Detaylı Mekansal İfade Haritalar Dinamik İfade Verilerinin Zamansal Sipariş

Bu deneysel prosedürün genel amacı, sabitlenmiş doku örneklemesi kullanarak omurgalı segmentasyon saatinin uzaysal-zamansal gen ekspresyon dinamiklerini haritalandırmaktır. Bu yöntem, presomitik mezodermdeki osilatuar gen dinamiklerinin tarafsız bir değerlendirmesine olanak tanır ve bu, omurgalı somatojenesini yöneten moleküler mekanizmaları anlamak için kritik öneme sahiptir. Bu tekniğin temel avantajı, birçok örneğin eş zamanlı olarak oluşturulabilmesi ve işlenebilmesiyle, sabitlenmiş dokudaki gen ekspresyon dinamiklerinin yüksek çözünürlüklü analizine imkan tanımasıdır.

Prosedürü, laboratuvarımda eski doktora sonrası araştırmacı olan Dr. Charlotte Bailey gerçekleştirecektir. Metin protokolüne uygun olarak bir fare uterus boynuzu elde ettikten sonra, bir stereo mikroskop altında, uterus boynuzunun kalın kaslı membranını kesmek ve her bir embriyoyu dikkatlice çıkarmak için kavisli makaslar kullanın. Kavisli makaslar ve ince pensetler yardımıyla, amniyotik keseyi her bir embriyodan ayırarak diseke edin.

Ardından, cerrahi bir iğne veya kavisli makas kullanarak, embriyoyu arka ekstremite tomurcuklarının önünden keserek her bir embriyodan kuyruk dokusunu hasat edin. Kuyruk dokusunu ventral tarafı aşağı gelecek şekilde dengeleyin. Daha sonra, iğne ile nazik bir sallama hareketi yaparak kuyruk dokusunu orta hat boyunca ikiye bölerek PSM eksplant çiftleri oluşturun.

Neural tüp, notokord ve PSM dokusunun iki eksplant arasında eşit şekilde bölündüğünden emin olun. Ardından, her bir kontralateral PSM eksplantını, önceden ısıtılmış kültür ortamının küçük bir hacmi içinde 35 mm'lik plastik kültür kabı kapağının alt yüzeyine pipetleyin. Kabı kapağın üzerine yerleştirin ve hızla ters çevirin; böylece PSM dokusu, ortamın asılı bir damlası şeklinde kapaktan sarkmış olacaktır.

Ardından PSM eksplantlarını nemlendirilmiş bir bölmede 37 °C'de bir ila iki saat boyunca kültüre edin. PSM eksplant çiftlerini 24 kuyucuklu bir doku kültürü plağının münferit kuyucuklarına aktarın. Daha sonra örneklere PBS içinde %4 paraformaldehit ekleyin ve plağı oda sıcaklığında bir saat veya sallama platformu üzerinde 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, oda sıcaklığında sallantılı bir platform üzerinde PBS kullanarak örnek kuyucuklarını yıkayın. İnce plastik bir Pasteur pipeti ile örneklerdeki PBS çözeltisini üç ila dört kez değiştirin. İmmünohistokimya işlemini gerçekleştirmek için, her embriyonik çiftten bir PSM eksplantına PBS içinde %2 Triton X-100 ekleyin ve örnekleri yıkamak amacıyla oda sıcaklığında, sallantılı bir platform üzerinde bir saat boyunca inkübe edin.

Numuneleri kısaca durulamak için PBS kullanın. Ardından PBS'yi bloklama çözeltisi ile değiştirin ve numuneleri sarsıntılı bir platformda, dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Çalışma tamponu kullanarak istenilen primer antikorları seyreltin.

Bu örnekte, Delta-like 1 ve Notch1 antikorları 1:25 dilüsyonunda kullanılmıştır. Antikorları eksplantlara ekleyin ve örnekleri sallantılı bir platformda, dört derece Celsius'ta üç ila beş gün boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, örnekleri PBS kullanarak beş ila on dakika sürer şekilde iki kez yıkayın.

Ardından, oda sıcaklığında sallama platformu üzerinde, PBS içinde %0,3 Triton X-100 ile üç kez yıkama işlemi gerçekleştirin. Sekonder antikorları çalışma tamponu ile seyrelttikten sonra, antikor agregatları içerebilen son birkaç mikrolitrelik solüsyonu kullanmamaya dikkat ederek, her bir örnek kuyucuğuna 250-500 µL antikor solüsyonu ekleyin. Plakayı alüminyum folyo ile kapatın ve örnekleri sekonder antikor solüsyonu içinde, karanlıkta, 4 °C'de üç ila beş gün boyunca inkübe edin.

İnkübasyon sonrası, örnekleri onar kez onar dakika boyunca PBST ile yıkayın. Ardından, dokuyu oda sıcaklığında, sallayıcı bir platform üzerinde beş dakika boyunca bir kez PBS ile yıkayın. Metin protokolünü takip ederek, geri kalan kontralateral PSM eksplantlarını bir etanol PBST dilüsyon serisi aracılığıyla dehidrate ve rehidrate edin.

Eksplantlara 0,1% PBST içinde mililitre başına on mikrogram Proteinaz K ekleyin ve dokuyu çalkalamadan beş dakika boyunca inkübe edin. Ardından Proteinaz K solüsyonunu hızla uzaklaştırın ve örnekleri kısaca durulamak için PBST kullanın. PSM eksplantlarını sabitlemek (post-fix) için bunlara PBST içinde %4 formaldehit ve %0,1 glutaraldehit ekleyin ve örnekleri 30 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, örnekleri PBST kullanarak onar dakika boyunca iki kez yıkadıktan sonra, dokuya %50 hibridizasyon karışımı ekleyin ve çalkalamadan 65 degrees Celsius'de on dakika inkübe edin. Örnekleri ve hibridizasyon karışımını metin protokolüne göre inkübe ettikten sonra, solüsyonu uzaklaştırın ve bilinen bir segmentasyon saati bileşenine karşı digoksinen etiketli antisense RNA probu içeren, önceden ısıtılmış 0.25 ile 0.5 milliliters hibridizasyon karışımı ekleyin. Plakayı kapatmak için yapışkan bant kullanın ve örnekleri iki gece boyunca 65 degrees Celsius'de inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, numuneleri 15 dakika boyunca yıkamak için TBST içinde önceden ısıtılmış %50 hibridizasyon karışımı kullanın. Daha sonra numuneleri TBST ile iki kez durulayın ve ardından dokuyu oda sıcaklığında, sallantılı bir platform üzerinde TBST içinde 30 dakika boyunca inkübe edin. Sonrasında, eksplantları en az iki saat boyunca bloklama çözeltisinde ön inkübasyona tabi tutun.

Ardından çözeltiyi, 1:200 dilüsyonda HRB konjuge anti-digoksinen antikor içeren taze bloklama çözeltisiyle değiştirin. Numuneleri dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, oda sıcaklığında numuneleri üç kez TBST ile durulayın ve yeni bir 24 kuyucuklu doku kültürü plağının ayrı kuyucuklarına aktarın.

Ardından eksplantları, her biri bir saat sürecek şekilde TBST ile üç kez yıkayın. Numuneleri görüntüleme için hazırlamadan önce, saptanan mRNA'yı görselleştirmek için bir tyramide sinyal amplifikasyon kiti kullanın. 0,12 mm kalınlığındaki bir görüntüleme ara parçasının yapışkan astarını çıkarıp bir cam lam üzerine yapıştırarak, her eksplant çifti için bir adet yüklü yapışkan cam lam hazırlayın.

Metin protokolüne göre bir çift eksplant lam üzerine yerleştirildikten sonra, doku tamamen kurumadan, yapışkan ve yarı saydam görünmeye başlayana kadar örneklerin lama yapışması için 45-60 saniye bekleyin. Bu sırada, pens kullanarak ara parçadan kalan yapışkan astarı çıkarın ve ara parçanın merkezindeki örneklerin üzerine büyük bir damla çift fonksiyonlu montaj ortamı ve berraklaştırma solüsyonu ekleyin. Montaj ortamının eşit şekilde dağıldığından ve tüm kenarların ara parçayla temas ettiğinden emin olarak örneklerin üzerine dairesel bir kapatma camı uygulayın.

Ardından, lamel slaytını düşük havlı bir kağıdın üzerine ters şekilde yerleştirin. Lamelin ara parçaya tamamen yapıştığından ve fazla montaj ortamının uzaklaştırıldığından emin olmak için sıkıca bastırın. Kağıda artık montaj ortamı bulaşmayana kadar bu işlemi tekrarlayın.

Lamı temizleyip etiketleyin ve görüntüleme işlemine kadar karanlıkta saklayın. Ardından, metin protokolüne uygun olarak görüntüleme ve analizleri gerçekleştirin. Bu deneyde, her eksplant çiftinin bir yarısında tespit edilen Notch tarafından düzenlenen segmentasyon saati geni intronic lunatic fringe'in yeni başlayan transkripsiyonuna göre embriyolar geçici olarak düzenlenerek, Delta-Like 1 ve Notch1 protein ekspresyonlarının senkronize olmayan şekilde osile olduğu gösterilmiştir.

Paneller, segmentasyon saati döngüsünün birinci, ikinci ve üçüncü fazlarına göre düzenlenmiştir. Delta-Like 1, Notch1 ve intronic lunatic fringe ekspresyon alanlarının PSM'nin anteroposterior ekseni boyunca uzanımı, renk kodlu çubuklarla belirlenmiştir. Burada gösterildiği gibi, Delta-Like 1, Notch1 ve intronic lunatic fringe sinyal yoğunluğunu PSM'nin anteroposterior eksenine göre nicelendirmek için bir grafik oluşturulmuştur; bu grafik, saat döngüsü boyunca PSM genelindeki aksiyel varyasyonu ve sinyal yoğunluğunu örneklendirmektedir.

Kimograflar; Delta-Like 1, Notch1 ve intronic lunatic fringe'in çok sayıda PSM boyunca uzamsal dağılımını görselleştirir. Kimografın her satırı, tek bir PSM eksplantının sinyal yoğunluğunu temsil eder. Delta-Like 1, Notch1 ve intronic lunatic fringe sinyal yoğunluğunun PSM'nin anteroposterior eksenine göre nicelleştirilmesi, bu hedefler için belirgin osilatuar ekspresyon dinamiklerini ortaya koymaktadır.

Son olarak, bu kimograflar, çok sayıda PSM boyunca Notch reseptörünün kesilmiş ve aktive edilmiş formu olan NICD, Delta-Like 1, intronic lunatic fringe ve Notch1'in uzaysal dağılımını göstermektedir. Bu teknik, omurgalı mitogenezi alanındaki araştırmacıların, civciv ve fare presomitik mezodermindeki segmentasyon geni osilasyon dinamiklerini daha iyi anlamalarına yardımcı olmuştur. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, çok sayıda örnek üzerinde uygulanabilir ve böylece ilgilenilen birçok mRNA ve proteinin ekspresyon profillerinin aynı anda analiz edilmesine olanak tanır.

Bu prosedürün ardından, görüntü verilerinin ek nicelleştirmesi, araştırmacı için ilgili RNA ve protein sinyallerinin hücresel alt lokalizasyonunun yanı sıra gen ifadesindeki zamansal gecikmelerin anlaşılmasını sağlayabilir. Bu videoyu izledikten sonra, kalın doku örneklemesi kullanarak omurgalı segmentasyon saatinin uzamsal-zamansal gen ifadesi dinamiklerini nasıl haritalandıracağınız konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu işlem, metin protokolünde detaylandırıldığı üzere otomatik görüntü analizi ile takip edilebilir.

Bu prosedürü uygularken, PSM eksplantları arasında PSM, notokord ve nöral tüpün eşit şekilde dağıldığından emin olmak ve başlamadan önce antikor dilüsyonlarını dikkatlice optimize etmek önemlidir. Formamid, paraformaldehit ve glutaraldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Kişisel koruyucu ekipman giymeye ve uygun olan durumlarda çeker ocak içerisinde çalışmaya özen gösterin.