Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

Aşağıdaki deneyin genel amacı, mitojenle aktive olan protein ekspresyonunu tek hücre düzeyinde nicelendirmektir. Bunu başarmak için, STL1 promotörü tarafından kontrol edilen ve hog1 MAP kinazın aktivasyonuna özgü olan floresan ekspresyon raporlayıcısı quadruple Venus taşıyan bir maya suşu oluşturulmuştur. Floresan protein ekspresyonu, hücrelerin floresansın gerçek zamanlı ortaya çıkışını kolaylaştırmak için doğrudan mikroskop altında strese maruz bırakıldığı bir canlı hücre mikroskopi analiziyle veya hücrelerin bir mikrotüpte strese maruz bırakıldığı ve protein sentezinin belirli bir zamanda engellendiği akış sitometrisi ile nicelendirilebilir.

Sikloheksimid ilavesiyle, canlı hücre mikroskobisi kullanılarak bir seferde yalnızca birkaç hücre analiz edilebilir; ancak bireysel hücrelerin kaderi doğrudan gözlemlenebilir ve diğer hücresel özelliklerle ilişkilendirilebilir. Öte yandan, akış sitometrisi, çok sayıda hücrede mitojenle aktive olan protein ekspresyonunun aynı anda değerlendirilmesine olanak tanır. Bu yöntem, hangi proteinlerin gen ekspresyonunun düzenlenmesinde yer aldığı gibi sinyal iletim alanıyla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem maya yolakları hakkında bilgi sağlayabilse de, uygun raporlayıcı ekspresyonun mevcudiyetine bağlı olarak diğer sinyal iletim kaskadlarına da uygulanabilir.

Hücreleri canlı hücre mikroskopisine hazırlamak için, beş mililitre sentetik medyumun maya ile inokülasyonunu yaparak başlayın ve ardından hücreleri 30 °C'de gece boyunca büyütün. Ertesi sabah, gece boyu büyütülen kültürün OD 600 değerini ölçün ve ardından bu kültürü beş mililitre sentetik medyumda 0,05 OD 600 değerine gelecek şekilde dilüe edin. Dilüe edilmiş kültürü 30 °C'de en az dört saat daha büyütün.

Ardından, taze hazırlanmış yaklaşık 200 µL kovalent çözeltiyi kuyu lamına filtreleyin. 30 dakika sonra, kovalent çözeltiyi uzaklaştırın ve kuyuya 150 µL su ekleyin. Şimdi suyu uzaklaştırın ve hücreler hazırlanırken kuyunun kurumasını bekleyin.

Hücre kültürünün OD 600 değerini tekrar ölçün ve ardından 1,5 mililitrelik bir mikro tüp içerisinde 0,02 OD 600 değerine sahip 300 mikrolitre hücre kültürü elde edecek şekilde hücreleri seyreltin. Hücreleri bir su banyosunda 45 saniye boyunca sonike edin. Mikro tüpleri kısa süre vorteksleyin ve ardından hücreleri tekrar sonike edip vorteksleyin.

Şimdi kuyucuk slaytına 200 µL hücre ekleyin ve hücrelerin kuyucuğun dibine çökmesi için yaklaşık 30 dakika bekledikten sonra slaytı mikroskoba yerleştirin. Ardından, kaydedilecek floresan kanalı ve iki adet parlak alan görüntüsü için aydınlatma ayarlarını seçin; hücrelerin düzgün segmentasyonu için parlak alan ayarlarından birini odak düzleminin yaklaşık 3 µm altına ayarlayın. Daha sonra, zaman atlamalı (time-lapse) ölçümler için zaman aralıklarını belirleyin ve görüntüleme yapılacak görüş alanlarını seçin.

Şimdi birkaç kare için görüntüleme işlemini başlatın ve ardından 100 µL taze hazırlanmış 0.6 M sodyum klorür ortamı eklemek için görüntülemeyi durdurun; hücreleri akış sitometrisi ile ölçüme hazırlamak için görüntülemeyi yeniden başlatın. Maya hücrelerini beş mL sentetik ortama ekleyerek başlayın ve hücreleri gece boyunca 30 °C'de büyütün. Ertesi sabah, gece boyu büyütülen kültürün OD 600 değerini ölçün ve ardından hücre süspansiyonunu beş mL sentetik ortamda 0.1 OD 600 değerine seyreltin.

OD 600 değerinin 0,2 ile 0,4 arasına ulaşması için kültürü 30 °C'de en az dört saat boyunca büyütün. Ardından, zaman sıfırında ölçülecek her bir zaman noktası için 1,5 mL'lik bir mikrotüpe taze hazırlanmış 0,6 M sodyum klorürden 100 µL ekleyin. Her mikrotüpe 200 µL hücre ekleyin ve kültürleri 30 °C'de çalkalayarak inkübe edin.

Ardından, her bir deneysel zaman noktasında, mikro tüplerden birine taze hazırlanmış 30 µL cyclo heximide ekleyin. Mikro tüpler inkübe olurken, her bir mikro tüp için karşılık gelen birer FACS tüpüne 400 µL PBS ekleyin. İnkübasyonun ardından, mikro tüpleri kısa süreliğine vorteksleyin ve ardından hücreleri, az önce gösterildiği gibi bir dakika boyunca benmari banyosunda sonike edin.

Ardından, her bir mikro tüpten 100 µL hücre kültürünü akış sitometresindeki ilgili tüplere ekleyin. Uygun eksitasyon ve deteksiyon ayarlarını yükleyin ve ekspresyon yapmayan ile tam ekspresyon yapan örneklerin detektör hassasiyet aralığında kaldığını doğrulamak için bunları test edin. Son olarak, bu görüntülerdeki her bir örnek için 10.000 hücreyi ölçün; TL1 promotör kontrolü altında kuádrupl venöz protein ekspresyon raporcusunu taşıyan ve bir kuyucuk lamın tabanına tutturulmuş maya hücreleri, stres ortamının doğrudan eklenmesiyle stimüle edilmiştir.

Az önce gösterildiği gibi, hücreler yaklaşık iki saat boyunca 10 dakikalık aralıklarla izlenmiş ve uyaranın eklenmesinden hem önce hem de sonra görüntüler alınmıştır. Aktive olan hücrelerdeki raporlayıcının floresan ekspresyonuna dikkat edin. Bu görüntülerde yer alan kantitatif bilgileri çıkarmak için, burada karmaşık bir görüntü analiz süreci gerçekleştirilmelidir.

Maya kantitatif analiz platformu ile elde edilen sonuçlar gösterilmiştir. Her bir kırmızı iz, tek bir hücrenin ortalama floresans yoğunluğunun zamansal gelişimini temsil eder. Mavi çizgi, aynı kuyucuğun beş farklı görüş alanından alınan beş zaman atlamalı videonun 20 karesi boyunca segmente edilen ve takip edilen 500'den fazla hücrenin medyanını göstermektedir; açık mavi alan ise belirli bir zaman noktasında ölçülen tüm yoğunlukların 25. ve 75. persentilini temsil eder. Aynı raporlayıcının ekspresyon dinamiklerini akış sitometrisi ile incelemek için, maya hücre kültürlerine farklı zaman noktalarında, 5 ila 10 dakikalık aralıklarla Sikloheksimid eklenmiştir.

İlaç, yeni proteinlerin sentezini engellemektedir ancak halihazırda eksprese edilmiş olan floresan proteinin olgunlaşması bozulmamaktadır. Bu nedenle, histogramın sağa kaymasıyla görselleştirilen protein ekspresyonu, floresan protein olgunlaşmasıyla ilgili sorunlar aşılacak şekilde, Sikloheksimid (Cycl H) ekleme anında miktarlaştırılabilir. Bu grafikte, mikroskopi veya akış sitometrisi ile ölçülen ekspresyon raporlayıcısının dinamikleri karşılaştırılmıştır; mikroskopi ile ölçüldüğünde floresan sinyali stres ortamının eklenmesinden 30 ila 40 dakika sonra yükselirken, akış sitometrisi ölçümleri proteinlerin stimülastan 10 ila 15 dakika sonra zaten üretildiğini açıkça göstermekte ve böylece floresan proteinlerin yavaş olgunlaştığını kanıtlamaktadır.

Her iki teknik de bu basit deneyler için tek hücreli bilgilere erişim sağlamaktadır; üç biyolojik tekrar arasındaki değişkenlik, mikroskopi veya akış sitometrisi ile gözlemlenen tek hücreli yanıtlarındaki yüksek değişkenliğe kıyasla küçüktür. Bu prosedürlerin ardından, gen ekspresyonu eşiğinin ne olduğu gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla söz konusu yanıt ölçümleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, mikroskop veya akış sitometrisi ile tek hücre düzeyinde protein ekspresyonunun nasıl ölçüleceği konusunda kapsamlı bir anlayış kazanmış olmalısınız.