Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Bu protokolün genel amacı, konakçı hücreler için toksik olmayan hücre içi bakteri büyümesinin spesifik küçük moleküllü inhibitörlerini tanımlamak için tek bir kombinasyon gerçek zamanlı test kullanmaktır. Bu yöntem, antimikrobiyal keşif alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Spesifik olarak, ne tür bileşikler hücre içi bölmelere nüfuz edebilir ve konakçı hücreye zarar vermeden patojenleri öldürebilir?

Bu tekniğin ana avantajları, bakteri büyümesi, memeli hücresi toksisitesinin, tahribatsız, gerçek zamanlı tahliller kullanılarak aynı anda tespit edilmesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, sağladığı ölçeklenebilirlik ile mücadele edeceklerdir. Bir seansta on binden fazla bileşiğin tahlil edilmesi, tamamen yeni bir dizi teknik ve ekipman gerektirir.

Lucius'a ek olarak, akademik antimikrobiyal keşif ve translasyonel tanısal mikrobiyolojiye ortak bir bağlılık gösteren doktora sonrası araştırmacılar, KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn ve lisans öğrencisi Kat Truelson'dır. Konakçı hücreleri hazırlamak için J774A'yı kültürleyin. 1 makrofaj, RPMI 1640'ta süspansiyon halindedir ve yüzde dokuz demir takviyeli baldır serumu ile.

Başlangıçta doku kültürü şişelerinde geçiş hücreleri. Hücreler, 15 mililitre ortamda 75 santimetre karelik bir doku kültürü şişesinde birleştikten sonra, hücreleri kazıyarak ve aynı tür ortamla 65 mililitreye seyrelterek bölün. 15 mililitreyi doku kültürü şişesine geri koyun ve 50 mililitreyi 250 mililitrelik bir bakteri çalkalayıcı şişeye aktarın.

Dönüş hızını dakikada yaklaşık 120 devir olarak ayarlayarak havalandırın. Tutarlı bir büyüme için, tam olarak yüzde beş karbondioksit ve 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri, mililitrede iki nokta beş milyon hücre, mililitrede beş milyon hücre aralığında bir yoğunluğa ulaştıklarında hasat edin.

Ölü hücreler sitotoksisite deneylerinde arka plan gürültüsünü artıracağından, ölü hücre yüzdesinin yüzde 25'i geçmediğinden emin olun. Sıvı işleyicilerle büyük miktarlarda makrofaj ve bakteri dağıtırken rezervuarlarda hücre çökelmesini önlemek çok önemlidir. Tekdüzeliği ve tahlil plakası kuyularını önlemek için dağıtım sırasında rezervuarları birkaç dakikada bir döndürün.

Tedavi edilen beyaz doku kültüründeki hücreleri, kuyu başına 30 mikrolitre doku kültürü ortamında 50.000 hücrede 384 kuyulu mikroplakayı plakalayın. Deney gününde yüzde doksan birleşme elde etmek için mikroplakaları gece boyunca inkübe edin. Organizmaları yeni bir BCYE plakasına kalın bir şekilde yayarak ve birleşik büyüme elde etmek için bir gün kuluçkaya yatırarak deneyler için bakteri yamaları hazırlayın.

Organizmaları, J774A. 1 hücreleri için kullanılan aynı doku kültürü ortamında yeniden askıya alın. Makrofaj enfeksiyonunu gerçekleştirmek için, tarama bileşikleri ve ökaryotik hücre lizizinde bakteri üremesinin inhibisyonu için pozitif ve negatif kontroller dahil olmak üzere ilgilenilen test bileşiklerini ekleyin.

Stok çözeltileri, aracın yeterli seyreltilmesine izin vermek için DMSO'da veya sulu bir çözeltide 500x'e eşit veya daha büyük bir sıcaklıkta çözülmelidir. Lüminesan bakterileri, doku kültürü ortamında milileter başına iki nokta beş milyon CFU hedefine seyreltin. Daha sonra, iki nokta beş x nihai tahlil konsantrasyonunda uygun toksik olmayan membran geçirimsiz nükleik asit bulma boyası ekleyin.

Her kültür kuyusuna bu karışımdan 20 mikrolitre ekleyin. Son tahlil hacmi 50 mikrolitredir ve nihai bakteri konsantrasyonu, lux epron raportörü için mililitre başına bir milyon CFU veya floresan protein raportörü için mililitre başına dört milyon CFU olmalıdır. Buharlaşma kenar etkilerini önlemek için yüzde 100 bağıl nemde yüzde beş karbondioksit içinde bir ila üç gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Tahlil sonuçlarını okurken sıcaklıkla ilişkili kenar etkilerinden kaçınmak için, lüminesans okumasından önce mikroplakaları, kapakları aralıklı bir laboratuvar tezgahı üzerinde yaklaşık 20 dakika boyunca tek bir katman halinde yerleştirerek termal olarak dengeleyin. Kullanılan raportörler için uygun şekilde bir mikroplaka luminometre ve flourometre üzerinde bakteri üremesini ve ökaryotik hücre toksisitesini okuyun. Daha sonraki zaman noktalarında gerçek zamanlı okuma isteniyorsa, mikroplakaları inkübatöre geri koyun.

Verileri metin protokolünde açıklandığı gibi analiz edin. Doz yanıtı ve sinerji testi deneyleri için, bakterilerde makrofajları daha önce olduğu gibi hazırlayın. Makrofaj enfeksiyonundan veya aksenik inkübasyondan hemen önce, üretici protokolüne göre antimikrobiyal dilüsyonların doğrudan otomatik olarak eklenmesi yoluyla kurulan kombinatoryal sinerji testinde tek doz yanıtını kolaylaştırmak için otomatik bir sıvı işleme sistemi kullanın.

Seri ikiye katlama seyreltme serisine deneysel ilgi çekici antimikrobiyaller ekleyin. Amaç, üst uçta, büyümeyi tamamen ortadan kaldıran bir konsantrasyonu ve düşük uçta, belirgin bir aktivite göstermeyen bir konsantrasyonu yaymaktır. Burada gösterilenler, bakteriyel lüminesans ve sitotoksisite ile ilişkili floresan için zaman içinde temsili sonuçlardır.

Antimikrobiyal tedavi ve ökaryotik hücre sitotoksik deterjanının zıt etkilerine dikkat edin. Antibiyotik Doksisiklin için seçiciliği belirlemek için aynı tarama kuyucuklarında ikili IC50 ve CC50 doz yanıtı tayini kullanıldı. Bakteriyel replikasyon, orta konsantrasyonlarda antibiyotik ile inhibe edildi.

Bununla birlikte, yaklaşık 100 seçicilik ile tutarlı yüksek konsantrasyonlarda sitotoksisite gözlenmiştir. Minosiklin ve Azitromisin kombinasyonları için iki boyutlu doz yanıtını test etmek için aynı test formatı kullanıldı. İzocontourlar, eşit hücre içi büyüme inhibisyonunun noktalarını birleştirir.

Burada, içbükey izokonturlar, iki ilaç için güçlü sinerjik etkiler önerdi. Tahlil kurulumu için dijital dağıtım robotları, gerçek zamanlı okuma ve yüksek verimli format, kombinatoryal üçlü sinerji testini mümkün kıldı. Burada, belirgin bir şekilde içbükey bir yüzeyin gözlemlenmesi, lejyonella pheumophila'nın hücre içi büyümesine karşı Minosiklin, Azitromisin ve Rifampin kombinasyonları için yüksek derecede sinerjik etki olduğunu göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, floresan veya ışıldayan tahlil okumasını yüksek verimli tahlil formatında gerçek zamanlı, sitotoksisite testi ile nasıl birleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu işlemi takiben, konfokal mikroskop gibi diğer yöntemler de uygulanabilir ve bunlar da antimikrop aktiviteleri veya tüm hücre sitotoksisitesi ile ilgili tüm hücredeki biyolojik olayla ilgili soruları yanıtlayabilir. Lejyonella replikasyonu üzerindeki etkilerini incelemiş olsak da, aynı teknikler Brusella ve mikrobakteriler gibi diğer hücre içi patojenlere de uygulanabilir.

Bu protokolü ilk olarak, çok yüksek verimli bir tarama formatında kullanılabilecek kadar basit ve güvenilir bir test bulmaya çalışırken tasarladık. Bakteriyel patojenler, hücre hatları ve robotik ekipmanlarla çalışmanın bazı doğal riskleri olduğunu ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanımı gibi uygun önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.