Name: Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Keşfedin, yüksek verimli gerçek zamanlı çift okuma testi ile hücre içi bakteri patojenlerine karşı ökaryotik hücre penetrant antimikrobiyalleri belirleme ve sitotoksisite değerlendirme yöntemini. Bu teknik, zararsız bilesiklerin eş zamanlı tespitini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu yazıda bildirilen araştırma içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır Jek ödül numarası R01AI099122 altında Allerji ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Enfeksiyon Hastalıkları Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen ve mutlaka Ulusal Enstitüsü resmi görüşlerini temsil etmemektedir Sağlık. Biz ICCB-Longwood Eleme Tesisi ve / veya Ulusal Tarama Laboratuarı için Jennifer Smith, David Wrobel, Su Chiang Doug Flood, Sean Johnston, Jennifer Nale Stewart Rudnicki Paul Yan Richard Siu ve Rachel Warden teşekkür etmek istiyorum Mükemmellik New England Bölge Merkezleri biyosavunma ve geliştirme ve yüksek verimli tarama deneyleri performans onların yardım için (U54AI057159 tarafından desteklenen) Bulaşıcı Hastalıklar Gelişen. Biz de yazının yararlı yorumlar için Kenneth P. Smith teşekkür etmek istiyorum.

1. Gerçek Zamanlı Hücre içi Büyüme ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite Tahlili <ol><li> Hazırlama Konukçu Hücreler (J774A.1 Hücreleri) <ol><li> % 9 demir takviye buzağı serumu RPMI 1640 içinde süspansiyon kültür J774A.1 Mus musculus makrofaj benzeri hücre. doku kültürü şişelerinde İlk geçit. Hücreler ortam içinde 15 ml 75 cm 2 doku kültürü şişesi içinde Biraraya getirilen sonra 15 ml doku kültürü şişesi döndürülür ve 50 mi aktarıldığı ortamı aynı tip, 65 ml kazıma ve seyreltme ile bölünmüş 250 ml&#39;lik bir bakteriyel çalkalayıcı şişeye. </li><li> 250 ml ve / veya doku kültür ortamı ile beşte biri hacime kadar doldurulmuş 1.000 mi bakteriyel şişelerinde süspansiyon içinde ölçek büyütme, kültür için. Dakikada yaklaşık 120 devirde dönme hızı ayarlanarak havalandırınız. Istikrarlı büyüme için tam% 5 CO 2 ve 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bunlar aralığında yoğunluğa ulaşmak Hasat hücreleri 2.5 x 10 6 hücre/ 5 x 10 6 hücre / ml aralığındadır. ölü hücreler sitotoksisite deneylerinde arka plan gürültüsünü artacak olarak,% 25 geçmemesi (en kolay Tripan mavisi ile test) ölü hücre yüzdesini emin olun. </li><li> Beyaz levha, doku 384 oyuklu mikro 30 ul doku kültürü ortamında 5 x 10 4 J774A.1 hücre göz başına, kültür-işlemden geçirildi. Deney gününde% 90 izdiham elde etmek için mikro gece boyunca inkübe edin. </li></ol></li><li> Hazırlama Işıklı veya Floresan Legionella pneumophila <ol><li> Passage L. pneumophila (Lp02 :: Flaa :: lüks 8) uygun ortamda bakteriler, yani tamponlu kömür maya özütü (BCYE) orta. Bir timidin okzotrofik suşu kullanılarak durumunda, 100 ug / ml timidin ile orta tamamlar. konfluent elde etmek için yeni bir BCYE plaka üzerinde kalın organizmaların yayılması ve (donmuş stoktan ise) (önceki plaka geçidinden ise) bir gün kuluçka ya da iki üç gün ile deneyler için bakteri yamaları hazırlayınbüyüme. <ol><li> 10 g maya ekstresi, 10 g N çözülmesiyle BCYE tabak hazırlayın - HPO 4- (2-asetamido) -2-aminoetansülfonik asit, 0.35 g K 2 ve deiyonize su 950 ml içinde 1 g monobazik potasyum α-ketoglutarat. Potasyum hidroksit (11.9 mol çözeltisi ≥2.5 mi) ile pH 6.9 olacak şekilde ayarlanır. </li><li> 15 g agar ve 2 g aktif kömür ilave et; 1 L nihai hacme getirmek. Manyetik bir karıştırma çubuğu ve otoklav ekleyin. 55 ° C&#39;ye soğutun, orta ve deiyonize su içinde çözülmüş 0,4 g L-sistein ve 0.42 g amonyum demir (III) sitrat ihtiva eden ilave filtre ile sterilize edilmiş çözeltiler. Petri plakaları dökme önce karıştırmak için mıknatıs karıştırma plakası kullanın. </li><li> Aksenik büyüme ortamında L. pneumophila büyüme testi için, kömür dışında BCYE için kullanılan bütün kimyasal reaktifler birleştirerek ACES-maya özü suyu (AYE) hazırlamak ve ağar. Filtre sterilize ve hemen kullanmak, ya da daha sonra deneyler için dondurma. </li></ol></li><li> sa süspanse organizmalarUygun şekilde, 100 ug / ml timidin takviyesi ile J774A.1 hücreler için kullanılan me doku kültürü ortamı. </li></ol></li><li> makrofaj Enfeksiyon <ol><li> (Bakteri üremesi inhibisyonunun ve ökaryotik hücre erimesi açısından tarama bileşikleri ve pozitif ve negatif kontroller) çıkar test bileşiklerinin ekleyin. Tercihen, aracın yeterli seyreltme sağlamak için DMSO (dimetil sülfoksit) veya sulu bir çözelti içinde ≥500x de stok solüsyonları çözülür. <ol><li> stok çözeltileri donmuş olarak muhafaza edilmesi de, kararsız bileşikler ve antibiyotiklere donma-erime döngülerinden kaçınmak. </li></ol></li><li> Doku kültür ortamı içinde 2.5 x 10 6 CFU (koloni oluşturucu birim) / m ve flüoresan raportör etiketli bakteriler 1.0 x 10 7 cfu / ml hedef ve uygun, toksik olmayan, membran geçirgenliği olmayan nükleik asit- eklemek için ışık yayan bakterilerin seyreltin 2.5x nihai deney konsantrasyonu boya bağlama. </li><li> her bir J774A.1 kültür karışımı 20 ul ekle, nihai deney hacmi50 ul nihai bakteri konsantrasyonu 1 x 10 6 CFU / ml (lux operon raportör) veya 4 x 10 10 6 CFU / ml (floresan protein raportör). </li><li> % 100 CO 2 5% 1-3 gün boyunca 37 ° C&#39;de buharlaşan kenar etkileri önlemek için bağıl nemi inkübe edin. </li></ol></li><li> Tahlil Okuma <ol><li> gazetecilere için uygun olarak bir mikroplaka luminometresiyle ve florimetrede bakteriyel büyüme ve ökaryotik hücre toksisitesini Oku kullanılır. <ol><li> termal (yaklaşık 10 dakika boyunca ya da kapaklı bir biyolojik güvenlik kabini kapalı olarak) yaklaşık 20 dakika boyunca aralık kapaklı bir laboratuar tezgah üzerinde tek kat olarak yerleştirme öncesinde lüminesans okuma mikropleytin denge, sıcaklık ilişkili kenar etkileri önlemek için. </li></ol></li><li> Daha sonra zaman noktalarında gerçek zamanlı okuma isteniyorsa inkübatör için mikropleytin dönün. </li></ol></li></ol> 2. Veri Analizi <ol><li> Pozitif ve negatif con veri normalleştirmekTrols ökaryotik hücrelerin hücre içi bakteriyel büyüme ve yüzde sitotoksisite için yüzde veya kat-engellenmesini hesaplamak için. </li><li> P + n u u | 3 (σ P + σ n) / - deney sağlamlığını değerlendirmek için, = 1 &#39;Z analiz Z-faktörü (Z)&#39; kullanılarak bakteri büyümesi inhibisyonu ve sitotoksisite hem de pozitif ve negatif kontroller arasındaki istatistiksel ayırma hesaplamak |. Bu denklem, σ p ve σ n, sırasıyla pozitif ve negatif kontrol kuyuları, standart sapmaları göstermektedir; μ p ve u n, sırasıyla, pozitif ve negatif kontrol kuyuları için ortalama değerlerdir. <ol><li> yüksek verimli tarama deneyleri için, ilgi konusu test bileşiklerinin etkilerini değerlendirmek için standart z değerleri (ya da diğer bir alternatif, kantitatif istatistiksel ölçümleri) hesaplar. Alternatif olarak, basit bir kat azalma hesaplamak veya daha alakalı potansiyel fizyolojik olarak azalma kat log<html> geometrik kopyalayan bakteriler için etki büyüklüğü ölçüsü. </li></ol></li></ol> 3. Tek ve Çok boyutlu (yani, Sinerji) Doz-yanıt Test ve Veri Yorumlama <ol><li> Protokol 1. bölümde tarif edildiği gibi makrofajların ve bakteri hazırlayın. </li><li> Hemen önce enfeksiyon veya aksenik inkübasyon (yani minimal inhibitör konsantrasyon veya MIC) ve düşük yüksek ucunda yayılarak amacı ile, seyreltme serisi iki katına, bir seri tamamen büyümeyi ortadan kaldıran bir konsantrasyon deneysel ilgi antimikrobiyal eklemek belirgin bir aktivite gösteren bir son konsantrasyona. </li><li> üreticinin protokolüne göre bir antimikrobiyal dilüsyonları doğrudan otomatik ilavesi ile tek doz-yanıt ve kombinatoryal sinerji testi kurulumu kolaylaştırmak için otomatik bir sıvı taşıma sistemi kullanın. </li><li> Örneğin, alt-katlama seyreltileri kullanılması düşünülebilir841 / 54841eq1.jpg &quot;/&gt; - seyreltme serisi katlayın ve tahlil verilerinin doğruluğu ve tekrarlanabilirliği artırmak için çoğaltır. </li><li> Makrofaj Enfeksiyon için, ışık yayan bakterilerin doku kültür ortamı içinde 2.5 x 10 6 CFU (koloni oluşturucu birim) / ml hedef seyreltin. Her bir J774A.1 kültür, nihai deney hacmi 50 ul, nihai bakteri konsantrasyonu, 1 x 10 6 CFU / mL karışımın 20 ul ekle; ve% 100 nispi nemde,% 5, 37 ° C&#39;de CO2 inkübe edin. <ol><li> Aksenik büyüme testi için, hay ortamı içinde, 1 x 10 6 CFU / ml&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar ışık yayan bakterilerin seyreltilmesi 384 oyuklu plakanın her oyuğuna 50 ul% 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de inkübe % 100 nispi nemde. </li></ol></li><li> Bakteri büyümesini inhibe antimikrobiyal kombinasyonlar için fraksiyonel inhibitör konsantrasyonu endeksi hesaplayın. Bakteriyel g tam veya&gt;% 99 inhibisyon ile sonuçlanır kombinasyon halinde her bir ilaç (a, b,. n.) içinrowth, (FIC A, B, n,...), ayrı ayrı, kesirli önleyici konsantrasyon hesaplanması aşağıdaki gibidir: FIC a = bileşiğinin konsantrasyonu &quot;bir&quot; minimal inhibitör konsantrasyonu ile bölünen, &quot;a&quot; tek başına. . Sonra birleştirici FIC indeksi hesaplamak veya vb FIC b hesaplamak, aynı formül kullanılarak <img alt="denklem 2" src="/files/ftp_upload/54841/54841eq2.jpg" /> FIC FIC a + b + FIC =. . Her bir inhibitör kombinasyon için .FIC n. <ol><li> sinerjiyi değerlendirmek için 1.0 ila uzağa sapma kombinatoryal endeksi kullanın. tutucu bir sinerjistik etkinin göstergesi ve ≥ 4, bir antagonist etki olarak ≤ 0.5 bir kesim düşünün. 12 </li><li> Konu, isobolograms isocontour isobolograms ve / veya isosurface kombinasyon etkileri 6 alternatif grafik temsilleri isobolograms. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Garzoni, C., Kelley, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus%3A+new+evidence+for+intracellular+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus: new evidence for intracellular persistence.</a> Trends Microbiol. 17 (2), 59-65 (2009).</li>
<li>Rosen, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+an+intracellular+bacterial+community+pathway+in+Klebsiella+pneumoniae+urinary+tract+infection+and+the+effects+of+FimK+on+type+1+pilus+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression.</a> Infect Immun. 76 (7), 3337-3345 (2008).</li>
<li>Blango, M. G., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+uropathogenic+Escherichia+coli+in+the+face+of+multiple+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Persistence of uropathogenic Escherichia coli in the face of multiple antibiotics.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54 (5), 1855-1863 (2010).</li>
<li>Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+impermeant%2C+DNA-binding+dye+fluorescence+as+a+real-time+readout+of+eukaryotic+cell+toxicity+in+a+high+throughput+screening+format%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format.</a> Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 219-228 (2014).</li>
<li>Edelstein, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+chemotherapy+for+legionnaires%27+disease%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial chemotherapy for legionnaires' disease: a review.</a> Clin Infect Dis. 21 Suppl 3, S265-S276 (1995).</li>
<li>Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Intracellular+Antimicrobial+Susceptibility+Testing+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Intracellular Antimicrobial Susceptibility Testing of Legionella pneumophila.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (12), 7517-7529 (2015).</li>
<li>Pedro-Botet, L., Yu, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella%3A+macrolides+or+quinolones%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Legionella: macrolides or quinolones?</a> Clin Microbiol Infect. 12 Suppl 3, 25-30 (2006).</li>
<li>Coers, J., Vance, R. E., Fontana, M. F., Dietrich, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+of+Legionella+pneumophila+growth+in+macrophages+requires+the+concerted+action+of+cytokine+and+Naip5%2FIpaf+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Restriction of Legionella pneumophila growth in macrophages requires the concerted action of cytokine and Naip5/Ipaf signalling pathways.</a> Cell Microbiol. 9 (10), 2344-2357 (2007).</li>
<li>Chu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+intravital+imaging+of+cellular+differentiation+with+a+bright+red-excitable+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Non-invasive intravital imaging of cellular differentiation with a bright red-excitable fluorescent protein.</a> Nat Methods. 11 (5), 572-578 (2014).</li>
<li>Eliopoulos, G. M., Moellering, R. C. Ch. 9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEliopoulos%2C+GM+%22Antimicrobial+combinations.+In%3A+Antibiotics+in+Laboratory+Medicin%22">Antimicrobial combinations. In: Antibiotics in Laboratory Medicin</a>. Lorian, V. , Williams and Wilkins. 330-396 (1996).</li>
<li>Jones, R. E., Zheng, W., McKew, J. C., Chen, C. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+direct+compound+dispensing+method+using+the+HP+D300+digital+dispenser%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">An alternative direct compound dispensing method using the HP D300 digital dispenser.</a> J Lab Autom. 18 (5), 367-374 (2013).</li>
<li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy%2C+antagonism%2C+and+what+the+chequerboard+puts+between+them%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> J Antimicrob Chemother. 52 (1), (2003).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li>
<li>Berger, K. H., Merriam, J. J., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+intracellular+targeting+properties+associated+with+mutations+in+the+Legionella+pneumophila+dotA+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Altered intracellular targeting properties associated with mutations in the Legionella pneumophila dotA gene.</a> Mol Microbiol. 14 (4), 809-822 (1994).</li>
<li>Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+defects+in+intracellular+growth+complemented+by+a+single+genetic+locus+in+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila.</a> Mol Microbiol. 7 (1), 7-19 (1993).</li>
<li>Vogel, J. P., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of Legionella pneumophila.</a> Curr Opin Microbiol. 2 (1), 30-34 (1999).</li>
<li>Kirby, J. E., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionnaires%27+disease%3A+the+pore+macrophage+and+the+legion+of+terror+within%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Legionnaires' disease: the pore macrophage and the legion of terror within.</a> Trends Microbiol. 6 (7), 256-258 (1998).</li>
<li>Kirby, J. E., Vogel, J. P., Andrews, H. L., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+pore-forming+ability+by+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evidence for pore-forming ability by Legionella pneumophila.</a> Mol Microbiol. 27 (2), 323-336 (1998).</li>
<li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279 (5352), 873-876 (1998).</li>
<li>Song, H., Fares, M., Maguire, K. R., Sidén, A., Potácová, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+Effects+of+Tetracycline+Analogues+%28Doxycycline%2C+Minocycline+and+COL-3%29+in+Acute+Myeloid+Leukemia+HL-60+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic Effects of Tetracycline Analogues (Doxycycline, Minocycline and COL-3) in Acute Myeloid Leukemia HL-60 Cells.</a> PLoS ONE. 9 (12), e114457(2014).</li>
<li>Isberg, R. R., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+genetic+locus+encoded+by+Yersinia+pseudotuberculosis+permits+invasion+of+cultured+animal+cells+by+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single genetic locus encoded by Yersinia pseudotuberculosis permits invasion of cultured animal cells by Escherichia coli K-12.</a> Nature. 317 (6034), 262-264 (1985).</li>
<li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+in+vitro+cytotoxicity+assays+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development.</a> Expert Opin Drug Discov. 3 (6), 655-669 (2008).</li>
<li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+viability+and+cytotoxicity+testing+and+same-well+multi-parametric+combinations+for+high+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Chem+Genomics%22%5BJournal%5D)">In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening.</a> Curr Chem Genomics. 3, 33-41 (2009).</li>
<li>Mayr, L. M., Bojanic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+trends+in+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Novel trends in high-throughput screening.</a> Curr Opin Pharmacol. 9 (5), 580-588 (2009).</li>
<li>Dunlap, P. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDunlap%2C+P+%22Bioluminescence%3A+Fundamentals+and+Applications+in+Biotechnology+-+Volume+1%22">Bioluminescence: Fundamentals and Applications in Biotechnology - Volume 1</a>. Thouand, G., Marks, R. 1, Springer. 37-64 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu hücre içi bakteriyel büyüme ve konakçı hücre sitotoksisite eş zamanlı olarak saptanması için gerçek zamanlı analizler açıklanmaktadır. Protokolde birkaç kritik adımlar vardır. İlk olarak, sağlam tahlil performansı için, bakteri ve sitotoksisite okumalarla arasında yeterli spektral ayırma olmalıdır. Bu ayırma lusiferaz operon muhabir ve floresan DNA bağlayıcı boyaların kombinasyonlar için esastır. Bununla birlikte, deneyim (Tablo 1-3, Şekil 2), çift kullanımına dayanan, floresan okuyu...

Hücre içi bölümlerinde geçici büyümek veya ikamet patojenler terapötik tedavisi zordur. Zorlayıcı yada nispeten gibi Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp gibi hücre içi patojenler zorunlu. Francisella tularensis ve Mycobacterium spp. genellikle aylar hatta yıllar arasında değişebilir tedavisi için antibiyotik tedavisi ders uzamış gerektirir. Ayrıca, hücre dışı patojenler geçici hücre içi nişler işgal ve bu şekilde antimikrobiyal tedavinin normal kurslar açıklığı kaçmak ve daha sonra öldürücü enfeksiyon yeni mermi başlatmak için ortaya çıkabilir. Staphylococcus aureus 1 ve üropatojenik Enterobacteriaceae 2,3 enfeksiyonları iki giderek tanınan örneklerdir. Bu nedenle, temel bir ilaç keşif hedefi hücre içi bölmelere nüfuz yeni antimikrobiyal tespit etmektir. Optimal tedavi hızla ortadan kaldırmak içinhücre içi organizmalar ve alt önleyici antimikrobiyal maruz kalma yoluyla direnç gelişmesini önlemek, özellikle tercih edilir. Bu amaçla, biz modeli patojen Legionella pneumophila hücre içi büyüme hedefleyen hücre içi sızan antimikrobiyallerin tanımlamak için bir yüksek verimli bir tarama teknolojisini geliştirdi. 4 Önceki klinik gözlemler, standart antimikrobiyal duyarlılık testi doğru bu organizmaya karşı in vivo terapötik etkinlik tahmin etmediğini göstermektedir. Bu β-laktamlar ve aminoglikozid olarak antimikrobik temel sınıfları, aksenik biçimde yetiştirilen Legionella karşı son derece etkili olmasına rağmen, yeterli Legionella bulunan hücre içi nüfuz çünkü 5 Özellikle, bu oldu. 5,6 Daha sonra delil teknik olarak daha karmaşık hücre içi büyüme analizleri etkili bir klinik etkinliğini tahmin önerdi. 7 </sup&gt; Ne yazık ki, bu deneyler koloni oluşturan birim sayımı için farklı zamanlarda noktalarında parçalanması gereken antimikrobik tedavi edilen enfekte makrofajlar, gerektiren son derece zahmetli uç noktaları deneyleri idi. Bu gibi deneyler, büyük ölçekte yapılacak pratik değildir ve yüksek verimli ilaç keşfi için uygun değildir. Bu nedenle, hücre içi bakteri büyümesine, gerçek zamanlı saptanması için teknoloji geliştirilmiştir. 6 Bu bakteriyel kromozoma 4 ya da floresan proteini (daha önce tarif edilen, birinci kuşak deneyi) ya da bakteriyel lusiferaz operon 8 entegrasyonu ile modifiye edilmiş bir bakteri suşu kullanılarak 9 muhabir (burada tarif edilen ikinci kuşak, dik deney) gerçekleştirilmiştir. Bu şekilde, ışık veren veya flöresanlı bir sinyal bakteriyel sayısının bir taşıyıcı, gerçek zamanlı olarak okunmasını sağlar. Ancak, bu nitelikler hücre içi infectio büyük bir karıştırıcı adresi yokn deneyleri, konakçı hücreler üzerinde hedef dışı etkiler. Özellikle, konakçı hücre ölümü doğal hücre büyümesini sınırlar ve antimikrobiyal etki yanlış pozitif bulmaktır. Tarama kütüphanelerinde olduğu gibi birçok bileşik ökaryotik hücre toksik, böyle yanlış pozitif takipte, çözüm için son nokta sitotoksisite deneyleri çok sayıda gerektiren, gerçek antimikrobiyal korkutur olacağını vardır. Bu durumda, aynı anda ökaryotik hücre canlılığı ve hücre içi büyümeyi değerlendirmek mümkün büyük ilgi olmuştur. Özellikle, canlı olmayan ökaryotik hücrelerin karakteristik hücre zarı bütünlüğünün kaybıdır. hücre membranının geçirgenliği test probları, bu nedenle, hücre canlılığını değerlendirmek için de kullanılabilir. Daha önce ulaşmak ve ölü hücrelerin nükleer DNA leke putatif hücre zan-geçirgen olmayan, floresan, DNA bağlayıcı boyaların bir dizi becerisi ile karakterize edilir. 4 nükleer DNA bağlayıcı, bu boyalar, kuantum bir büyük artışı gösterecektirArka plan çözüm floresan üzerinde artan sinyal sonuçlanan m floresan verim. Bu nedenle, bu boyalar, ökaryotik hücre ölümünün kantitatif okuma sağladı. 4 Özellikle, biz birkaç J774 makrofajlar ile uzun süreli işbirliği inkübasyon sırasında kendileri toksik olmayan olduğu bulundu. ilk enfeksiyon sırasında ilave zaman, gerçek zamanlı, mikroskopik bir mikro florimetre ile ölçülür ve gözlemlenebilir ökaryotik hücre ölümünün flüoresan okuması sağlamaktadır. Bu nedenle, bir bakteri muhabir ve toksik olmayan, zar geçirgenliği olmayan kullanımını birleştirerek, DNA bağlayıcı boyalar, biz bakteri yükü ve aynı zamanda ökaryotik hücre sitotoksisitesini hem ölçmek için basit, tahribatsız, gerçek zamanlı test geliştirmek başardık. Bu deney, US hücre içi büyümesini inhibe etme yeteneği için ~ de dahil olmak üzere fonksiyonel olarak karakterize edilmemiş aktivitesi 250 antimikrobiyal ve&gt; 240,000 küçük molekülleri 384 oyuklu plaka biçiminde ekran ~ 10,000 bilinen biyoaktif maddelerin sağladıLegionella pneumophila, aynı zamanda her bir bileşik için ökaryotik hücre sitotoksisite verileri oluştururken. Legionella hücre içi büyümeye karşı bilinen antimikrobiyal 6 Yaptığımız analizler bugüne kadar bu tip en kapsamlı araştırma oldu. 6 bir arada kullanıldığında, bizim deney formatının verimliliği göre, aynı zamanda, daha sonra bilinen antimikrobiyal potansiyel sinerjistik etkiler araştırdı. En yaygın sinerji testlerinin bir sözde dama deneyi, standart olarak iki ya da daha çok antimikrobik maddenin iki kat seri dilüsyonları kombinasyon etkilerinin değerlendirilmesi ile gerçekleştirilir. İki ya da daha çok antimikrobik madde, ayrı olarak uygulanan her etkilerin toplamından daha birlikte uygulandığında, bu deneylerde 10, sinerji daha etkisinin gözlenmesi ile tanımlanır. Unutmayın ki, şimdiye kadar, sadece odaklanmış ve seçici sinerji testi, hücre içi Legionella pneumophila karşı yapıldı </em&gt; gerekli birleştirici permütasyon ile çarpılır geleneksel uç nokta deneylerinde yer alan büyük bir çaba çünkü. Sinerji testi kolaylaştırmak için, otomatik dijital dağıtım teknolojisi 6 ile birlikte bizim gerçek zamanlı hücre içi büyüme / ökaryot sitotoksisite deneyi kullandı. Bu otomasyon DMSO veya sulu bir çözelti tek başına ya da 384-kuyucuklu bir biçimde kombine içinde çözülmüş bileşiklerinin seri seyreltmeleri dağıtmak için izin. 11 Ayrıca, bu tür sağlam sıvı taşıma teknolojisi kolayca daha yüksek çözünürlük gerçekleştirmek için bize izin, kare-kök-iki (yerine standart daha düşük çözünürlük, katlama), iki boyutlu olarak özgüllüğünün yüksek düzeylerine ulaşmak için seyreltme kombinasyonları, dama tahtası sinerji analiz. İki katlı bir seyreltme serisi 12 kullanırken bu çözünürlük tekrarlanabilirlik ilgili sinerji alanında endişeleri ele özellikle değerliydi. Son olarak, bizim tahlil nicel ve ayrıca therefore inhibisyon geçişleri ölçüldü. Bunun bir sonucu olarak, deney büyüme inhibisyonu benzer olan kombinasyon konsantrasyonları bağlantı isocontours olan isocontour isobolograms içinde eksprese önleyici tüm bilgileri, yakalanan. 6 Bu çizim stratejisi kombinatoryal doz-yanıt eğrilerinin görselleştirme sağladı. Bizim metodoloji göstermek için, bu analizleri gerçekleştirmek için bizim protokol tarif ve temsili sonuçlar göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>J774A.1 hücreleri</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>TIB-67</td><td>Konak hücre</td></tr><tr><td>ACES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9758&nbsp;</td><td>Tamponlu kömür mayası özütü agar ve tamponlu maya özü ortamı yapmak için</td></tr><tr><td>Maya özütü, ultra filtrelenmiş</td><td>Becton-Dickinson/Difco</td><td>210929</td><td>Tamponlu kömür mayası özü agar ve tamponlu maya özü ortamı yapmak için; daha düşük dereceler, Legionella'nın büyüme inhibitörlerine karşı büyümesinin bozulmasına ve/veya duyarlılığının değişmesine neden olabilir</td></tr><tr><td>Alfa-ketoglutarik asit, monopotasyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2000</td><td>Tamponlu kömür mayası özütü agar ve tamponlu maya özü ortamı</td></tr><tr><td>yapmak için Sodyum piruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td>Tamponlu kömür mayası özü agar ve tamponlu maya özü ortamı yapmak için</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat, dibazik</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>Tamponlu kömür mayası özü agar ve tamponlu maya özü ortamı yapmak için</td></tr><tr><td>L-sistein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7755</td><td>Tamponlu kömür mayası özü agar ve tamponlu maya özü ortamı</td></tr> <tr><td>yapmak içinAmonyum demir (III) sitrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5879</td><td>Tamponlu kömür mayası özütü agar ve tamponlu maya özütü ortamı yapmak için; Bunun yerine ferrik pirofosfat kullanılabilir, ancak doğru bir şekilde tartılması daha zordur</td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit çözeltisi, konsantre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SP236-500</td><td>Tamponlu kömür, maya özütü, agar ve tamponlu maya özü ortamı yapmak için</td></tr><tr><td>Deonize su</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Tamponlu kömür mayası özütü agar ve tamponlu maya özü ortamı yapmak için</td></tr><tr><td>Timidin (doku kültürü derecesi)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895</td><td>Hem RPMI 1640 hem de tamponlu maya ekstraktı agar / orta ve mdash'ı takviye etmek için daha düşük dereceli timidin ikincisi için kullanılabilir, ancak RPMI 1640'ta bozulmuş hücre büyümesine ve / veya hücre ölümüne neden olabilir</td></tr><tr><td>RPMI 1640, standart formülasyon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10-040-CV</td> aracılığıyla <td>Corning Kaplamadan önce J774A.1 hücrelerini büyütmek için; 2 mM L-glutamin içerir</td></tr><tr><td>RPMI 1640 fenol kırmızısı eksik</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-105-CV</td> aracılığıyla <td>Corning J774A.1 hücrelerini 384 kuyulu tabakta kaplamak için (kaplamadan önce büyüme için uygun değildir); ayrıca L-glutamin içermez ve kullanımdan önce 2 mM'ye kadar</td></tr><tr><td>takviye L-glutamin,% 0.85 NaCl'de 200 mM (doku kültürü derecesi)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30034.02</td> aracılığıyla <td>HyClone L-glutamin içermeyen RPMI 1640'ı takviye etmek için, 2 mM nihai konsantrasyona</td></tr><tr><td>kadar Demir takviyeli buzağı serumu</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>100-510</td><td>RPMI 1640'ı takviye etmek için, %9.1'e kadar nihai konsantrasyon</td></tr><tr><td>Tripan Mavisi çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>J774A.1 hücre yoğunluğunu sayarken hücre ölümü belirlemesi için</td></tr><tr><td>SYTOX Green, DMSO Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>S7020'de</td> <td>5 mM çözeltiFloresan okuma veya epifloresan mikroskobu (turuncu-kırmızı veya uzak kırmızı floresan bakteriler ile birlikte) ile J774A.1 hücre ölümü tayini için boyama için. 125 nM nihai konsantrasyonda kullanın.</td></tr><tr><td>Hücre kültürü inkübatörü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-255-26</td><td>J774A.1 hücrelerinin inkübasyonu için (hem enfeksiyondan önce hem de sonra); bakterilerin inkübasyonu için de kullanılabilir veya bunun yerine standart bir atmosfer inkübatörü kullanılabilir)</td></tr><tr><td>Orbital çalkalayıcı</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-01010</td><td>Enfeksiyondan önce J774A.1 hücrelerinin çalkalama inkübasyonu için; hücre kültürü inkübatörünün içine sığar; çalkalayıcı tabanı 7744-01000 ve tepsi 7740-01010 içerir (bunlar ayrıca temin edilebilir)</td></tr><tr><td>Çalkalayıcı şişeler (250 ml)</td><td>ChemGlass Yaşam Bilimleri</td><td>CLS-2038-04</td><td>Enfeksiyondan önce J774A.1 hücrelerinin çalkalama inkübasyonu için</td></tr><tr><td>Şişeler için çalkalayıcı kelepçeler (250 ml)</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16250</td><td>Çalkalama için, enfeksiyondan önce J774A.1 hücrelerinin inkübasyonu</td></tr><tr><td>Çalkalayıcı şişeler (1.000 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-07</td><td>Enfeksiyondan önce J774A.1 hücrelerinin çalkalama inkübasyonu için</td></tr><tr><td>Şişeler için çalkalayıcı kelepçeler (1.000 ml)</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16100</td><td>Enfeksiyondan önce J774A.1 hücrelerinin çalkalama inkübasyonu için</td></tr><tr><td>Şişeler için sünger köpük kapaklar (250 ml-1.000 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-1490-038</td><td>Enfeksiyondan önce J774A.1 hücrelerinin çalkalama inkübasyonu için; Standart metal kapaklara göre kontaminasyon riskini azaltır</td></tr><tr><td>MultiDrop Combi programlanabilir çok kanallı peristaltik pompa Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>5840300</td><td>J774A.1 hücrelerini, ortamı ve florofor içeren bakteri süspansiyonunu çok sayıda 384 kuyulu çanağa dağıtmak için</td></tr><tr><td>Kombi standart delikli manifold</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24072670</td><td>Varsayılan ön dağıtım hacmi 20 &# 956; l uzlaşmayı telafi etmek için yetersizdir &mdash; 80 &#956'ya artış; l</td></tr><tr><td>Beyaz 384 doku kültürü için tedavi edilmiş kuyu yemekleri</td><td>Corning</td><td>3570</td><td>Lüminesans ve floresan okumak için; Greiner kataloğu # 781080 ayrıca başarıyla test edildi</td></tr><tr><td>DMSO (kapalı ampullerde doku kültürü sınıfı)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Pozitif kontrol ve test bileşiklerini çözmek için</td></tr><tr><td>Azitromisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1088</td><td>Antibiyotik pozitif kontrol</td></tr><tr><td>Saponin (Quillaja kabuğundan)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S-4521</td><td>Sitoksisite pozitif kontrol</td></tr><tr><td>Çok kanallı pipetleyici</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Finnpipette</td><td>Sabit miktarlarda pozitif kontrol bileşiklerinin transferi için; pipetleyici, tekrarlayan sabit hacimli dağıtımı mümkün kılmak için mandallı dijital dağıtıma sahip olmalıdır</td></tr><tr><td>Epson pin transfer robotu</td><td>Epson/ICCB-L</td><td>(Özel ekipman)</td><td>Kütüphane dizilerinden sabit miktarlarda test bileşiklerinin transferi için</td></tr><tr><td>D300 dijital dağıtım sistemi</td><td>Hewlett-Packard Tecan</td><td>D300</td> <td>üzerinden11 pikolitre ile 10 & mikro arasında değişen değişken miktarlarda test bileşiklerinin transferi için; l</td></tr><tr><td>D300 dijital dağıtım sistemi için T8 + kartuşları</td><td>Hewlett-Packard via Tecan</td><td>T8 +</td> <td>Test bileşiklerini dağıtmak için</td></tr><tr><td>Bilgisayar bağlantılı dijital kameralı epifloresan mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>Ti</td><td>Canlı hücre görüntüleme için; herhangi bir standart floresan mikroskobu, faz kontrastı veya DIC optiği ile yeşil (floresen), turuncu-kırmızıdan kırmızıya (Texas Red) ve uzak kırmızı (Cy5) floresansı 100X yağ ile değiştirebilir en yüksek çözünürlük için objektif</td></tr><tr><td>Cam tabanlı doku kültürü kapları</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>Canlı hücre görüntüleme için. MatTek gibi çanaklar, ters epifloresan veya konfokal mikroskop kullanarak 600X veya 1.000X büyütmede mikroskobik görselleştirmeye izin verir. Bu özel çanaklar nominal çapı 3,5 cm, iç çapı 3,3 cm, alt kısımlarına 20 mm çapında #1,5 kalınlığında örtü astarları yerleştirilmiştir.</td></tr><tr><td>Photoshop CS6</td>, <td>Adobe</td><td></td><td>Adobe photoshop veya benzeri programlar, ışık, mikroskobik ve floresan görüntüleri sözde renklendirmek ve birleştirmek için kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Mathematica 10</td><td>Wolfam</td><td></td><td>İki boyutlu izokontur izobologramları ve üç boyutlu yüzey izobologramlarının üretilmesi için.</td></tr></tbody></table>

yüksek verimli, gerçek zamanlı, hücre içi antimikrobiyal aktiviteleri Çift okuma test ve Ökaryotik hücre sitotoksisite

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Hücre içi antimikrobiyal aktivite ve ökaryot hücre sitotoksisite geleneksel önlemler uç nokta deneyleri güveniyor. Böyle uç nokta tahlilleri gibi hücre erimesi, koloni oluşturan birim tespiti veya reaktif ilave olarak okunmasını önce birkaç ek deneysel adımlar gerektirir. Örneğin, yüksek verimli bir tarama sırasında deneyleri binlerce gerçekleştirirken, tahliller, bu tür için gerekli alt çaba dikkate değerdir. Bu nedenle, yüksek verimli bir antimikrobiyal keşif kolaylaştırmak için, eş zamanlı olarak hücre içi bakteri büyümesine nin inhibitörlerini teşhis etmek ve ökaryotik hücre sitotoksisitesini değerlendirmek için gerçek zamanlı bir tahlil geliştirilmiştir. Spesifik olarak, gerçek zamanlı olarak, hücre içi bakteri büyümesi tespit bakteriyel lux operon&#39;u (1. nesil tahlili) ya da floresan protein muhabir (2. nesil dik deney) ya da bakteriyel bir tarama suşları işaretleyerek sağlanmıştır. Toksik olmayan, hücre zan-geçirgen olmayan, nükleik asit bağlayıcı bir boyaAyrıca makrofaj ilk enfeksiyon sırasında ilave edildi. Bu boyalar, canlı hücreler dahil edilmemiştir. Ancak, cansız konakçı hücreler girişi ve nükleer DNA floresan etiketleme (deoksiribonükleik asit) izin membran bütünlüğünü kaybeder. Özellikle, DNA, konakçı hücre ölümünün bir çözelti bazlı okunmasını sağlar flüoresan kuantum verimi büyük bir artış ile ilişkili bağlama. Bu mikro-biçiminde bir yüksek girdi boyunca araştırma yapmak ve mikroskopla hücre büyüme ve sitotoksikliğinin değerlendirilmesi için bu kombine tahlili kullanılmıştır. Özellikle, antimikrobik birlikte uygulanır, iki ya da daha çok antimikrobik maddenin kombine etkisi ayrı uygulandığında daha büyük olan sinerji sergileyebilir. Farklı konsantrasyonlarda antibiyotik kombinasyon permütasyon değerlendirilmesi gerektiğini gibi hücre içi patojenlere karşı in vitro sinerji Test normalde olağanüstü bir iştir. Ancak, bizim gerçek zamanlı tahlil otomatik, dijital dağıtım teknolojisi p ile kombine bulunduuyduruk sinerji testi ermitted. Bu yaklaşımları kullanarak, sistematik hücre içi patojen Legionella pneumophila karşı karşıya antimikrobiyal çok sayıda eylem ve birlikte anket başardık.

Mikrolevha hücre büyüme deneyi Şekil 1 tahlil adımlarını diyagramları. gösterilen otomatik adımlar elle yapılabilir. Ancak, verim büyük ölçüde sıvı taşıma sistemleri kullanılarak kolaylaştırılır. Şekil 2, bir 384 gözlü mikroplaka, çift okuma, gerçek zamanlı hücre içi büyüme ve (Lp02) ya da lux operon (Şekiller 2A, <...

(1) hücre içi bakteriyel bir patojeni hedefleyen ökaryotik hücre penetran antimikrobiyalleri aynı anda tanımlamak ve (2) ökaryotik hücre sitotoksisitesini değerlendirmek için yüksek verimli, gerçek zamanlı bir test geliştirilmiştir. Daha sonra aynı teknolojideki bir varyasyon, kolay, yüksek çözünürlüklü, doz yanıtı ve iki ve üç boyutlu sinerji çalışmalarını mümkün kılmak için dijital dağıtım teknolojisi ile birleştirildi.

Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

Bu protokolün genel amacı, konak hücreler için toksik olmayan, hücre içi bakteriyel büyümeyi hedefleyen spesifik küçük molekül inhibitörlerini tanımlamak için tek bir kombinasyon gerçek zamanlı testi kullanmaktır. Bu yöntem, antimikrobiyal keşif alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Özellikle, konak hücreye zarar vermeden hücre içi kompartmanlara nüfuz edebilen ve patojenleri öldürebilen bileşik türleri nelerdir?Bu tekniğin temel avantajları, bakteriyel büyümenin ve memeli hücresi toksisitesinin tahribatsız, gerçek zamanlı analizler kullanılarak eş zamanlı olarak tespit edilmesidir. Genellikle, bu yöntemi yeni kullanan kişiler, yöntemin sunduğu ölçeklenebilirlik konusunda zorluk yaşayacaklardır. Bir oturumda on binden fazla bileşiğin analiz edilmesi, tamamen yeni bir teknik ve ekipman seti gerektirir.Lucius'a ek olarak, akademik antimikrobiyal keşfe ve translasyonel diyagnostik mikrobiyolojiye yönelik ortak bir bağlılık sergileyenler arasında doktora sonrası araştırmacılar KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn ve lisans öğrencisi Kat Truelson yer almaktadır. Konak hücreleri hazırlamak için, J774A. 1 makrofajlarını yüzde dokuz demir takvi

high-throughput-real-time-dual-readout-testing-intracellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu tümör hedef hücreleri ile inkübe zaman T hücrelerinin sitotoksisiteye ölçmek için bir tek hücreli yüksek verim tahlil açıklanmaktadır. Bu yöntem, mekansal olarak tanımlanan oranlarda T hücreler ve hedef hücrelerin sınırlandırmak için alt nanolitre kuyular (~ 100.000 kuyu / dizi) ve bir yoğun, elastomerik dizisi kullanır ve efektör-hedef konjugasyon ve daha sonra apoptoz izlemek için flüoresan mikroskop ile birleştirilmiştir.

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Bakteriyel biyolüminesans gen kasetinin ifade eden memeli hücreleri...

Sitotoksisite Sürekli ve gerçek zamanlı izlenmesi için özerk Bioluminescent Memeli Hücre

Burada tarif ve hücresel sitotoksisitesi bileşiklerin hızlı ve doğru tarama için izin tek tur enfekte edebilirlik analizleri, kendi hücresel sitotoksisiteye (CC 50) tespit etmek ve WT ve ilaç dirençli HIV-1 karşı IC50 değerleri.

HIV ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması

Geliştirilmiş in vitro nörotoksisite testleri, yeni nöroprotektif bileşiklerin tanımlanmasına yardımcı olacaktır. Nöronal hücre hatlarında sitotoksisite ve sitoproteksiyonu belirlemek ve ikinci haberci yolakların katılımını tanımlamak ve böylece nöroproteksiyon mekanizması hakkında bilgi kazanmak için gerçek zamanlı empedans tabanlı bir hücre analizörünün faydası sunulmaktadır.

Bir Nöronal Hücre Line Neurotoxicity ve nöro ilgilendim Moleküler Pathways Delineate bir aracı olarak Real-Time Empedans tabanlı Cell Analyzer

Tam kan sitotoksisite deneyi (WCA), flüoresans mikroskopisi ve otomatik görüntü işleme ile yüksek verimli hücre konumlandırma teknolojisini içeren tarafından geliştirilmiş bir sitotoksisite analizidir. Burada, bir anti-CD20 antikoru ile tedavi edilen lenfoma hücrelerinin enfekte hücre sitotoksisitesi analiz sağlamak için insan kanında gerçek zamanlı olarak analiz edilebilir açıklar.

İnsan Tüm Kan gerçek zamanlı sitotoksisite deneyleri

Bu hücre içi, Mycobacterium tuberculosis karşısında roman bileşiklerin bulunması hedefleme için ve in suyu memeli konakçı hücreye karşı bakteri hem de sitotoksisite büyüyen modüler yüksek verimli bir tarama sistemini geliştirdik.

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Yeni nesil anti-tüberküloz ilaçlar için erken ilaç geliştirme sürecini iyileştirecek yeni modeller ve testler oldukça arzu edilmektedir. Burada, Mycobacterium tuberculosis'e karşı ilaç etkinliğini değerlendirmek için yüksek verimli tarama için kolayca uyarlanabilen hızlı, ucuz ve BSL-2 uyumlu bir testi açıklıyoruz.

Bir Yüksek verim Uyumlu Deneyi Makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Genellikle kültürlü hücreler üzerinde bileşiklerin bir dizi potansiyel sitotoksisite değerlendirmek için gereklidir. Burada, 96-iyi formatında toksik bileşikler için güvenilir bir tarama stratejisi açıklar.

Düşük-Orta Throughput'ta Kültürlü Memeli Hücrelerinde Hücre Büyümesini ve SağkalımLarını Etkileyen Bileşikleri Belirleme Stratejisi

Protokol, hücresel canlılığı verimli bir şekilde belirlemek için hızlı, yüksek verimli, güvenilir, ucuz ve tarafsız bir testi tanımlar. Bu tahlil özellikle hücrelerin mitokondrisi hasar gördüğünde yararlıdır, bu da diğer tahlilleri bozar. Hoechst 33342 ve propidium iyodür - Tsay iki nükleer boya ile boyanmış hücrelerin otomatik sayma kullanır.

Mitokan Sitotoksisitesinin Doğru Tayini için Otomatik Diferansiyel Nükleer Boyama Denemesi

Burada, tek hücre düzeyinde hücre öldürmeyi incelemek için bir T hücresini ve bir kanser hedef hücresini kapsülleyen çift emülsiyon damlacıkları oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, büyük bir T hücresi popülasyonu içinde hem sitotoksik moleküllerin hem de hedef hücre apoptozunun ikili miktar tayinine izin verir.

Kimerik Antijen Reseptörü T hücrelerini Tek Hücre Düzeyinde Değerlendirmek için Damlacık Bazlı Sitotoksisite Testi

Burada, fenotipik tarama yoluyla potansiyel anti-tüberküloz ilaç adaylarını belirlemek için bir protokol sunuyoruz; bu protokol 4-aminokinolin bileşiğinin kimyasal sentezini, Mycobacterium tuberculosis karşısında minimum inhibitör konsantrasyonunun belirlenmesini ve memeli hücre hatlarında sitotoksisitesinin değerlendirilmesini kapsıyor.

Potansiyel Anti-TB Adaylarının Tanımlanması: Memeli Hücrelerinde Sentez, MIC Belirleme ve Sitotoksisite Değerlendirmesi için Adım Adım Rehber

Keşfedin, yüksek verimli gerçek zamanlı çift okuma testi ile hücre içi bakteri patojenlerine karşı ökaryotik hücre penetrant antimikrobiyalleri belirleme ve sitotoksisite değerlendirme yöntemini. Bu teknik, zararsız bilesiklerin eş zamanlı tespitini sağlar.

Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Daha fazla video keşfet