktarın, böylece ortamı üst bölmeye yerleştirin.

Hücrelerin trans-epitelyal elektrik direncini veya TEER'ini ölçmek için, önce bir epitel dokusu volt-ohm metrenin elektrot uçlarını yüzde 80 etanole daldırın. 15 dakika sonra, elektrotun kurumasını sağlamak için elektrodu etanolden çıkarın. Ardından, uçları 15 dakika daha bir alt kültür ortamının alikotuna yerleştirin.

Elektrot dengelendiğinde, daha uzun kolu, hücre kültürü plakasının bir oyuğunun alt bölmesinin altına değecek şekilde ve daha kısa kolu, filtre ekleme bölmesine ulaşacak şekilde konumlandırın. Boş değerleri elde etmek için hücresiz ortamda hücre kültürü filtre eklerinin direnç değerlerini ölçün. Ardından, tohumlanmış eklerin her birinin TEER'sini ölçün.

Ölçümden sonra, elektrodu 15 dakika boyunca yüzde 80 etanole geri yerleştirin, ardından kuru bir tüpte saklayın. HIBCPP tohumlu eklerin TEER değerleri santimetre kare başına 70 ohm'u aştığında, mililitre insülin başına beş mikro gram ve yüzde bir FCS ile desteklenmiş taze kültür ortamı kullanarak ortamı yenileyin ve plakayı gece boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Insert kültürlerinin paraselüler geçirgenliğini belirlemek için, her bir insertin üst filtre bölmesine taze serum düşük kültür ortamında mililitre başına 50 mikrogram taze hazırlanmış FITC-inülin ekleyin ve hücreleri inkübatöre geri koyun.

Kültürler santimetre kare başına yaklaşık 500 ohm'luk bir TEER'e ulaştığında, hücreleri onluk bir enfeksiyon çokluğunda ilgilenilen bir bakteri süspansiyonu ile enfekte edin ve hücreleri uygun kültür periyodu için inkübatöre geri koyun. Ardından, filtreyi bir mililitre serumsuz ortam ile yeni bir kuyuya aktararak hücreleri üç kez yıkayın. Her seferinde, ortamı aynı ortamdan 500 mikro litre ile filtre bölmesine yerleştirin, son olarak, her bir hücre kültürü filtre ekinin alt kuyusundan ortam örnekleri toplayarak bakteriyel enfeksiyondan sonra filtre bölmesinden hücre tabakasından geçen inülin konsantrasyonunu belirleyin ve tüm örnekleri bir mikro plaka okuyucuda on bir ve iki FITC-inülin standart dilüsyonuna karşı ölçün.

HIBCCP hücreleri, moleküler değişimlerini mütevazı bir dereceye kadar kısıtlamalarını sağlayan spesifik bariyer fonksiyonları sergiler. Örneğin, protein, ZO-1, Occludin ve Claudin-1 ile ilişkili tip bağlantısının immünofloresan analizleri, hücreden hücreye temas bölgelerinde kesintisiz bir sinyal ortaya çıkarır. Hücrelerin birbirine bağlılığını, sürekli sıkı bağlantı iplikleri ile göstermek.

Uygun koşullar altında kültürlendiğinde, HIBCPP hücreleri, kan-beyin omurilik sıvısı bariyerinin tipik bariyer fonksiyonlarını koruyarak, tedavi edilmeden santimetre kare başına yaklaşık 500 ohm'a ulaşan yüksek bir zar potansiyeli gösterir, Bir zar potansiyelinin oluşumu gibi, makro moleküller için düşük geçirgenliğin yanı sıra. Bununla birlikte, artan DMSO konsantrasyonları uygulandıkça, TEER değerleri doza bağlı bir şekilde azalır ve Cytochalasin D tedavisinden sonra gözlenen TEER değerinde benzer önemli bir düşüş olur. Dahası, yüzde iki hacim DMSO veya Cytochalasin D'nin eklenmesi, FITC-inülin akısı için karşılık gelen önemli bir geçirgenlik artışı ile sonuçlanır.

Ayrıca, HIBCCP hücrelerinin bakteriyel enfeksiyonu, hücre tabakasının iki patojenik bakteri suşu tarafından önemli ölçüde istila edilmesine neden olur. MC58 ve kapsül eksikliği olan mutantı. Oysa apatojenik alfa 14 suşu için sadece küçük bir invazyon gözlenir.

Bu prosedürü denerken, hücreleri tohumladıktan sonra filtre zarına dokunmamayı unutmamak önemlidir, çünkü sağlam HIBCCP tabakası temas tarafından bozulacaktır. Bu prosedürü takiben, koroid pleksus epitel hücreleri boyunca bağışıklık ve tümör hücresi göçü mekanizmaları hakkında ek soruları yanıtlamak için vitro transmigrasyon testleri gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, farmakoloji alanındaki araştırmacıların, in vitro olarak koroid pleksus epiteli boyunca substratların transferini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, patojenlerle bazal lateral enfeksiyon için kan-beyin omurilik sıvısı bariyerinin HIBCCP hücre bazlı bir modelinin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız. İnsan patojenleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun bir güvenlik başlığı altında çalışmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.