Name: Detaylı Mekansal İfade Haritalar Dinamik İfade Verilerinin Zamansal Sipariş (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Keşfedin omurga segmentasyon saatinin mekansal-zamansal gen ifade dinamiklerini sabit doku örnekleme kullanarak. Bu hesaplamalı yöntem, presomitik mezodermde salınımlı gen dinamiklerinin tarafsız değerlendirilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma RAB bir MRC öğrencilik, CSLB bir MRC öğrencilik ve JKD (WT089357MA) bir WT proje hibe ile desteklenmiştir. çalışmaları da bir hoş geldiniz Güven Stratejik ödülü (097.945 / Z / 11 / Z) tarafından desteklenmiştir. Biz Lfng RNA probu DLL1 antikor ve Dr. O. Pourquie tür hediye Dr. E. Kremmer teşekkür ederim.

Bütün deneyler Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) 1986 Yasası ve bilimsel işlemlerde hayvanların kullanımı için Uygulama İngiltere Home Office Kodları sıkı sıkıya bağlı kalmanın proje lisans numarası 6004219 altında gerçekleştirildi. 1. PSM Eksplantasyon Diseksiyon <ol><li> Wild-tip (CD1) farelerin 13 zamanlı çiftleşme tarafından üretilen embriyolar kuyruk dokusu elde. Kısaca, embriyonik gün (D) 10,5, bir karbon diyoksit odasında hamile, verici bir fare euthanize. uterin boynuz hasat ve Home Office Lisans prosedürleri veya eşdeğer yerel kurallara uygun olarak 1x steril fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi içine yerleştirin. Taze, steril PBS içeren bir doku kültürü çanak uterin boynuz aktarın. Bu çözümde sonraki tüm diseksiyon adımları uygulayın. </li><li> Bir stereomikroskop altında, kavisli makas kullanarak uterin boynuz kalın kas zarı kesme ve dikkatle ince forseps kullanarak her bir embriyo ayıklayın. Kendine iyi bakkuyruk dokusu bu süreçte zarar görmediğinden emin olmak için. embriyoyu zarar vermemeye özen her embriyo amniyon kesesi uzak teşrih, kavisli makas ve ince forseps kullanarak. </li><li> Arka bacak tomurcukları embriyo posterior keserek her embriyonun kuyruk dokusu hasat için bir cerrahi iğne veya kavisli makas kullanınız. </li><li> forseps ve bir iğne her ikisini de kullanarak kuyruk dokusu ventral tarafı aşağı dengeleyin. orta hat boyunca ikiye kuyruk dokusu diseksiyon her embriyonik kuyruk PSM eksplant çiftleri oluşturmak; Bir iğne ile yumuşak sallanan hareketi gerçekleştirin. Nöral tüp, notokord ve PSM dokusu eşit olarak iki eksplant arasında bölünmüş emin olun. </li><li> +% 0.1 L-glutamin yerine,% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiş, önceden ısıtılmış (37 ° C), kültür ortamı (DMEM-F12, küçük bir hacim içinde 35-mm plastik kültür kabı kapağının alt üzerine her karşı PSM eksplant Pipet 10 nM insan bFGF, ve% 1 penisilin / streptomisin). </li> &lt;li&gt; kapağın üstüne çanak yerleştirin ve hızlı bir şekilde PSM doku ortamının bir &quot;asılı damla&quot; olarak kapağın askıya böylece onu çevirin. Kültür 1, 37 ° C&#39;de nemlendirilmiş bir haznede lekelenmiştir PSM eksplantlar - 2 saat. </li><li> 24 oyuklu doku kültür plakasının her bir gözeneğinden PSM eksplantlar devri çiftleri. gece boyunca, oda sıcaklığında (RT) ya da 4 ° C &#39;de 1 saat süreyle (O / N), PBS içinde% 4 paraformaldehid içinde inkübe edin. DİKKAT: Paraformaldehid toksiktir ve bu çözelti ile birlikte çalışan, uygun güvenlik önlemleri alınması gerekir. Not: 24 oyuklu doku kültürü plakası sonraki tüm yıkama ve inkübasyon adımları. </li><li> 4 kez - Taze PBS 3 örnek üzerinde PBS çözeltisi alışverişi için iyi bir plastik pastör pipeti kullanılarak, sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında PBS içinde numune kuyuları yıkayın. (Immünhistokimya (adım 2) ve bilinen bir saat geni için in situ hibridizasyon diğer kullanarak floresan kullanarak st her çiftten biri PSM eksplant SüreçEP 3). </li></ol> PSM Eksplantlarından 2. İmmunohistokimya <ol><li> sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS içinde% 2 Triton X-100, aşama 1 &#39;de üretilen her embriyo çiftten bir PSM eksplant yıkayın ve daha sonra PBS içinde kısa bir süre örnekleri yıkayın. sallanan bir platform üzerinde 4 ° C de ve inkübe O bloke etme çözeltisi (PBS +% 0.1 Tween-20 içinde% 2 sığır serum albümini (BSA) ve% 10 normal keçi serumu (NGS)) / N numuneler PBS değiştirin. NOT: Aksi belirtilmedikçe, bu bölüm içinde bulunan sonraki yıkama sıvıları ve inkübasyon adımları sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir. Yıkama çözeltileri kolayca ince uçlu bir plastik ya da cam Pasteur pipet kullanılarak değiştirilebilir. </li><li> Çalışma tamponu içinde istenen birincil antikor / antikorlar seyreltilir (% 0.1 BSA,% 0.3 NGS ve PBS içinde% 0.2 Triton X-100). Bu örnekte, tampon çalışma DLL1 ve Notch1 antikorları 1:25 seyreltin. NOT: Optimizasyon thi gerekli uygun seyreltme faktörünü belirlemek için gerekli olacaktırAlternatif antikorlar kullanılırsa s adımı. </li><li> sallanan bir platform üzerinde 4 ° C de 5 gün - 3 antikor çözeltisi içinde eksplantlar inkübe edin. Sekonder antikor kontrolleri olarak hareket etmek birincil antikor içeren tampon ile çalışan bazı örnekler şunlardır emin olun. </li><li> bir pipet kullanılarak 1.5 mL depolama tüpünde birincil antikor çözeltisi elde etmek ve 4 ° C &#39;de muhafaza edin. Not: Geri kazanılmış birincil antikor kullanılan antikora bağlı olarak, birçok kez kullanılabilir. </li><li> sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında PBS içinde% 2 Triton X-100, 10 dakika her biri için 3 yıkama yapılmıştır PBS içinde 10 dakika her biri, - 5 Örneklerin 2 yıkama yapın. </li><li> floresan etiketli ikincil antikor / antikorlar seyreltilir buferi (birincil antikora epitop eşleşen / antikorlar kullanılır). İsteğe bağlı olarak, çekirdek counterstain Bu çözeltiye 20 ug / ml Hoechst 33342 ekleyin. Not: Optimizasyonu Bu aşamada gerekli uygun seyreltme faktörünü belirlemek için gerekli olabilir. Bu example, 1 bir seyreltme faktörü: 400, tipik olarak kullanılmıştır. </li><li> Antikor agregatların oluşumunu önlemek için 16 x g&#39;de 10 dakika süre ile ikincil antikor çözeltisi santrifüjleyin. Antikor agregalar ihtiva edebilir çözeltisi son birkaç mikrolitre kullanmamaya dikkat ederek, her bir numune için ikincil antikor çözeltisinin 500 ul - 250 ekleyin. </li><li> Karanlıkta 4 ° C&#39;de 5 gün - ışığa maruz kalma en aza indirmek ve 3 ikincil antikor çözeltisinin örnekleri inkübe kalay folyo ile örnek plaka örtün. </li><li> Montaj örnek PBS içinde% 0.1 Tween-20 içinde 10 dakika her biri (PBST) ile sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında PBS içinde bir kez 5 dakika boyunca iki kez numune yıkama öncesinde (adım 4). </li></ol> PSM Eksplantlarından Yerinde Hibridizasyon (FISH) 3. Floresan <ol><li> Alternatif bir kap içinde saklanması durumunda, 24 oyuklu doku kültür plakasının her bir gözeneğinden kalan karşı PSM eksplantlar aktarın. </li><li> için numune yıkayın10 PBST içinde% 50 etanol içinde dakika, ve daha sonra doku kurutmak için oda sıcaklığında sallanan bir platform üzerinde 10 dakika boyunca% 100 etanol içinde her biri 2 yıkama yapar. NOT: Aksi belirtilmedikçe, bu bölüm içinde bulunan sonraki yıkama sıvıları ve inkübasyon adımları sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir. </li><li> PBST içinde her biri 5 dakika iki kez yıkanır, PBST içinde% 50 etanol içinde 10 dakika boyunca yıkama doku rehidrate. NOT: 3.2 ve 3.3 bu protokol için gerekli sabitleme adımlardır ve ihmal edilemez adımları. </li><li> çalkalama olmaksızın 5 dakika boyunca PBS (PBST),% 0.1 Tween-20, 10 ug / ml proteinaz K ile inkübe edin. Hızla proteinaz K kaldırmak ve PBST% 4 formaldehit +% 0.1 gluteraldehit 30 dakika süreyle doku post-sabitleme kısa bir süre önce PBST ile örnekleri durulayın. DİKKAT: formaldehit ve glutaraldehit Hem toksik ve bu çözümler ile çalışırken uygun güvenlik önlemleri alınmalıdır. NOT: Aşağıdaki yıkamave% 50 ve% 100 melezleştirme karışımları (3.6 adım - 3.9) içeren bekletme işlemleri çalkalama olmaksızın gerçekleştirilmelidir. </li><li> PBST içinde 10 dakika her biri için iki numune yıkandıktan sonra, intronik problar için (% 50 hibridizasyon karışımı bir kez uygun bir örneği yıkama:% 50 formamid, 5x salin sodyum sitrat (SSC), 5 mM EDTA, 50 ug / ml tRNA, % 0.2 Tween-20,% 0.1 SDS ve PBST içinde 100 ug / ml heparin) oda sıcaklığında hazırlandı. çalkalama olmaksızın 65 ° C de, 10 dakika boyunca bu çözelti içinde inkübe edin. </li><li> 65 ° C&#39;de (48 saat kadar) ≥ 2 saat boyunca melezleştirme karışımı örnekleri inkübe edildi önceden ısıtılmış (65 ° C) hibridizasyon karışımı ile iki kez numune durulayın (daha uzun inkübasyon süreleri, elde edilen sinyal-gürültü kontrastı arttırmak) . Önceki aşamadan elde edilmiş hibridizasyon karışımı çıkarın ve 0.25 ile değiştirin - önceden ısıtılmış 0.5 mL (65 ° C) digoksigenin (DIG) bilinen bir segmentasyon saat bileşenine karşı anti-sens RNA probu -etiketli ihtiva eden hibridizasyon karışımı. DEĞİLE: Örneğin, bir intronik kanadını (Lfng (I) &#39;) probu olgunlaşmamış Lfng mRNA tespit etmek için 20 ul / ml&#39;lik bir konsantrasyonda kullanıldı. Bu basamakta kullanılan seyreltme prob bağlıdır ve optimizasyon gerektirir. </li><li> buharlaşmasını önlemek ve 65 ° C &#39;de iki gece prob çözeltisi örnekleri inkübe yapışkan bandı kullanarak plakayı kapatın. </li><li> ince uçlu plastik Pasteur pipeti kullanarak, yeniden kullanım için prob kurtarmak ve 20 ° C&#39;de saklayın. Ön 65 ° C de 20 dakika her biri için numuneler iki kez yıkanmasından önce, önceden ısıtılmış (65 ° C) olarak hibridizasyon sonrası karışımı (% 50 formamid,% 0.2 Tween-20 ve 1 x SSC) ile iki kez numune durulayın post-hibridizasyon karışımı ısındı. </li><li> Tris-tamponlu tuzlu su çözeltisi (TBST) içinde% 0.1 Tween-20 içinde önceden ısıtılmış% 50 hibridizasyon karışımı içinde 65 ° C&#39;de 15 dakika boyunca numune yıkanır. sallanan bir platform üzerinde TBST içinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yıkanmasından önce TBST ile iki kez numune durulayın. </li><li> blo eksplantlar önceden inkübecking çözeltisi (TBST +% 2 tampon reaktifi (BBR) +% 20 ısı ile muamele edilmiş keçi serumu engelleme), 2 saat içinde en az. 1 ihtiva eden taze bloklama çözeltisi ile değiştirin Çözüm: yaban turbu peroksidazı (HRP), 200 seyreltme, anti-digoksigenin antikor ile konjüge edilmiş. 4 ° C&#39;de numunelerin O / N inkübe edin. </li><li> Antikor inkübe edildikten sonra oda sıcaklığında numuneleri TBST ile 3 kez yıkayın ve yeni bir 24 oyuklu doku kültür plakasının her bir gözeneğinden aktarın. 1 saat için her TBST ile 3 kez eksplantlar yıkayın. </li><li> Bu noktada, aşağıdaki adımlarda Tyramide sinyal amplifikasyonu (TSA) saptama reaktifleri gerekli miktarını azaltmak için, 0.5 mL &#39;lik bir depolama tüpler ya da 48 oyuklu doku kültür plakasının her bir gözeneğinden numuneleri aktarın. </li><li> ajitasyon, mümkün olduğu kadar küçük bir hacim kullanılarak numuneler tam çözeltisine daldırıldığı emin olmadan 1 dakika için oda sıcaklığında TSA amplifikasyon tamponu örnekleri (reaktif listesine bakınız) inkübe edin. </li><li> (bkz TSA reaktif ekleyin1:50 seyreltmede Örnek amplifikasyon tamponu reaktiflerin listesi). Hızla TSA reaktif eşit dağıtılmış kadar çözüm karıştırmak kalay folyo levha veya tüpler kapak ve 60 için örnekler inkübe - karanlıkta 90 dakika. </li><li> TSA amplifikasyon çözüm çıkarın ve 5 dakika her TBST 3 kez numune yıkayın. 1 saat boyunca TBST içinde% 1 hidrojen peroksit örnekleri yıkama hacmini artırmak ve inkübasyona 24 oyuklu doku kültürü plakası geri eksplantlar aktarın. Her biri 5 dakika süreyle TBST ile 3 kez numune yıkanır ve sonra da iki kez 5 dakika boyunca, her PBST ile önceden monte örnek (adım 4). </li></ol> Görüntüleme 4. Numune Hazırlama <ol><li> Bir lamel eklenmesi ile ezilmiş kalmasını engellemek 0.12 mm kalınlığında görüntüleme ara parçalar ekleyerek her eksplant çifti için bir ücret yapışma cam slayt hazırlayın. f presleme bir ara parçanın bir yüzeyine yapışkan astarını çıkarın ve bir cam slayt üzerine aşağı yapışkanlı tarafı yerirmly slayt ayırıcı mühür. NOT: Kalan adımlar için, photobleaching önlemek için düşük ışık koşullarında veya karanlıkta örnekleri tutmak için çaba. eksplant disseke yan slayt karşı karşıya sağlanması, ara parçasının merkezi içinde bir cam Pasteur pipeti kullanarak hazırlanmış bir slayt üzerine Pipet eksplant çiftleri. yan eksplantlar yan taraf çiftleri düzenleyin. </li><li> Bir cam Pasteur pipeti kullanarak slayt mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarın ve katlanmış az tüylü doku kağıt parçası kullanarak örnekleri çevreleyen herhangi bir kalıntı nemi fitil. </li><li> Doku yapışkan ve saydam görünmesini başlayana kadar, 60 s - numuneler 45 slayt uymak için izin verin. Bu süre boyunca, forseps kullanılarak aralama kalan yapışkan astar çıkarın. Numuneler kurumasına izin vermeyin. </li><li> merkezi içinde örnekleri (% 90 gliserol içinde% 0.5 p-fenilendiamin ve 20 mM Tris, pH 8.8,) Çift fonksiyonlu mountant ve temizleme çözeltisinin büyük damla eklemeara parçasının. NOT: okside izin Bu çözüm siyah / kahverengi döner. </li><li> Dikkatle mountant eşit dağıtılmış olduğunu ve lamel tüm kenarlarında ayırıcı ile temas sağlanması, numuneler üzerinde dairesel bir lamel (no. 1.5) yerleştirin. baş aşağı bazı düşük tüy bırakmayan doku kağıt üzerine kapak astarlı slayt yerleştirin. </li><li> Lamel tam ayırıcı yapıştığı ve herhangi bir aşırı mountant kaldırılır emin olmak için sıkıca bastırın. artık mountant lekeleri kağıt kadar tekrarlayın. </li><li> Temiz ve uygun slayt (ler) etiket ve görüntüleme -20 ° C&#39;de, kısa süreli ya da -80 ° C&#39;de uzun vadede kadar karanlıkta saklayın. Depolama slaytları çıkardıktan sonra, onları tamamen görüntüleme önce çözülme sağlar. </li><li> Görüntü kiremitli edinimi ve yüksek büyütme amacı ile bir konfokal mikroskop kullanılarak monte örnekleri. Görüntü 488 nm, 568 nm ve 647 nm lazer li kullanılarak 4 mikron z-aralıklarla 40X immersiyon yağı hedefi kullanarak eksplant çiftlerines, yeşil, kırmızı ve uzak-kırmızı fluorophores, sırasıyla, bu çalışmada 12 protein ve mRNA tespiti için kullanılan heyecanlandırmak için. NOT: Çinili görüntüleri analiz için tek bir görüntü oluşturmak için alım sonrası dikişli bulundu. </li></ol> 5. Post-satın alma Görüntü Analizi <ol><li> Her deney numunesine ait PSM içinde ilgi bölgeyi tanımlamak için görüntü analiz yazılımı kullanın. <ol><li> sonraki ölçümü öncesinde no-birincil kontrol numunesinin seviyesine ifade seviyelerini, çıkarma arka plan ve eşik görüntüleri ölçmek için. bir kökeni, bir eksen, ve her bir numune için bir birim uzunluğu tanımlamak için kullanılır. </li></ol></li><li> M örnekleri 12 her biri için normalize Rostro-kaudal ekseni boyunca pozisyonun bir fonksiyonu olarak floresans yoğunluğunu hesaplar. Yoğunluk araziler normalize sonra, i de şiddetini tanımlayan bir yoğunluk matrisi f (i, j) yan yoğunluk profilleri yan yerleştirin ve elde <snumune inci j mekansal pozisyon th&gt; kadar. </li></ol> Numunelerin 6. Geçici Sipariş <ol><li> Bilinen bir saat bileşeninin zamansal sipariş anlaması, onun yoğunluğu matrisi tanımlar. zamansal düzenli desen elde etmek üzere sonra, yoğunluk matris sütun yeniden. Bunu yapmak için, işlev tanımlayın <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/55127/55127equation01.jpg" /> A (f j, k) burada f ve A T sütunun inci j otokorelasyon fonksiyonunu temsil tarafından verilen desen zamansal periyotlarını uygulamak için seçilen bir hedef otokorelasyon fonksiyonu, bir <img alt="denklem 2" src="/files/ftp_upload/55127/55127equation02.jpg" /></li><li> Fonksiyon g minimize örneklerin sırasını belirlemek için Metropolis-Hastings (veya başka bir minimizasyonu algoritması) 12 kullanın. Böylece, sırasını belirlemekBilinen bir saat bileşeninin zamansal periyotlarını maksimize M örnekleri. </li><li> M örneklerinin olayla zamansal sıralaması kullanılarak, ortaklı kanalda 12 ifade deseni için bir sipariş kymograph inşa. </li></ol>

<ol><li>Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+embryos+with+oscillations%3A+structure%2C+function+and+dynamics+of+the+vertebrate+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock.</a> Development. 139 (4), Cambridge, England. 625-639 (2012).</li>
<li>Krol, A. J., Roellig, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+plasticity+of+segmentation+clock+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary plasticity of segmentation clock networks.</a> Development. 138 (13), Cambridge, England. 2783-2792 (2011).</li>
<li>Dequéant, M. -L., Ahnert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Pattern+Detection+Methods+in+Microarray+Time+Series+of+the+Segmentation+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparison of Pattern Detection Methods in Microarray Time Series of the Segmentation Clock.</a> PLoS ONE. 3 (8), 2856(2008).</li>
<li>Bailey, C., Dale, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBailey%2C+C+%22Somitogenesis+in+Vertebrate+Development%22">Somitogenesis in Vertebrate Development</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester, UK. 1-15 (2015).</li>
<li>Maroto, M., Bone, R. A., Somitogenesis Dale, J. K. <a target="_blank" href="http://dev.biologists.org/content/139/14/2453">Somitogenesis.</a> Development. 139 (14), Cambridge, England. 2453-2456 (2012).</li>
<li>Kageyama, R., Masamizu, Y., Niwa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillator+mechanism+of+notch+pathway+in+the+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Oscillator mechanism of notch pathway in the segmentation clock.</a> Developmental Dynamics. 236 (6), 1403-1409 (2007).</li>
<li>Ferjentsik, Z., Hayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+Is+a+Critical+Component+of+the+Mouse+Somitogenesis+Oscillator+and+Is+Essential+for+the+Formation+of+the+Somites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Notch Is a Critical Component of the Mouse Somitogenesis Oscillator and Is Essential for the Formation of the Somites.</a> PLoS Genetics. 5 (9), 1000662(2009).</li>
<li>Wiedermann, G., Bone, R. A., Silva, J. C., Bjorklund, M., Murray, P. J., Dale, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+balance+of+positive+and+negative+regulators+determines+the+pace+of+the+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A balance of positive and negative regulators determines the pace of the segmentation clock.</a> eLife. 4, 05842(2015).</li>
<li>Chapman, G., Sparrow, D. B., Kremmer, E., Dunwoodie, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+inhibition+by+the+ligand+DELTA-LIKE+3+defines+the+mechanism+of+abnormal+vertebral+segmentation+in+spondylocostal+dysostosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Notch inhibition by the ligand DELTA-LIKE 3 defines the mechanism of abnormal vertebral segmentation in spondylocostal dysostosis.</a> Human Molecular Genetics. 20 (5), 905-916 (2011).</li>
<li>Sparrow, D. B., Chapman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mechanism+for+Gene-Environment+Interaction+in+the+Etiology+of+Congenital+Scoliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Mechanism for Gene-Environment Interaction in the Etiology of Congenital Scoliosis.</a> Cell. 149 (2), 295-306 (2012).</li>
<li>Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lfng+regulates+the+synchronized+oscillation+of+the+mouse+segmentation+clock+via+trans-repression+of+Notch+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling.</a> Nature communications. 3, 1141(2012).</li>
<li>Bone, R. A., Bailey, C. S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+oscillations+of+Notch1%2C+Dll1+and+NICD+are+coordinated+across+the+mouse+PSM%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal oscillations of Notch1, Dll1 and NICD are coordinated across the mouse PSM.</a> Development. 141 (24), Cambridge, England. 4806-4816 (2014).</li>
<li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (2), 160(2007).</li>
<li>Denkers, N., García-Villalba, P., Rodesch, C. K., Nielson, K. R., Mauch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISHing+for+chick+genes%3A+Triple-label+whole-mount+fluorescence+in+situ+hybridization+detects+simultaneous+and+overlapping+gene+expression+in+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">FISHing for chick genes: Triple-label whole-mount fluorescence in situ hybridization detects simultaneous and overlapping gene expression in avian embryos.</a> Developmental Dynamics. 229 (3), 651-657 (2004).</li>
<li>Stasiulewicz, M., Gray, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+role+for+Notch+signaling+in+priming+the+cellular+response+to+Shh+through+ciliary+localisation+of+the+key+Shh+transducer+Smo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A conserved role for Notch signaling in priming the cellular response to Shh through ciliary localisation of the key Shh transducer Smo.</a> Development. 142 (13), Cambridge, England. 2291-2303 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Protokol çerçevesinde kritik adımlar Mevcut protokol E10.5 fare PSM eksplantlarda düşük seviyeli protein ekspresyonu ve osilatör dinamikleri nicel analizini gerçekleştirmek için hassas bir yöntem açıklanır. In situ hibridizasyon (FISH) hem immünhistokimya ve floresan için sağlam bir protokol konfokal görüntüleme tüm montaj yüksek çözünürlüklü takip eder, ve ardından görüntü analizi ve kymographs zamansal segmentasyonu ile PSM genelinde protein ifadesi bir uzaysal haritası oluşturmak için. Protein ve mRNA tespitinde yüksek bir sinyal-gürültü oranı, bu tekniğin başarısı için çok önemlidir. Bakım 3. adımda ilgili aşamalarında 65 ° C yıkama sıcaklığı iyice yıkama adımları sırasında etkin bir şekilde tüm çözümler alışverişinde bulunmak ve korumak için alınması gereken karşı etkili antikorlar ve RNA probları kaynak için zaman ayırın en avantajlı ve ilgi hedefleri bu reaktif test etmekiyice bu protokolü başlamadan önce tüm montaj örnekleri üzerinde. Değişiklikler ve Sorun Giderme Bu protokolü yaparken karşılaşılabilecek ana konular zayıf sinyal algılama gücüne ve kalitesine kaynaklanmaktadır. Bu sırasıyla protokolde immünhistokimya veya FISH adımları için kullanılan antikorların veya RNA probların etkinliği üzerine büyük ölçüde bağımlı. Yeterli sinyal algılama sağlanır önce farklı adımlar bir dizi optimizasyonu gerekebilir. zayıf sinyal tespiti için yaygın bir nedeni yanlış fiksasyondur; taze PFA ya da PFA ya örnekleri sabitlemek için kullanılan bu süre bir hafta daha 4 ° C &#39;de muhafaza zorunludur. Sabitleme uzunluğu, aynı zamanda kullanılan antikor ya da RNA probu bağlı olarak, optimizasyon gerektirebilir. antikorlar için, mümkünse RNA probları için, biz yayınlanan literatür istişare tavsiye ederken, üreticinin talimatlarına uyun tavsiye edilir. Lfng ön-mRNA&#39;nın tespit bir RNA probu kullanılır. Nedeniyle bolluğu göreceli eksikliği, Lfng ön-mRNA&#39;nın tespiti iyi bir sinyal tespiti için 5x salin sodyum sitrat (SSC) ihtiva eden hibridizasyon karışımı probu ile inkübe uzun bir süre gerektirir. Aynı koşullar zayıf ifade mRNA tespit diğer problar için geçerli olabilir, ama bizim deneyim, daha istikrarlı mRNA hedeflerin tespiti hibridizasyon karışımı kısa bir prob hibridizasyon adımı ve alt SSC konsantrasyonları (örneğin, 1,3x SSC) gerektirebilir. immünohistokimya ve FISH her ikisi için, protokol ilk bütün embriyolar optimize edilmesi gerekir, ve antikorun veya prob optimum konsantrasyon ampirik olarak tespit edilmelidir. Tekniğin Sınırlamalar Yukarıda zikredildiği gibi, bu teknik başarısının proteini ve mRNA tespit kalitesi son derece bağlıdır. We protein ve mRNA tespiti nasıl geliştirilebileceği konusunda birkaç öneri ana hatlarıyla, ancak yüksek kaliteli floresan sinyal tespiti yokluğunda, deneme devam edebilirsiniz yolu yoktur var. Her bir doku numunesinde analiz edilebilir protein hedeflerinin sayısı konfokal mikroskop spektral çözünürlüğe göre ve ikinci antikor epitopları ile sınırlıdır. Bu çalışmada, her numune 12 DNA leke yanında protein tespiti için üç epitoplara kadar kullanmak için başardık. Mevcut alternatif yöntemler olarak üçe kadar hedef 14 bu geliştirmek için kullanılabilir rağmen bu protokol, tek bir mRNA hedef tespit edilmesine izin verir. Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi Burada anlatılan yöntemi tüm montaj PSM eksplantlarda düşük seviyeli protein dalgalanmaları tespit etmek için hassas bir teknik sağlar. Bu dinamiklerin miktar olankontralateral eksplantlar gelen bilinen bir saat geni için FISH gerçekleştirerek mümkün. kymographs bir kütüphane bu süre içinde ilgi hedefin uzaysal ifade dinamiklerini vurgulayarak, bir segmentasyon saat döngüsü boyunca organize edilebilir oluşturulur. diğerleri üzerinde bu tekniğin bir önemli fark geçici tarafsız bir şekilde analiz edilecek yeni saat bileşenlerinin zamanmekansal ifade dinamiklerini izin büyük veri setleri, sipariş hesaplama otomasyon kullanılmasıdır. Örneğin, bu tekniğin DLL1 ve Notch1 proteinleri ve bunların salınımlar ortak düzenlenen tüm PSM karşısında nasıl görmemizi sağladı. Bu bağlamda alternatif yöntemler de immün güvenerek, ama onlar bu yöntemi kullanarak belirgindi kaudal PSM &#39;DLL1 ve Notch1 protein seviyelerinde küçük dalgalanmalara tespit edemedik. Bunun yerine, rostral bölge 9 güçlü olduğu ifade sürekli bir gradyan rapor <syukarı&gt;, 10, 11. protein düşük düzeylerde tespit etmek için gerekli olabilir - (gece boyunca yerine 5 gün, 3), bu bu protokol daha uzun sürecek bir birincil antikor kuluçka dönemine sahip olması nedeniyle olabilir. DLL1 ve Notch1 ifade seviyeleri rostral PSM nispeten yüksek olduğundan, bu görüntüye yazarları daha ayarı düşük pozlama da örnekler kaudal protein ifadesini tespit etmek için gerekli olacaktır etkilemiş olabilir. Bir başka potansiyel farklılık Chapman ve ark çalışmasında sabitlenmemiş dokusunun kullanımından kaynaklanmaktadır. Hangi kaudal PSM içinde DLL1 ve Notch1 geçiciliği ifade daha az 9 iyi korunmuş olabilir. Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi Bu protokol, hakim sonra, yüksek verimli bir ifade analizi, PSM &#39;de ilgi herhangi bir protein için gerçekleştirilebilir.Birkaç fare yavrularına üretilen PSM eksplantlar analizi için gerekli olan yüksek örnek sayı üretmek için bir kerede işlenebilir. yalnızca bu çalışmalarda, vahşi tip embriyolar kullanmış olmasına rağmen, protein sentezleme dinamikleri üzerinde bir ya da daha fazla faktörün önemi değerlendirmek için genetik olarak modifiye edilmiş embriyolar kullanarak bu analizi gerçekleştirmek mümkündür. PSM ötesinde, bu protokol, iki karşı taraf yarısı oluşan ve hassas bir alt düzey protein ekspresyonu ve salınım dinamikleri tespit etmek için kullanılabilen diğer sistemlere adapte edilebilir. Kontralateral yarıları oluşturulur ve kültürlendi ve Çentik aktivitesi 15 desenlendirme mevcut hem de önemli olduğu gösterilmiştir olabilir çünkü bu protokol adapte edilebileceği için bir örnek, fare nöral tüpte dinamik protein ifade çalışmadır. Biz diğer sistemlere bu protokolü adapte ve gelecekteki gelişimi için geribildirim sağlamak için diğer grupları teşvik ediyoruz.

Somitlerin omurgalı türlerin geliştirilmesinde uzama vücut ekseni oluşturulan birinci segmentler ve omurga, kaburga öncüleri olan ve dermiş dokusu, hem de kas ve endotel hücrelerinin. somitogenesis sırasında, epitel Somitlerin (Referans 1 gözden) bölünmemiş presomitic mezoderm (PSM) den oluştururlar. Bu süreç çoğunlukla Notch sinyal yolunun ait, salınım genler ve proteinlerin bir ağ oluşur &quot;segmentasyon saat,&quot; düzenlenir. Segmentasyon saat tek bir hücre 2 içinde Notch aktivitesinin pulsatil üretimini sağlayacak çeşitli negatif geri besleme döngüleri oluşur (Başvurular gözden 3-6). Salınım hücre içi yöntem iyi karakterize edilirken, bu salınımlar PSM doku boyunca koordine nasıl hala büyük ölçüde bilinmemektedir. Son zamanlarda bu salınımlar essentia olduğunu, hem deneysel ve teorik çalışmalar ile, gösterilmiştirÇentik yolunun somitogenesis sürecine ve l bölümleme ve salınımlı gen ekspresyonu 7, 8 her iki sürecinde önemli bir rol oynar. Ancak, yaygın olarak bu çentik reseptörü 1 (Notch1) ile rapor edilmiştir Delta benzeri ligandı (Dll) -1 PSM 9, 10, 11, statik gradyanlar sahiptir. Biz PSM segmentasyon saatinin Notch bağımlı salınımlar fare PSM karşısında sırasıyla ana Notch yolu reseptörü ve ligand, Notch1 ve DLL1, periyodik aktivasyon bağlı olduğunu varsaydık. Bu proteinlerin statik rostral-kaudal degrade bildirdi önceki çalışmaların sonuçları biz immün teknikleri hassasiyet eksikliğinden dolayı, tahmin, bağlı idi. Onlar kuyruk PSM içinde DLL1 ve Notch1 düşük seviyeli dalgalanmaları tespit nedenle koyamadık. Biz havE saat bileşenlerinin protein salınımlar PSM 12 arasında koordine edildiği bir mekanizma tahmin matematiksel modelleme ile deneysel verileri birleştirerek, daha yakından bu faktörleri incelemek için bir yöntem geliştirdi. Bu yöntem genel amacı algılar ve PSM &#39;de düşük seviyede dinamik protein ekspresyonu miktarını ve bilinen saat genin ekspresyonuna göre ilgi konusu olan proteinlerin ekspresyon profillerini harita için, kanadını (Lfng). Fare embriyo içinde segmentasyon saatinin bir döngü tamamlamak için 2 saat sürer bu yana, çeşitli örnekleri PSM bir Lfng salınım sırasında DLL1 ve Notch1 protein ekspresyonu tam uzaysal profili oluşturmak için gereklidir. Böylece bütün montajlı düşük seviyeli protein ifadesi, kontralateral PSM eksplant yüksek verimlilik tespiti için izin vermek için bu protokolü geliştirdik. Bununla birlikte, bu teknik, aynı zamanda çalışma, sıcaklık için yararlı olabilirşapka kontralateral ikiye bölünebilir herhangi embriyonik doku içindeki düşük seviyeli protein dinamikleri karakterize hedefliyoruz.

<table><tbody><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&trade;-1 (100x)</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, nitelikli, AB onaylı, Güney Amerika menşeili</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan FGF-basic (154 a.a.)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>anti-fare monoklonal Notch1 antikoru^</td><td>BD Pharmingen</td><td>552466</td><td></td></tr><tr><td>anti-sıçan poliklonal Dll1 antikoru^*</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lfng intronik anti-sens RNA probu^*</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>%16 paraformaldehit</td><td>Pierce (ThermoFischer Scientific)</td><td>PI28908</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K, rekombinant, PCR derecesi&nbsp;</td><td>Roche (Sigma-Aldrich)</td><td>31158</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4</td><td>Evde üretilmiştir</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Normal keçi serumu (NGS) (ısıl işlem görmüş)</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>16210072&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46139</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>340855</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Salin-sodyum sitrat (SSC)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>93017</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>798681&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche (Sigma-Aldrich)</td><td>101095</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris-tamponlu salin (TBS)</td><td>Evde üretilmiştir</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bloke Edici Tampon Reaktifi&nbsp;</td><td>Roche (Sigma-Aldrich)</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>anti-DIG yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge antikoru</td><td>Roche (Sigma-Aldrich)</td><td>11207733910</td><td></td></tr><tr><td>Tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) kiti</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL744001KT</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">*Bu çalışmada kullanılan Dll1 antikoru ve RNA probu ticari olarak mevcut değildir. Lütfen kaynaklar için teşekkür bölümlerine bakın.</td></tr><tr><td colspan="4">^Antikorlar/RNA probları, okuyucunun araştırma ilgi alanlarına uygun olan kaynaklardan sağlanmalıdır.</td></tr></tbody></table>

detaylı mekansal İfade haritalar dinamik İfade verilerinin zamansal sipariş

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

Somitogenez sırasında, epitelyal somit çiftleri ilerleyici bir şekilde oluşur ve somitik öncesi mezodermin (PSM) ön ucundan sıkı bir türe özgü periyodiklik ile tomurcuklanır. İşlemin periyodikliği, PSM hücrelerinde hareket eden "segmentasyon saati" olarak bilinen bir moleküler osilatör tarafından düzenlenir. Bu saat, gen ekspresyonunun salınım modellerini PSM boyunca arka-ön yönde hareket ettirir. Bu sözde saat genleri, üç sinyal yolunun temel bileşenleridir: Wnt, Notch ve fibroblast büyüme faktörü (FGF). Ek olarak, Çentik sinyali, komşu hücrelerdeki hücre içi salınımları senkronize etmek için gereklidir. Yakın zamanda bunun mekanik olarak nasıl düzenlenebileceğine dair fikir edindik. Ligand aktivasyonu üzerine, Notch reseptörü bölünür ve çekirdeğe hareket eden ve gen ekspresyonunu düzenleyen hücre içi alanı (NICD) serbest bırakır. NICD oldukça kararsızdır ve fosforilasyona bağlı cirosu, Notch sinyalizasyonunu kısıtlamak için hareket eder. PSM'deki NICD üretiminin (ve bozunmasının) profilinin salınımlı olduğu ve bir saat genininkine benzediği bilinmektedir. Yakın zamanda, hücreler arası eşleşmeye aracılık eden hem Notch reseptörünün hem de Delta ligandının kendilerinin hem mRNA hem de protein seviyelerinde dinamik ekspresyon sergilediğini bildirdik. Bu makalede, ifade döngüsünün farklı noktalarından ifade verilerini ayıklamak ve üst üste bindirmek için tasarladığımız hesaplamalı modelleme ile birlikte kullandığımız hassas algılama yöntemlerini ve ayrıntılı görüntü analizi araçlarını açıklıyoruz. Bu, bir salınım döngüsü boyunca reseptör, ligand ve Notch hedef saat genleri için dinamik ekspresyon profilinin uzaysal-zamansal bir resmini oluşturmamıza izin verdi. Burada, PSM eksplantlarını oluşturmak ve kültürlemek için kullanılan protokollerin yanı sıra mRNA veya protein için boyama prosedürünü açıklıyoruz. Ayrıca, konfokal görüntülerin daha sonra nasıl analiz edildiğini ve PSM boyunca Delta benzeri1 (Dll1) ve Notch1'in uzay-zamansal ifadesinin görselleştirilmesi için bundan sonra "kymograflar" olarak tanımlanan saat ifadesi anlık görüntülerinin sıralı dizilerini oluşturmak için zamansal olarak hesaplamalı olarak nasıl sıralandığını açıklıyoruz.

Bu protokol, fare PSM 12 saat, gen transkripsiyonu yanında ilgi bir proteinin Spatiotemporal profilinin görselleştirme izin verir. Örneğin, DLL1 (Şekil 1A-C) ve Notch1 (Şekil 1D-F) proteini sentezleme Çentik düzenlenir bölütleme saat gen Lfng olgunlaşmamış transkripsiyon ile eşzamanlı üzerinden salınım gösterilmiştir. DLL1, Notch1 ve Lfng (i) PSM (Şekil 1G) ve ön-arka (AP) eksenine göre sinyal yoğunluğu bu hedeflere (Şekil 1 H-J) için açık salınım ifade dinamiklerini ortaya miktarının belirlenmesi. Saat döngüsü boyunca DLL1 ve Notch1 protein ekspresyonu zamanmekansal profil açıkça görüntülenmiştir ve yüksek çözünürlüklü sabit doku görüntü veri alım sonrası görüntü analizi ile bu protokolü kullanarak ölçülür. Şekil 1: uzay-zamansal Görselleştirme ve DLL1 Niceleme ve Notch1 Protein Ekspresyonu Dinamikleri. (AF) tespiti ile birlikte bir yarısında DLL1 proteini (AC) veya Notch1 proteini (DF) uzaysal dağılımını gösteren altı E10.5 embriyolar (AF) Lfng pre-mRNA (Lfng (I) &#39;) için eksplant Çift her bir çiftin karşı yarı tekabül eder. Lfng (i) İfade mekansal profili tarafından belirlenen Paneller, Faz 1 (A ve D), Faz 2 (B ve E) ve segmentasyon saat döngüsü Faz 3 (C ve F) göre düzenlenir. PSM&#39;nin anteroposterior ekseni boyunca DLL1 (yeşil), Notch1 (kırmızı) ve Lfng (I) &#39;in (gri) için ifade etki derecesi b sahiprenk kodlu çubuklarla çizilmiş een. Noktalı çizgiler, en son meydana hücre gruplarının (s), PSM dış kenarları ve bitişik sinir doku (C ve D) konumlarını ayırmak. Ölçek çubukları (alt, her panelin AF sol) 100 um temsil etmektedir. (G) PSM genelinde sinyal yoğunluğunda eksenel varyasyonu gösteren bir örnek yoğunluğu arsa. Veri karşı eksplant Notch1 protein (kırmızı) (embriyo 1), hem de Lfng ön-mRNA&#39;nın (siyah bir katı çizgi) ile karşılaştırıldığında, bir eksplant Lfng ön-mRNA&#39;nın (siyah kesikli çizgi) gösteren iki eksplant çiftlerinden çizilen başka bir eksplant kontralateral eksplant (Embriyo 2) &#39;de DLL1 proteini (yeşil) ile karşılaştırıldığında. Ölçülen sinyal yoğunluğu (y-ekseni) eksenel pozisyonu karşı çizilir (x-ekseni; [A] sola doğru ve posterior PSM [P] PSM anterior). Boyunca (H) DLL1, Notch1 ve Lfng (i) &#39;nin uzamsal dağılımını gösteren bir kymographÇok sayıda PSM. kymograph her bir satırı ayrı bir PSM eksplant sinyal yoğunluğu temsil eder. Sıralar Lfng ön-mRNA&#39;nın (I) &#39;de gösterilen veri periyodik uzantısı simüle birden çok saat osilasyonları DLL1, Notch1 ve Lfng (I)&#39; uzaysal dağılımının uzaysal dağılımına göre zamansal sırasında düzenlenir (H) , DLL1 ve Notch1 ifade dinamikleri salınım doğasını vurgulayarak. Kaudal PSM içinde (J) Pulsatil Notch1 protein ekspresyonu (I) &#39;de gösterildiği sanal kymograph demarcated bölgenin büyütme ile vurgulanır. Referans 12. modifiye <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55127/55127fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55127/55127fig2.jpg" /> Şekil 2: DLL1 ve Notch1 Protein Ekspresyonu uzay-zamansal Dynamics miktarının belirlenmesi. (A), bir örneği, yoğunluk haritası PSM boyunca sinyal yoğunluğundaki eksenel varyasyonunu göstermektedir. Veriler bir yarım eksplant kontralateral eksplant devre Notch1 protein (kırmızı), hem de Lfng ön-mRNA&#39;nın (siyah bir katı çizgi) ile karşılaştırıldığında, bir eksplant Lfng ön-mRNA&#39;nın (siyah kesikli çizgi) gösteren iki eksplant çiftlerinden çizilen ikinci kuyruk kontralateral eksplant yarısında DLL1 protein (yeşil) ile karşılaştırıldığında ikinci kuyruk. Ölçülen şiddetleri (y-ekseni) eksenel pozisyonu karşı çizilen (x-ekseni, rostral [A] sola sağa ve kaudal [P]). (BH) Kymographs sayıda PSM boyunca Notch1, DLL1, NiCd ve Lfng (i) &#39;nin uzamsal dağılımını göstermektedir. (B ve C) NICD (B) ve DLL1 (C) PSM bölümlerinde sentezleme; (D ve E) Lfng (I) &#39;in (D) ile DLL1 (&lt;kontralateral eksplant yarıya strong&gt; E); (F ve G) karşı eksplant yarıya Lfng (I) &#39;in (F) ve Notch1 (G). Referans 12. itibaren <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55127/55127fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Segmentasyon saati, somitik öncesi mezoderm (PSM) boyunca salınımlı gen ekspresyonunu yönlendirir. Dinamik Çentik etkinliği bu sürecin anahtarıdır. Delta ligand ve Notch reseptör ekspresyonunun omurgalı PSM'de salındığını göstermek için uzamsal ifade verilerinden zamansal dinamikleri çıkarmak için görüntüleme ve hesaplamalı analizler kullanıyoruz.

Detaylı Mekansal İfade Haritalar Dinamik İfade Verilerinin Zamansal Sipariş

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Bu deneysel prosedürün genel amacı, sabitlenmiş doku örneklemesi kullanarak omurgalı segmentasyon saatinin uzaysal-zamansal gen ekspresyon dinamiklerini haritalandırmaktır. Bu yöntem, presomitik mezodermdeki osilatuar gen dinamiklerinin tarafsız bir değerlendirmesine olanak tanır ve bu, omurgalı somatojenesini yöneten moleküler mekanizmaları anlamak için kritik öneme sahiptir. Bu tekniğin temel avantajı, birçok örneğin eş zamanlı olarak oluşturulabilmesi ve işlenebilmesiyle, sabitlenmiş dokudaki gen ekspresyon dinamiklerinin yüksek çözünürlüklü analizine imkan tanımasıdır.Prosedürü, laboratuvarımda eski doktora sonrası araştırmacı olan Dr. Charlotte Bailey gerçekleştirecektir. Metin protokolüne uygun olarak bir fare uterus boynuzu elde ettikten sonra, bir stereo mikroskop altında, uterus boynuzunun kalın kaslı membranını kesmek ve her bir embriyoyu dikkatlice çıkarmak için kavisli makaslar kullanın. Kavisli makaslar ve ince pensetler yardımıyla, amniyotik keseyi her bir embriyodan ayırarak diseke edin.Ardından, cerrahi bir iğne veya kavisli makas kullanarak, embriyoyu arka ekstremite tomurcuklarının önünden keserek her bir embriyodan kuyruk dokusunu hasat edin. Kuyruk dokusunu ventral tarafı aşağı gelecek şekilde dengeleyin. Daha sonra, iğne ile nazik bir sallama hareketi yaparak kuyruk dokusunu orta hat boyunca ikiye bölerek PSM eksplant çiftleri oluşturun.Neural tüp, notokord ve PSM dokusunun iki eksplant arasında eşit şekilde bölündüğünden emin olun. Ardından, her bir kontralateral PSM eksplantını, önceden ısıtılmış kültür ortamının küçük bir hacmi içinde 35 mm'lik plastik kültür kabı kapağının alt yüzeyine pipetleyin. Kabı kapağın üzerine yerleştirin ve hızla ters çevirin; böylece PSM dokusu, ortamın asılı bir damlası şeklinde kapaktan sarkmış olacaktır.Ardından PSM eksplantlarını nemlendirilmiş bir bölmede 37 °C'de bir ila iki saat boyunca kültüre edin. PSM eksplant çiftlerini 24 kuyucuklu bir doku kültürü plağının münferit kuyucuklarına aktarın. Daha sonra örneklere PBS içinde %4 paraformaldehit ekleyin ve plağı oda sıcaklığında bir saat veya sallama platformu üzerinde 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından, oda sıcaklığında sallantılı bir platform üzerinde PBS kullanarak örnek kuyucuklarını yıkayın. İnce plastik bir Pasteur pipeti ile örneklerdeki PBS çözeltisini üç ila dört kez değiştirin. İmmünohistokimya işlemini gerçekleştirmek için, her embriyonik çiftten bir PSM eksplantına PBS içinde %2 Triton X-100 ekleyin ve örnekleri yıkamak amacıyla oda sıcaklığında, sallantılı bir platform üzerinde bir saat boyunca inkübe edin.Numuneleri kısaca durulamak için PBS kullanın. Ardından PBS'yi bloklama çözeltisi ile değiştirin ve numuneleri sarsıntılı bir platformda, dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Çalışma tamponu kullanarak istenilen primer antikorları seyreltin.Bu örnekte, Delta-like 1 ve Notch1 antikorları 1:25 dilüsyonunda kullanılmıştır. Antikorları eksplantlara ekleyin ve örnekleri sallantılı bir platformda, dört derece Celsius'ta üç ila beş gün boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, örnekleri PBS kullanarak beş ila on dakika sürer şekilde iki kez yıkayın.Ardından, oda sıcaklığında sallama platformu üzerinde, PBS içinde %0,3 Triton X-100 ile üç kez yıkama işlemi gerçekleştirin. Sekonder antikorları çalışma tamponu ile seyrelttikten sonra, antikor agregatları içerebilen son birkaç mikrolitrelik solüsyonu kullanmamaya dikkat ederek, her bir örnek kuyucuğuna 250-500 µL antikor solüsyonu ekleyin. Plakayı alüminyum folyo ile kapatın ve örnekleri sekonder antikor solüsyonu içinde, karanlıkta, 4 °C'de üç ila beş gün boyunca inkübe edin.İnkübasyon sonrası, örnekleri onar kez onar dakika boyunca PBST ile yıkayın. Ardından, dokuyu oda sıcaklığında, sallayıcı bir platform üzerinde beş dakika boyunca bir kez PBS ile yıkayın. Metin protokolünü takip ederek, geri kalan kontralateral PSM eksplantlarını bir etanol PBST dilüsyon serisi aracılığıyla dehidrate ve rehidrate edin.Eksplantlara 0,1% PBST içinde mililitre başına on mikrogram Proteinaz K ekleyin ve dokuyu çalkalamadan beş dakika boyunca inkübe edin. Ardından Proteinaz K solüsyonunu hızla uzaklaştırın ve örnekleri kısaca durulamak için PBST kullanın. PSM eksplantlarını sabitlemek (post-fix) için bunlara PBST içinde %4 formaldehit ve %0,1 glutaraldehit ekleyin ve örnekleri 30 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, örnekleri PBST kullanarak onar dakika boyunca iki kez yıkadıktan sonra, dokuya %50 hibridizasyon karışımı ekleyin ve çalkalamadan 65 degrees Celsius'de on dakika inkübe edin. Örnekleri ve hibridizasyon karışımını metin protokolüne göre inkübe ettikten sonra, solüsyonu uzaklaştırın ve bilinen bir segmentasyon saati bileşenine karşı digoksinen etiketli antisense RNA probu içeren, önceden ısıtılmış 0.25 ile 0.5 milliliters hibridizasyon karışımı ekleyin. Plakayı kapatmak için yapışkan bant kullanın ve örnekleri iki gece boyunca 65 degrees Celsius'de inkübe edin.İnkübasyonun ardından, numuneleri 15 dakika boyunca yıkamak için TBST içinde önceden ısıtılmış %50 hibridizasyon karışımı kullanın. Daha sonra numuneleri TBST ile iki kez durulayın ve ardından dokuyu oda sıcaklığında, sallantılı bir platform üzerinde TBST içinde 30 dakika boyunca inkübe edin. Sonrasında, eksplantları en az iki saat boyunca bloklama çözeltisinde ön inkübasyona tabi tutun.Ardından çözeltiyi, 1:200 dilüsyonda HRB konjuge anti-digoksinen antikor içeren taze bloklama çözeltisiyle değiştirin. Numuneleri dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, oda sıcaklığında numuneleri üç kez TBST ile durulayın ve yeni bir 24 kuyucuklu doku kültürü plağının ayrı kuyucuklarına aktarın.Ardından eksplantları, her biri bir saat sürecek şekilde TBST ile üç kez yıkayın. Numuneleri görüntüleme için hazırlamadan önce, saptanan mRNA'yı görselleştirmek için bir tyramide sinyal amplifikasyon kiti kullanın. 0,12 mm kalınlığındaki bir görüntüleme ara parçasının yapışkan astarını çıkarıp bir cam lam üzerine yapıştırarak, her eksplant çifti için bir adet yüklü yapışkan cam lam hazırlayın.Metin protokolüne göre bir çift eksplant lam üzerine yerleştirildikten sonra, doku tamamen kurumadan, yapışkan ve yarı saydam görünmeye başlayana kadar örneklerin lama yapışması için 45-60 saniye bekleyin. Bu sırada, pens kullanarak ara parçadan kalan yapışkan astarı çıkarın ve ara parçanın merkezindeki örneklerin üzerine büyük bir damla çift fonksiyonlu montaj ortamı ve berraklaştırma solüsyonu ekleyin. Montaj ortamının eşit şekilde dağıldığından ve tüm kenarların ara parçayla temas ettiğinden emin olarak örneklerin üzerine dairesel bir kapatma camı uygulayın.Ardından, lamel slaytını düşük havlı bir kağıdın üzerine ters şekilde yerleştirin. Lamelin ara parçaya tamamen yapıştığından ve fazla montaj ortamının uzaklaştırıldığından emin olmak için sıkıca bastırın. Kağıda artık montaj ortamı bulaşmayana kadar bu işlemi tekrarlayın.Lamı temizleyip etiketleyin ve görüntüleme işlemine kadar karanlıkta saklayın. Ardından, metin protokolüne uygun olarak görüntüleme ve analizleri gerçekleştirin. Bu deneyde, her eksplant çiftinin bir yarısında tespit edilen Notch tarafından düzenlenen segmentasyon saati geni intronic lunatic fringe'in yeni başlayan transkripsiyonuna göre embriyolar geçici olarak düzenlenerek, Delta-Like 1 ve Notch1 protein ekspresyonlarının senkronize olmayan şekilde osile olduğu gösterilmiştir.Paneller, segmentasyon saati döngüsünün birinci, ikinci ve üçüncü fazlarına göre düzenlenmiştir. Delta-Like 1, Notch1 ve intronic lunatic fringe ekspresyon alanlarının PSM'nin anteroposterior ekseni boyunca uzanımı, renk kodlu çubuklarla belirlenmiştir. Burada gösterildiği gibi, Delta-Like 1, Notch1 ve intronic lunatic fringe sinyal yoğunluğunu PSM'nin anteroposterior eksenine göre nicelendirmek için bir grafik oluşturulmuştur; bu grafik, saat döngüsü boyunca PSM genelindeki aksiyel varyasyonu ve sinyal yoğunluğunu örneklendirmektedir.Kimograflar; Delta-Like 1, Notch1 ve intronic lunatic fringe'in çok sayıda PSM boyunca uzamsal dağılımını görselleştirir. Kimografın her satırı, tek bir PSM eksplantının sinyal yoğunluğunu temsil eder. Delta-Like 1, Notch1 ve intronic lunatic fringe sinyal yoğunluğunun PSM'nin anteroposterior eksenine göre nicelleştirilmesi, bu hedefler için belirgin osilatuar ekspresyon dinamiklerini ortaya koymaktadır.Son olarak, bu kimograflar, çok sayıda PSM boyunca Notch reseptörünün kesilmiş ve aktive edilmiş formu olan NICD, Delta-Like 1, intronic lunatic fringe ve Notch1'in uzaysal dağılımını göstermektedir. Bu teknik, omurgalı mitogenezi alanındaki araştırmacıların, civciv ve fare presomitik mezodermindeki segmentasyon geni osilasyon dinamiklerini daha iyi anlamalarına yardımcı olmuştur. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, çok sayıda örnek üzerinde uygulanabilir ve böylece ilgilenilen birçok mRNA ve proteinin ekspresyon profillerinin aynı anda analiz edilmesine olanak tanır.Bu prosedürün ardından, görüntü verilerinin ek nicelleştirmesi, araştırmacı için ilgili RNA ve protein sinyallerinin hücresel alt lokalizasyonunun yanı sıra gen ifadesindeki zamansal gecikmelerin anlaşılmasını sağlayabilir. Bu videoyu izledikten sonra, kalın doku örneklemesi kullanarak omurgalı segmentasyon saatinin uzamsal-zamansal gen ifadesi dinamiklerini nasıl haritalandıracağınız konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu işlem, metin protokolünde detaylandırıldığı üzere otomatik görüntü analizi ile takip edilebilir.Bu prosedürü uygularken, PSM eksplantları arasında PSM, notokord ve nöral tüpün eşit şekilde dağıldığından emin olmak ve başlamadan önce antikor dilüsyonlarını dikkatlice optimize etmek önemlidir. Formamid, paraformaldehit ve glutaraldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Kişisel koruyucu ekipman giymeye ve uygun olan durumlarda çeker ocak içerisinde çalışmaya özen gösterin.

temporal-ordering-dynamic-expression-data-from-detailed-spatial

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz giriş, izleme ve bitki hücrelerinde GFP ifade kantitatif analizi için bir yöntem raporu. Bu yöntem, zaman içinde, çok sayıda örneklerin yarı-sürekli bir resim koleksiyonu için özel olarak tasarlanmış bir robotik sistem kullanır. Ayrıca görüntü serisi analizi için ImageJ ve ImageReady kullanımını göstermek.

Bitkisel Dokular Gen İfade Araştırmalar Robotik ve Dinamik Görüntü Analizi

Akış sitometrisi ve mikroskopiye dayanan iki yardımcı yöntem mayada bir MAPK yolağının aktivasyonu ile uyarılan gen ekspresyonunun dinamiklerinin tek hücre düzeyinde miktarının, ki olanak sunulmaktadır.

Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

Hücre altı düzeyde, sinyal olayları gelişimsel ve çevresel ipuçları tarafından dinamik olarak modüle edilir. Burada, dinamik protein-protein etkileşimini izlemek ve bitki hücrelerinde sinyal iletiminin uzamsal organizasyonunu açıklamak için tütün geçici ekspresyon sistemini kullanan bir protokolü açıklıyoruz.

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Biz disseke C. aktif ERK mekansal ve zamansal lokalizasyonu için immünofloresan görüntüleme bazlı yöntem mevcut elegans gonad. Burada açıklanan protokol C herhangi bir sinyal görüntülenmesi veya yapısal protein için uyarlanabilir elegans yumurtalık, uygun bir antikor reaktifi kullanılabilir sağladı.

Aktif ERK Mekansal ve Zamansal Analizi<em&gt; C. elegans</em&gt; Germline

Burada sunulan bitki dokularının lazer yakalama mikrodisseksi (LCM) için bir protokoldür. LCM, doku alanlarını kontaminasyonsuz bir şekilde izole etmek için mikroskobik bir tekniktir. Prosedür doku fiksasyonu, parafin katıştırma, kesit, LCM ve RNA ekstraksiyon içerir. RNA, transkripsiyonların alt dokuya özgü, zamansal olarak çözümlenmiş analizinde kullanılır.

Bitkilerde Mekansal ve Zamansal Dokuya Özgü Gen Ekspresyonu Analizi için Lazer Yakalama Mikrodiszesi RNA-Dizileme

Burada, tümör mikro ortamını daha iyi karakterize etmek ve spesifik hücre popülasyonlarını tanımlamak için Spatial Omics teknolojileri için ilgi çekici bölgelere (ROI'ler) ince ayar yapmak için bir protokol açıklıyoruz. Proteomik testler için, otomatik özelleştirilmiş protokoller ROI seçimine rehberlik edebilirken, transkriptomik tahliller 50 μm kadar küçük ROI'ler kullanılarak ince ayarlanabilir.

Dokuda Protein ve RNA Ekspresyonunun Uzamsal Profillemesi: Sanal Mikrodiseksiyona İnce Ayar Yapmaya Bir Yaklaşım

Bu makale, uzamsal transkriptomik için dinamik, etkileşimli bir veritabanı olan DeepSpaceDB'yi kullanmak için bir protokol sunar ve doku organizasyonunu ve hastalıkla ilgili gen ekspresyonunu keşfetmek için analiz iş akışları ve örnekler sunar.

DeepSpaceDB kullanarak Uzamsal Transkriptomik Veri Kümelerinin Madenciliği

Bu protokol, kamuya açık veri edinimi ve Seurat tabanlı kalite kontrolden başlayarak entegrasyon, mekânsal özellik tespiti, hücre tipi dekonvolsiyonu, ilgi bölgesi anotasyonu ve hücre-hücre iletişimi analizine kadar uzanan, şeffaf yürütmeyi destekleyen pratik kontrol noktalarıyla birlikte, mekânsal transkriptomik verilerin analizi için tekrarlanabilir bir iş akışı sunmaktadır.

Siyasal Transkriptomik Veri Analizi İçin Pratik Bir İş Akışı: Veri Eldesinden İleri Analizlere

Bu çalışma, bir doku kesitinin doğrudan uzamsal barkodlamasını tek hücreli çoklu analiz ile birleştiren bir uzamsal Trekker–CUT&amp;Tag çoklu protokolü sunmaktadır. Bu yaklaşım, gen ekspresyonunun ve histon H3K27ac modifikasyonunun aynı anda mekansal olarak çözülen tek hücreli profillenmesini sağlar ve doku mikroanatomisi bağlamında gen düzenlemesine mekanik içgörüler sunar.

Donmuş doku kesitlerinde transkriptom ve epigenomik hedeflerin mekansal çözülmüş, entegre tek hücreli multiomik profillenmesi

Biz Branchiostoma lanceolatum ve döllenmemiş oosit içine burada mRNA enjeksiyonundan sonra floresan proteinleri sağlam ve verimli bir ifade rapor. Bu bazal kordalısı içinde mikroenjeksiyon tekniği gelişimi, gelişmekte olan bu model sistemde teknik yenilikleri geniş kapsamlı vivo görüntüleme ve gen-spesifik manipülasyonlar dahil önünü açacak.

Floresan protein ifadesindeki Branchiostoma lanceolatum Döllenmemiş Oositlerinin içine mRNA Enjeksiyon

Keşfedin omurga segmentasyon saatinin mekansal-zamansal gen ifade dinamiklerini sabit doku örnekleme kullanarak. Bu hesaplamalı yöntem, presomitik mezodermde salınımlı gen dinamiklerinin tarafsız değerlendirilmesini sağlar.

Detaylı Mekansal İfade Haritalar Dinamik İfade Verilerinin Zamansal Sipariş

Daha fazla video keşfet