Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Bu protokolün genel amacı, konak hücreler için toksik olmayan, hücre içi bakteriyel büyümeyi hedefleyen spesifik küçük molekül inhibitörlerini tanımlamak için tek bir kombinasyon gerçek zamanlı testi kullanmaktır. Bu yöntem, antimikrobiyal keşif alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Özellikle, konak hücreye zarar vermeden hücre içi kompartmanlara nüfuz edebilen ve patojenleri öldürebilen bileşik türleri nelerdir?

Bu tekniğin temel avantajları, bakteriyel büyümenin ve memeli hücresi toksisitesinin tahribatsız, gerçek zamanlı analizler kullanılarak eş zamanlı olarak tespit edilmesidir. Genellikle, bu yöntemi yeni kullanan kişiler, yöntemin sunduğu ölçeklenebilirlik konusunda zorluk yaşayacaklardır. Bir oturumda on binden fazla bileşiğin analiz edilmesi, tamamen yeni bir teknik ve ekipman seti gerektirir.

Lucius'a ek olarak, akademik antimikrobiyal keşfe ve translasyonel diyagnostik mikrobiyolojiye yönelik ortak bir bağlılık sergileyenler arasında doktora sonrası araştırmacılar KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn ve lisans öğrencisi Kat Truelson yer almaktadır. Konak hücreleri hazırlamak için, J774A. 1 makrofajlarını yüzde dokuz demir takviyeli buzağı serumu içeren RPMI 1640 içerisinde süspansiyon kültüründe yetiştirin.

Hücreleri başlangıçta doku kültürü flasklarında pasajlayın. Hücreler, 15 mililitre besiyeri içeren 75 santimetrekarelik bir doku kültürü flaskında konfiman hale geldikten sonra, hücreleri kazıyarak ayırın ve aynı tip besiyeri ile 65 mililitreye seyreltin. 15 mililitreyi doku kültürü flaskına geri koyun ve 50 mililitreyi 250 mililitrelik bir bakteriyel çalkalayıcı flaska aktarın.

Dönüş hızını yaklaşık 120 devir/dakika olarak ayarlayarak havalandırın. Tutarlı bir büyüme için, tam olarak %5 karbondioksit ve 37 °C'de inkübe edin. Hücreler mililitre başına 2,5 milyon hücre ile 5 milyon hücre arasındaki yoğunluğa ulaştığında hasat edin.

Ölü hücrelerin sitotoksisite analizlerinde arka plan gürültüsünü artıracağı göz önünde bulundurularak, ölü hücre yüzdesinin %25'i geçmediğinden emin olun. Sıvı aktarım cihazlarıyla yüksek hacimlerde makrofaj ve bakteri dağıtımı yaparken, hücrelerin rezervuarlarda çökmesini önlemek kritik öneme sahiptir. Dağıtım sırasında, heterojenliği ve analiz plağı kuyucuklarındaki düzensizliği önlemek için rezervuarları birkaç dakikada bir dairesel hareketlerle karıştırın.

Hücreleri, beyaz doku kültürü işleminden geçmiş, 384 kuyucuklu mikroplakalara, kuyucuk başına 30 microliters doku kültürü ortamında 50, 000 hücre olacak şekilde ekin. Deney gününde yüzde doksan konfluans sağlamak için mikroplakaları gece boyunca inkübe edin. Organizmaları yeni bir BCYE plakasına yoğun şekilde yayarak ve konfluent büyüme elde etmek için bir gün inkübe ederek deneyler için bakteri yamaları hazırlayın.

Organizmaları, J774A.1 hücreleri için kullanılan aynı doku kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Makrofaj enfeksiyonunu gerçekleştirmek için, tarama bileşikleri dahil olmak üzere ilgilenilen test bileşiklerini ve ökaryotik hücre lizisinde bakteriyel büyüme inhibisyonu için pozitif ve negatif kontrolleri ekleyin.

Stok çözeltiler, taşıyıcının yeterince seyreltilmesine olanak sağlamak için DMSO veya sulu bir çözelti içinde 500x veya daha yüksek konsantrasyonda çözülmelidir. Lüminesan bakterileri, doku kültürü ortamında mililitre başına 2,5 milyon CFU hedef konsantrasyonuna kadar seyreltin. Ardından, uygun non-toksik membran geçirmez nükleik asit bulucu boyayı, final analiz konsantrasyonunun 2,5 katı oranında ekleyin.

Bu karışımdan her bir kültür kuyucuğuna 20 µL ekleyin. Nihai analiz hacmi 50 µL'dir ve nihai bakteri konsantrasyonu, lux epron raporlayıcısı için mililitrede bir milyon CFU veya floresan protein raporlayıcısı için mililitrede dört milyon CFU olmalıdır. Buharlaşma kaynaklı kenar etkilerini önlemek için %100 bağıl nemde, %5 karbondioksit altında, 37 °C'de bir ila üç gün inkübe edin.

Deney sonuçları okunurken sıcaklıkla ilişkili kenar etkilerini önlemek için, mikropelatları kapakları hafifçe aralık şekilde bir laboratuvar tezgahı üzerine tek sıra halinde yerleştirerek yaklaşık 20 dakika boyunca termal dengeye getirin. Bakteriyel büyümeyi ve ökaryotik hücre toksisitesini, kullanılan raporlayıcılara uygun olarak bir mikroplaka lümünometre ve florometre ile okuyun. Daha sonraki zaman noktalarında gerçek zamanlı okuma isteniyorsa, mikroplakaları inkübatöre geri yerleştirin.

Verileri metin protokolünde açıklandığı şekilde analiz edin. Doz yanıtı ve sinerji testi deneyleri için, makrofajları daha önce olduğu gibi bakterilerle hazırlayın. Makrofaj enfeksiyonundan veya aksenik inkübasyondan hemen önce, üretici protokolüne uygun olarak antimikrobiyal dilüsyonların doğrudan otomatik eklenmesi yoluyla, kombinatoryal sinerji testi kurulumunda tek doz yanıtını kolaylaştırmak için otomatik bir sıvı taşıma sistemi kullanın.

Deneysel olarak ilgi çeken antimikrobiyalleri seri iki katlı dilüsyon serisi şeklinde ekleyin. Amaç, üst sınırda büyümeyi tamamen ortadan kaldıran bir konsantrasyonu ve alt sınırda ise belirgin bir aktivite göstermeyen bir konsantrasyonu kapsamak suretiyle bir aralık oluşturmaktır. Burada, bakteriyel lüminesans ve sitotoksisite ile ilişkili floresans için zamana bağlı temsili sonuçlar gösterilmektedir.

Antimikrobiyal tedavi ve ökaryotik hücre sitotoksik deterjanının zıt etkilerini gözlemleyin. Antibiyotik Doxycycline için seçiciliği belirlemek amacıyla, aynı tarama kuyucuklarında çift IC50 ve CC50 doz yanıt belirlemesi yapılmıştır. Bakteriyel replikasyon, antibiyotiğin orta konsantrasyonları ile inhibe edilmiştir.

Buna karşın, yaklaşık 100'lük seçicilikle uyumlu olarak yüksek konsantrasyonlarda sitotoksisite gözlemlenmiştir. Minosiklin ve Azitromisin kombinasyonları için iki boyutlu doz yanıtını test etmek amacıyla aynı analiz formatı kullanılmıştır. İzokonturlar, eşit hücre içi büyüme inhibisyonu noktalarını birbirine bağlamaktadır.

Burada, konkav izokonturlar iki ilaç için güçlü sinerjik etkilere işaret etmiştir. Deney düzeneği için dijital dozajlama robotiği, gerçek zamanlı okuma ve yüksek kapasiteli format, kombinatoryal üçlü sinerji testine olanak sağlamıştır. Burada, belirgin şekilde konkav bir yüzeyin gözlemlenmesi, Minocycline, Azithromycin ve Rifampin kombinasyonlarının intracellular growth of legionella pheumophila'ya karşı yüksek derecede sinerjik etkisinin olduğunu göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, yüksek kapasiteli analiz formatında gerçek zamanlı sitotoksisite testi ile floresan veya lüminesans analiz okumalarının nasıl birleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü takiben, antimikrobiyal aktiviteleri veya tüm hücre sitotoksisitesi ile birlikte değerlendirilen tüm hücredeki biyolojik olaylar hakkındaki soruları yanıtlamak için konfokal mikroskop gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Biz Legionella replikasyonu üzerindeki etkileri çalışmış olsak da aynı teknikler Brucella ve mikobakteriler gibi diğer hücre içi patojenlere de uygulanabilir.

Bu protokolü ilk olarak, çok yüksek kapasiteli bir tarama formatında kullanılabilecek kadar basit ve güvenilir bir analiz yöntemi belirlemeye çalışırken geliştirdik. Bakteriyel patojenler, hücre hatları ve robotik ekipmanlarla çalışmanın bazı doğal riskler taşıdığını ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanımı gibi gerekli önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.