Detaylı Mekansal İfade Haritalar Dinamik İfade Verilerinin Zamansal Sipariş

Bu deneysel prosedürün genel amacı, sabit doku örneklemesi kullanarak omurgalı segmentasyon saatinin uzaysal-zamansal gen ekspresyon dinamiklerini haritalamaktır. Bu yöntem, presomitik mezodermdeki salınımlı gen dinamiklerinin tarafsız bir değerlendirmesine izin verir ve bu, omurgalı somatogenezini yöneten moleküler mekanizmaları anlamak için çok önemlidir. Bu tekniğin ana avantajı, birçok numunenin aynı anda üretilebilmesi ve işlenebilmesidir, bu da sabit dokudaki gen ekspresyon dinamiklerinin yüksek üç parçalı analizine izin verir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımda eski bir doktora sonrası olan Dr.Charlotte Bailey olacak. Metin protokolüne göre bir fare rahim boynuzu elde ettikten sonra, stereo mikroskop altında, rahim boynuzunun kalın kas zarını kesmek için kavisli makas kullanın ve her embriyoyu dikkatlice çıkarın. Kavisli makas ve ince forsepslerle, amniyotik kesesi her embriyodan çıkarın.

Daha sonra cerrahi bir iğne veya kavisli bir makas kullanarak, embriyoyu arka bacak tomurcuklarına ön keserek her embriyodan kuyruk dokusunu toplayın. Kuyruk dokusunu ventral tarafı aşağı bakacak şekilde dengeleyin. Ardından, iğne ile hafif bir sallanma hareketi kullanarak kuyruk dokusunu orta hat boyunca iki yarıya bölerek PSM eksplant çiftleri oluşturun.

Nöral tüp, notokord ve PSM dokusunun iki eksplant arasında eşit olarak bölündüğünden emin olun. Ardından, her bir kontralateral PSM eksplantını, küçük bir hacimde önceden ısıtılmış kültür ortamında 35 mm'lik bir plastik kültür kabı kapağının alt tarafına pipetleyin. Çanağı kapağın üstüne yerleştirin ve hızlı bir şekilde ters çevirin, böylece PSM dokusu kapaktan asılı bir orta damla halinde asılı kalır.

Daha sonra PSM eksplantlarını bir ila iki saat boyunca 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir odada kültürleyin. PSM eksplant çiftlerini 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının ayrı kuyucuklarına aktarın. Daha sonra numunelere PBS'de% 4 paraformaldehit ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında bir saat veya gece boyunca sallanan bir platform üzerinde dört santigrat derecede inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, numune kuyucuklarını oda sıcaklığında sallanan bir platform üzerinde yıkamak için PBS'yi kullanın. İnce plastik bir Pasteur pipeti ile PBS solüsyonunu numuneler üzerinde üç ila dört kez değiştirin. İmmünohistokimyayı gerçekleştirmek için, her embriyonik çiftten bir PSM eksplantına PBS'de% 2 Triton X-100 ekleyin ve numuneleri yıkamak için bir saat boyunca sallanan bir platformda oda sıcaklığında inkübe edin.

Numuneleri kısa bir süre durulamak için PBS'yi kullanın. Daha sonra PBS'yi bloke edici çözelti ile değiştirin ve numuneleri gece boyunca sallanan bir platform üzerinde dört santigrat derecede inkübe edin. Çalışma tamponu kullanarak, istenen birincil antikorları seyreltin.

Bu örnekte, Delta benzeri 1 ve Notch1'e karşı antikorlar 1:25'lik bir seyreltmede kullanılır. Antikorları eksplantlara ekleyin ve numuneleri üç ila beş gün boyunca dört santigrat derecede sallanan bir platformda inkübe edin. İnkübasyonun ardından, numuneleri her biri beş ila on dakika boyunca iki kez yıkamak için PBS kullanın.

Daha sonra, sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında PBS'de% 0.3 Triton X-100'de üç yıkama gerçekleştirin. İkincil antikorları çalışma tamponunda seyrelttikten sonra, antikor agregaları içerebilecek son birkaç mikrolitre çözeltiyi kullanmamaya dikkat ederek, her numune kuyucuğuna 250-500 mikrolitre antikor çözeltisi ekleyin. Kalay folyo ile plakayı örtün ve numuneleri karanlıkta dört santigrat derecede üç ila beş gün boyunca ikincil antikor çözeltisi içinde inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, numuneleri her biri on dakika boyunca iki kez yıkamak için PBST kullanın. Ardından, dokuyu oda sıcaklığında bir kez sallanan bir platformda beş dakika boyunca yıkamak için PBS'yi kullanın. Metin protokolünü takiben, kalan kontralateral PSM eksplantlarını bir etanol PBST seyreltme serisi yoluyla dehidre edin ve yeniden sulandırın.

Eksplantlara% 0.1 PBST'de mililitre başına on mikrogram Proteinaz K ekleyin ve dokuyu beş dakika boyunca çalkalamadan inkübe edin. Daha sonra Proteinaz K çözeltisini hızlı bir şekilde çıkarın ve numuneleri kısaca durulamak için PBST kullanın. PBST'de %4 formaldehit ve %0.1 gluteraldehit ekleyin, PSM eksplantlarına sonradan sabitlemek için ekleyin ve numuneleri 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra, numuneleri her biri on dakika boyunca iki kez yıkamak için PBST kullandıktan sonra, dokuya% 50 hibridizasyon karışımı ekleyin ve on dakika boyunca çalkalama olmadan 65 santigrat derecede inkübe edin. Numuneleri ve hibridizasyon karışımını metin protokolüne göre inkübe ettikten sonra, çözeltiyi çıkarın ve bilinen bir segmentasyon saati bileşenine karşı digoksijenin etiketli bir antisens RNA probu içeren 0,25 ila 0,5 mililitre önceden ısıtılmış hibridizasyon karışımı ekleyin. Plakayı kapatmak için yapışkan bant kullanın ve numuneleri iki gece boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, numuneleri 15 dakika yıkamak için TBST'de önceden ısıtılmış %50 hibridizasyon karışımı kullanın. Daha sonra, dokuyu oda sıcaklığında 30 dakika boyunca sallanan bir platformda TBST'de inkübe etmeden önce numuneleri iki kez durulamak için TBST kullanın. Daha sonra, eksplantları en az iki saat boyunca bloke edici çözelti içinde önceden inkübe edin.

Daha sonra çözeltiyi, 1:200 oranında seyreltilmiş HRB konjuge anti-digoksigenin antikoru içeren taze bloke edici çözelti ile değiştirin. Numuneleri gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, numuneleri oda sıcaklığında üç kez durulamak için TBST'yi kullanın ve bunları yeni bir 24 oyuklu doku kültürü plakasının ayrı oyuklarına aktarın.

Daha sonra TBST ile, eksplantları her biri bir saat boyunca üç kez yıkayın. Numuneleri görüntüleme için hazırlamadan önce tespit edilen mRNA'yı görselleştirmek için bir tiramid sinyal amplifikasyon kiti kullanın. Yapışkan astarı 0,12 mm kalınlığındaki bir görüntüleme ara parçasından çıkararak ve bir cam slayta yapıştırarak her bir eksplant çifti için bir şarjlı yapışma cam slaytı hazırlayın.

Metin protokolüne göre lam üzerine bir çift veya eksplantlar yerleştirdikten sonra, doku tamamen kurumadan yapışkan ve yarı saydam görünmeye başlayana kadar numunelerin 45-60 saniye boyunca slayta yapışmasına izin verin. Bu arada, kalan yapışkan astarı ara parçadan çıkarmak için forseps kullanın ve ara parçanın ortasındaki numunelere büyük bir damla çift işlevli montaj ortamı ve temizleme solüsyonu ekleyin. Montaj ortamının eşit olarak dağıldığından ve tüm kenarların ara parça ile temas ettiğinden emin olarak numuneler boyunca dairesel bir lamel uygulayın.

Ardından, lamel slaytını baş aşağı aşağı düşük tüylü bir kağıda yerleştirin. Lamelin ara parçaya tam olarak yapıştığından ve fazla montaj ortamının çıkarıldığından emin olmak için sıkıca bastırın. Bu işlemi, daha fazla montaj ortamı kağıdı lekelemeyene kadar tekrarlayın.

Slaytı temizleyin ve etiketleyin ve görüntüye kadar karanlıkta saklayın. Ardından metin protokolüne göre görüntüleme ve analiz yapın. Bu deneyde, Delta-Like 1 ve Notch1 protein ekspresyonunun, her bir eksplant çiftinin yarısında tespit edilen Notch tarafından düzenlenen segmentasyon saat geni intronik lunatik saçağın yeni ortaya çıkan transkripsiyonuna göre embriyoları geçici olarak düzenleyerek senkronizasyon dışı salınım yaptığı gösterilmiştir.

Paneller, segmentasyon saat döngüsünün birinci, ikinci ve üçüncü aşamalarına göre düzenlenmiştir. PSM'nin ön-arka ekseni boyunca Delta-Like 1, Notch1 ve intronik lunatic saçak için ifade alanlarının kapsamı, renk kodlu çubuklarla sınırlandırılmıştır. Burada gösterildiği gibi, PSM'nin ön-arka eksenine göre Delta-Like 1, Notch1 ve intronik lunatik saçak sinyal yoğunluğunu ölçmek için bir çizim oluşturulur ve saat döngüsü boyunca PSM boyunca eksenel değişimi ve sinyal yoğunluğunu gösterir.

Kymograph'lar, çok sayıda PSM'de Delta-Like 1, Notch1 ve intronik lunatic fringe'in uzamsal dağılımını görselleştirir. Kymografın her sırası, ayrı bir PSM eksplantının sinyal yoğunluğunu temsil eder. PSM'nin ön-arka eksenine göre Delta-Like 1, Notch1 ve intronik lunatik saçak sinyal yoğunluğunun nicelleştirilmesi, bu hedefler için net salınım ifade dinamiklerini ortaya koymaktadır.

Son olarak, bu kimografiler, Notch reseptörü NICD, Delta-Like 1, intronic lunatic fringe ve Notch1'in bölünmüş ve aktive edilmiş formunun çok sayıda PSM boyunca uzamsal dağılımını gösterir. Bu teknik, civciv ve fare presomitik mezodermindeki segmentasyon gen salınım dinamiklerini daha iyi anlamak için omurgalıların mitogenezi alanındaki araştırmacılara yardımcı olmuştur. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, birkaç mRNA'nın ve ilgilenilen proteinlerin ekspresyon profillerinin aynı anda analiz edilmesine izin veren çok sayıda numune üzerinde gerçekleştirilebilir.

Bu prosedürü takiben, görüntü verilerinin ek nicelleştirilmesi, gen ekspresyonundaki zamansal gecikmelerin yanı sıra araştırmacının ilgilendiği hem RNA hem de protein sinyallerinin hücre altı lokalizasyonunun anlaşılmasını sağlayabilir. Bu videoyu izledikten sonra, kalın doku örneklemesi kullanarak omurgalı segmentasyon saatinin mekansal-zamansal gen ekspresyon dinamiklerini nasıl haritalayacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Bunu, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi otomatik görüntü analizi takip edebilir.

Bu prosedürü denerken, PSM eksplantları arasında PSM, notokord ve nöral tüpün eşit dağılımını sağlamak ve başlamadan önce antikor dilüsyonlarını dikkatli bir şekilde optimize etmek önemlidir. Formamid, paraformaldehit ve gluteraldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Kişisel koruma ekipmanı giymeye ve uygun olduğunda çeker ocakta çalışmaya özen gösterin.