Name: Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-04T23:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Öğrenin, tek hücre düzeyinde MAPK yolak aktivasyonunu mayada canlı hücre mikroskobisi ve akış sitometrisi kullanarak nicelendirmeyi. Bu yöntemler gen ifadesi dinamiklerini detaylı analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Matthias Peter ve bu yöntemler geliştirilmiştir Zürich ETH Biyokimya Enstitüsü&#39;nde yaptığı grup ederim. Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir.

1.. Mikroskopi Ölçümler <ol><li> Maya sentetik ortam 5 ml inoküle. </li><li> Gece boyunca 30 ° C&#39;de hücreler büyür. </li><li> Ertesi sabah, gece boyunca kültürün OD 600 ölçün. </li><li> 600 0.05 OD 5 ml sentetik kültür ortamı içinde bir gece boyunca seyreltin. </li><li> En az 4 saat boyunca 30 ° C&#39;de seyreltilmiş kültür büyütün. </li><li> Hazırlama 3 kat sentetik aracı madde içinde (0.6 M) NaCl solüsyonu konsantre edildi. </li><li> PBS, Concanavalin A (ConA) bir 1 mg / ml çözelti hazırlayın. </li><li> Süzüntü ~ iyi slayt içine ConA&#39;nın çözeltisi 200 ul. </li><li> 30 dakika bekletin. </li><li> ConA&#39;nın çözüm çıkarın. </li><li> De 150 ul H 2 O ekleyin. </li><li> H 2 O. kaldır </li><li> Hücre kültürü OD 600 ölçün. </li><li> 1.5 ml = 0.02 mikrotüp içinde OD 600 hücre kültürünün 300 ul hazırlayın. </li><li> 45 saniye için bir su banyosu içinde hücreleri sonikasyon. </li><li> Vortex kısaca microtube. </li><li> 45 saniye için bir su banyosu içinde hücreleri sonikasyon. </li><li> Kısaca Vortex Mikrotüp. </li><li> Oyuğuna hücre kültürünün 200 ul ekleyin. </li><li> Hücreler kuyunun dibine çöker izin 30 dakika bekleyin. </li><li> Mikroskop iyi slayt yerleştirin. </li><li> Kaydedilecek floresan kanal aydınlatma ayarlarını seçin. </li><li> (: Hücrelerinin uygun bir segmentasyon sağlamak için odak düzleminin altında 3 um biraz odak dışında biri) iki parlak bir alan görüntüler için aydınlatma ayarlarını seçin. </li><li> Time-lapse ölçümü için zaman aralıklarını seçin </li><li> Görüntü görüş alanları seçin. </li><li> Bir kaç kare alımı başlatabilirsiniz. </li><li> 0.6 M NaCl ortamında 100 ul eklemek için satın Pause. </li><li> Görüntüleme Devam. </li></ol> 2. Sitometrisi Ölçümler <ol><li> Maya sentetik ortam 5 ml inoküle. </li><li> Gece boyunca 30 ° C&#39;de büyür. </li><li> TedbirOD, gece boyunca kültürün 600 ertesi sabah. </li><li> 600 0.1 OD 5 ml sentetik bir ortam içinde bir gece boyunca kültür seyreltin. </li><li> OD 0,2-0,4 600 ulaşmak için en az 4 saat boyunca 30 ° C&#39;de büyür. </li><li> H2O içinde sikloheksimid çözelti 1 mg / ml hazırlanması </li><li> Hazırlama 3 kat sentetik aracı madde içinde (0.6 M) NaCl solüsyonu konsantre edildi. </li><li> Ölçülecek her zaman noktası için 0.6 M NaCl ortamın 100 ul bir 1.5 ml mikrotüp hazırlayın. </li><li> 0 zamanında, her bir mikrotüp hücre kültürü 200 ul ekleyin. </li><li> 30 ° C&#39;de çalkalayarak kuluçkalayın </li><li> T süresi de, bir mikrotüpe 30 ul sikloheksimid ekleyin. </li><li> Her istenilen zaman noktaları için adımı 2.11 tekrarlayın. </li><li> En az 45 dakika boyunca tüm mikrotüpler inkübe edin ve çalkalanarak 30 ° C&#39;de 3 saat kadar. </li><li> 400 ul PBS ile FACS tüpleri hazırlayın. </li><li> 1 dakika süre ile bir su banyosunda sonikasyon hücreleri. </li><li> Kısaca Vortex mikrotüpler. </li><li> Oğlum1 dakika boyunca bir su banyosu içinde hücreleri TARĐHĐ BELGE. </li><li> Kısaca Vortex mikrotüpler. </li><li> Her mikrotüpünden olarak karşılık gelen FACS tüpüne 100 ul hücre kültürü ekleyin. </li><li> Tespiti için 488 nm uyarma lazer ve 530/30 nm band geçiren filtre seçin. </li><li> Testi olmayan ifade ve tam onlar dedektör hassasiyet aralığında düşüş olmadığını doğrulamak için örnek ifade. </li><li> Alınan her bir örnek için 10,000 hücre ölçün. </li></ol>

<ol><li>Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+expression+programs+in+the+response+of+yeast+cells+to+environmental+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.</a> Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).</li>
<li>de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAPK+Hog1+recruits+Rpd3+histone+deacetylase+to+activate+osmoresponsive+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes.</a> Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).</li>
<li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li>
<li>Wu, J. -Q., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+cytokinesis+proteins+globally+and+locally+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast.</a> Science. 310 (5746), 310-314 (2005).</li>
<li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li>
<li>Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+cellular+memory+by+reducing+stochastic+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions.</a> Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).</li>
<li>Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+activation+of+the+HOG+MAPK+pathway+regulates+bimodal+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression.</a> Science. 332 (6030), 732-735 (2011).</li>
<li>de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+MEF2-like+transcription+factor+Smp1+by+the+stress-activated+Hog1+mitogen-activated+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).</li>
<li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li>
<li>Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+image+analysis+platform+to+quantify+signal+transduction+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+%3A+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).</li>
<li>Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome biology. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Cell-ID+1.4+with+R+for+microscope-based+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18(2008).</li>
<li>Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+Single+Cell+Segmentation+in+a+Variety+of+Microscopy+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images.</a> Current protocols in molecular biology. , (2012).</li>
<li>Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+fluorophore+formation+and+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).</li>
<li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).</li>
<li>Pepperkok, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fluorescence+microscopy+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput fluorescence microscopy for systems biology.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Mikroskopla inceleme ConA ile kuyunun tedavisi, hücrelerin uygun bir görüntüleme sağlamak için önemli bir adımdır. ConA PBS (5 mg / mi) içinde düşük bir çözünürlüğe sahip olduğundan, filtreleme işlemi sağlar: filtre çözelti içinde mevcut olan ve görüntüleme müdahale büyük agregaların çıkarılması. Hücreler, işlemden geçirilen yüzeye bağlı olarak güçlü bir şekilde tutunur ve uyaran çözeltisinin eklenmesinin uyaran önce ve sonra, bir sürekli izleme sağlayan, hücrelerin lokalizasyonu rahatsız edilm...

Sinyal transdüksiyon cascades ile genellikle proteinlerin ekspresyonu son bulur. Bu ifade profilinin karakterizasyonu biyolojik yollarının işlevini anlamada önemli bir unsurdur. Up-regüle proteinler ve bunların aktivasyon dinamikleri spektrumunun tanımlanması, bu tür mikro-dizileri, kuzey ya da batı lekeleri blotlar 1-3 gibi çeşitli teknikler ile elde edilebilir. Bununla birlikte, bu teknikler arasında, hücreler bütün bir nüfusun ortalama tepki. Protein ekspresyonunun ince düzenleme anlamak için, tek hücre düzeyinde ölçümleri toplamak için tercih edilir. İdeal olarak, bu ölçümler de altta yatan yolun matematiksel modeller geliştirmek için uygun nicel veri sağlamalıdır. Mikroskopi ve akış sitometri ideal gibi nicel tek hücre ölçümlerini sunmak için uygundur iki teknik vardır. Bir floresan protein ile proteinlerin endojen etiketleme be ekspresyon seviyesi 4 ölçmek için kullanılır. Proteinin terminalinde büyük bir floresan yarımının eklenmesi işlevsel olmayan işlemek için Bununla birlikte, bu bir floresan yapısının ekspresyonunu tahrik eden bir promotere göre belirli ifade muhabir oluşturmak için genellikle daha fazla tercih edilir. Bu, raportör protein hücresel sistem için dışsal ve bu nedenle hücre içinde yer alıyor sinyal olaylarını etkilememektedir. Mikroskopi ve akış sitometrisi her ikisi yaygın olarak maya sinyal alanında kullanılmıştır. Örnek olarak, Colman-Lerner ve arkadaşları korelasyon, tek hücreler içinde, maya eşleşme sinyal iletim 5 gürültüyü ölçmek için mikroskopi ile spesifik ve yapısal olarak ifade edilen muhabir çiftleşme ifade Acar ve düzenleyici ağ incelemek için akış sitometrisi el arkadaşları GAL genlerin 6 ekspresyonunu kontrol etmektedir. Önceki bir çalışmada 7&#39;de, bir combinati kullandıkozmotik basıncı yüksek gliserol maya tomurcuklanma olarak (HOG) yolunun gelen ifade çıkışını incelemek için bu iki teknikleri üzerine. Bu, mitojen tarafından aktive edilen protein kinaz (MAPK) yolu hiper-osmotik stres tarafından tetiklenir. Bu, yaklaşık 300 genlerin ekspresyonu ile sonuçlanan bir transkripsiyon programı indükleme hücrenin çekirdeğine doğru Hog1 MAPK aktivasyonu ile sonuçlanır. Bu işlemi incelemek için, bir dört Venus floresan proteini (p-STL1 QV) ekspresyonunu tahrik STL1 promoteri (Hog1 aktivitesi 8&#39;e yanıt olarak, özellikle kaynaklı bir gen) dayanan bir sentezleme raportör mühendisliği vardı. Ölçümler, flüoresan raportör ifade nüfusun sadece bir kısmı ile orta gerilim seviyesinde (0.1 M NaCl) ile iki hücre popülasyonlarının varlığını ortaya sitometrisi akış. Biz daha bu davranışı araştırmak için mikroskobu kullandılar ve protein ifadesindeki bu gürültü içsel faktörlere 9 tabi olduğunu keşfetti. Biz could ayrıca Hog1 aktivite benzer bir düzeyde olan hücreler çarpıcı farklı ifade sonuçlarını görüntülemek verebilecek görüyoruz. Bu iki tekniğin kombinasyonu bize stres yanıtı genlerinin yavaş yeniden tek hücre düzeyinde 7 de ifade sonucunu nasıl etkilediğini göstermek için izin verdi. Bu yazıda, mikroskobu ile protein ifade miktarının bir örnek olarak hiper-ozmotik şok tarafından uyarılan p STL1-QV muhabiri ifadesini kullanın ve akım sitometri. 0.2 M NaCl strese maruz aynı gerilme hem tekniklerle incelenmiştir. Bu bize bu iki derece tamamlayıcı teknikler arasındaki bazı temel farklılıkları vurgulamak için izin verecektir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>Maya Azot Bazı</td><td>ForMedium</td><td>CYN6202</td><td></td></tr><tr><td>CSM amino asit karışımı</td><td>ForMedium</td><td>DCS0011</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0450-01</td><td></td></tr><tr><td>Sikloheksimid</td><td>Fluka Aldrich Sigma</td><td>C7698</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>ySP9</td><td></td><td></td><td>W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-dörtlüV enus</td></tr><tr><td>pSP34</td><td></td><td></td><td>pRS305 pSTL1 (-800 -0) - dörtlü V enus</td></tr><tr><td colspan="4">Malzeme</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Ti-Eclipse</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop kontrol yazılımı</td><td>Mikro yönetici</td><td>Ver 1.4.11</td><td></td></tr><tr><td>Kuluçka odası</td><td>LIS</td><td>The Box</td><td></td></tr><tr><td>Floresan ışığı Kaynak</td><td>Lumencor</td><td>SpectraX</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>Flash 4.0</td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometresi</td><td>BD</td><td>FACS calibur</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator banyosu</td><td>Telesonic</td><td>TUC-150</td><td></td></tr><tr><td>8 kuyulu </td><td>kaydıraklı Thermo Lab-tek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka</td><td>Matematiksel biyobilim</td><td>MGB096-1-2-LG</td><td></td></tr><tr><td>FACS tüp</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr></tbody></table>

tek maya hücreleri mapk İsteyerek İfade zamansal kantitasyonu

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

Tek hücre düzeyinde gen ifadesinin miktar nüfus düzeyinde gerçekleştirilen ölçümler gölgede yeni düzenleme mekanizmalarını ortaya çıkarır. İki yöntem mikroskopi dayalı ve akım sitometri gibi veriler elde edilebilir nasıl göstermek için sunulmaktadır. Mayada, ozmotik basıncı yüksek gliserol MAPK yolağının aktivasyonu ile uyarılan bir flüoresan raportör ekspresyonu, bir örnek olarak kullanılmıştır. Her bir yöntemin özel avantajları vurgulanır. Sitometrisi hücrelerin geniş bir sayısı (10,000) büyüklüğüne ve floresan proteinin yavaş olgunlaştırma kinetik bağımsız protein ifade dinamikleri doğrudan bir ölçümünü sağlar akış. Mikroskobu ile canlı hücrelerin Imaging az hücrelerinde raportör olgunlaşmış formunun ölçümü ile sınırlı aksine gereğidir. Ancak, bu teknikle üretilen veri setleri birden gazetecilere kombinasyonları ve mekansal ve zamansal bilgiler son derece zengin sayesinde olabilirtek tek hücrelerden elde. Bu iki ölçüm yöntemlerinin kombinasyonu sinyal yolları ile protein ifadesinin düzenlenmesinde yeni anlayışlar sunabilirsiniz.

Mikroskopla inceleme Sentezleme raportör p STL1-QV (ySP9 7) taşıyan maya hücreleri iyi slaydın tabanına bağlanmış ve mikroskop altında yerleştirildi. Hücreler görüntüleme oturumu sırasında doğrudan kuyuya stres ortamının eklenmesi ile uyarıldı. Bu bize yol indüksiyon öncesi hücrelerin birkaç görüntü elde ve stimülasyon sonrasında kendi kaderini takip sağlar. Bu durumda, hücreler, 10 dakika bir zaman aralığı ile ~ 2 saat boyunca takip edildi. Şekil 1A ve <str...

Akış sitometrisi ve mikroskopiye dayanan iki yardımcı yöntem mayada bir MAPK yolağının aktivasyonu ile uyarılan gen ekspresyonunun dinamiklerinin tek hücre düzeyinde miktarının, ki olanak sunulmaktadır.

Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, mitojenle aktive olan protein ekspresyonunu tek hücre düzeyinde nicelendirmektir. Bunu başarmak için, STL1 promotörü tarafından kontrol edilen ve hog1 MAP kinazın aktivasyonuna özgü olan floresan ekspresyon raporlayıcısı quadruple Venus taşıyan bir maya suşu oluşturulmuştur. Floresan protein ekspresyonu, hücrelerin floresansın gerçek zamanlı ortaya çıkışını kolaylaştırmak için doğrudan mikroskop altında strese maruz bırakıldığı bir canlı hücre mikroskopi analiziyle veya hücrelerin bir mikrotüpte strese maruz bırakıldığı ve protein sentezinin belirli bir zamanda engellendiği akış sitometrisi ile nicelendirilebilir.Sikloheksimid ilavesiyle, canlı hücre mikroskobisi kullanılarak bir seferde yalnızca birkaç hücre analiz edilebilir; ancak bireysel hücrelerin kaderi doğrudan gözlemlenebilir ve diğer hücresel özelliklerle ilişkilendirilebilir. Öte yandan, akış sitometrisi, çok sayıda hücrede mitojenle aktive olan protein ekspresyonunun aynı anda değerlendirilmesine olanak tanır. Bu yöntem, hangi proteinlerin gen ekspresyonunun düzenlenmesinde yer aldığı gibi sinyal iletim alanıyla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem maya yolakları hakkında bilgi sağlayabilse de, uygun raporlayıcı ekspresyonun mevcudiyetine bağlı olarak diğer sinyal iletim kaskadlarına da uygulanabilir.Hücreleri canlı hücre mikroskopisine hazırlamak için, beş mililitre sentetik medyumun maya ile inokülasyonunu yaparak başlayın ve ardından hücreleri 30 °C'de gece boyunca büyütün. Ertesi sabah, gece boyu büyütülen kültürün OD 600 değerini ölçün ve ardından bu kültürü beş mililitre sentetik medyumda 0,05 OD 600 değerine gelecek şekilde dilüe edin. Dilüe edilmiş kültürü 30 °C'de en az dört saat daha büyütün.Ardından, taze hazırlanmış yaklaşık 200 µL kovalent çözeltiyi kuyu lamına filtreleyin. 30 dakika sonra, kovalent çözeltiyi uzaklaştırın ve kuyuya 150 µL su ekleyin. Şimdi suyu uzaklaştırın ve hücreler hazırlanırken kuyunun kurumasını bekleyin.Hücre kültürünün OD 600 değerini tekrar ölçün ve ardından 1,5 mililitrelik bir mikro tüp içerisinde 0,02 OD 600 değerine sahip 300 mikrolitre hücre kültürü elde edecek şekilde hücreleri seyreltin. Hücreleri bir su banyosunda 45 saniye boyunca sonike edin. Mikro tüpleri kısa süre vorteksleyin ve ardından hücreleri tekrar sonike edip vorteksleyin.Şimdi kuyucuk slaytına 200 µL hücre ekleyin ve hücrelerin kuyucuğun dibine çökmesi için yaklaşık 30 dakika bekledikten sonra slaytı mikroskoba yerleştirin. Ardından, kaydedilecek floresan kanalı ve iki adet parlak alan görüntüsü için aydınlatma ayarlarını seçin; hücrelerin düzgün segmentasyonu için parlak alan ayarlarından birini odak düzleminin yaklaşık 3 µm altına ayarlayın. Daha sonra, zaman atlamalı (time-lapse) ölçümler için zaman aralıklarını belirleyin ve görüntüleme yapılacak görüş alanlarını seçin.Şimdi birkaç kare için görüntüleme işlemini başlatın ve ardından 100 µL taze hazırlanmış 0.6 M sodyum klorür ortamı eklemek için görüntülemeyi durdurun; hücreleri akış sitometrisi ile ölçüme hazırlamak için görüntülemeyi yeniden başlatın. Maya hücrelerini beş mL sentetik ortama ekleyerek başlayın ve hücreleri gece boyunca 30 °C'de büyütün. Ertesi sabah, gece boyu büyütülen kültürün OD 600 değerini ölçün ve ardından hücre süspansiyonunu beş mL sentetik ortamda 0.1 OD 600 değerine seyreltin.OD 600 değerinin 0,2 ile 0,4 arasına ulaşması için kültürü 30 °C'de en az dört saat boyunca büyütün. Ardından, zaman sıfırında ölçülecek her bir zaman noktası için 1,5 mL'lik bir mikrotüpe taze hazırlanmış 0,6 M sodyum klorürden 100 µL ekleyin. Her mikrotüpe 200 µL hücre ekleyin ve kültürleri 30 °C'de çalkalayarak inkübe edin.Ardından, her bir deneysel zaman noktasında, mikro tüplerden birine taze hazırlanmış 30 µL cyclo heximide ekleyin. Mikro tüpler inkübe olurken, her bir mikro tüp için karşılık gelen birer FACS tüpüne 400 µL PBS ekleyin. İnkübasyonun ardından, mikro tüpleri kısa süreliğine vorteksleyin ve ardından hücreleri, az önce gösterildiği gibi bir dakika boyunca benmari banyosunda sonike edin.Ardından, her bir mikro tüpten 100 µL hücre kültürünü akış sitometresindeki ilgili tüplere ekleyin. Uygun eksitasyon ve deteksiyon ayarlarını yükleyin ve ekspresyon yapmayan ile tam ekspresyon yapan örneklerin detektör hassasiyet aralığında kaldığını doğrulamak için bunları test edin. Son olarak, bu görüntülerdeki her bir örnek için 10.000 hücreyi ölçün; TL1 promotör kontrolü altında kuádrupl venöz protein ekspresyon raporcusunu taşıyan ve bir kuyucuk lamın tabanına tutturulmuş maya hücreleri, stres ortamının doğrudan eklenmesiyle stimüle edilmiştir.Az önce gösterildiği gibi, hücreler yaklaşık iki saat boyunca 10 dakikalık aralıklarla izlenmiş ve uyaranın eklenmesinden hem önce hem de sonra görüntüler alınmıştır. Aktive olan hücrelerdeki raporlayıcının floresan ekspresyonuna dikkat edin. Bu görüntülerde yer alan kantitatif bilgileri çıkarmak için, burada karmaşık bir görüntü analiz süreci gerçekleştirilmelidir.Maya kantitatif analiz platformu ile elde edilen sonuçlar gösterilmiştir. Her bir kırmızı iz, tek bir hücrenin ortalama floresans yoğunluğunun zamansal gelişimini temsil eder. Mavi çizgi, aynı kuyucuğun beş farklı görüş alanından alınan beş zaman atlamalı videonun 20 karesi boyunca segmente edilen ve takip edilen 500'den fazla hücrenin medyanını göstermektedir; açık mavi alan ise belirli bir zaman noktasında ölçülen tüm yoğunlukların 25. ve 75. persentilini temsil eder. Aynı raporlayıcının ekspresyon dinamiklerini akış sitometrisi ile incelemek için, maya hücre kültürlerine farklı zaman noktalarında, 5 ila 10 dakikalık aralıklarla Sikloheksimid eklenmiştir.İlaç, yeni proteinlerin sentezini engellemektedir ancak halihazırda eksprese edilmiş olan floresan proteinin olgunlaşması bozulmamaktadır. Bu nedenle, histogramın sağa kaymasıyla görselleştirilen protein ekspresyonu, floresan protein olgunlaşmasıyla ilgili sorunlar aşılacak şekilde, Sikloheksimid (Cycl H) ekleme anında miktarlaştırılabilir. Bu grafikte, mikroskopi veya akış sitometrisi ile ölçülen ekspresyon raporlayıcısının dinamikleri karşılaştırılmıştır; mikroskopi ile ölçüldüğünde floresan sinyali stres ortamının eklenmesinden 30 ila 40 dakika sonra yükselirken, akış sitometrisi ölçümleri proteinlerin stimülastan 10 ila 15 dakika sonra zaten üretildiğini açıkça göstermekte ve böylece floresan proteinlerin yavaş olgunlaştığını kanıtlamaktadır.Her iki teknik de bu basit deneyler için tek hücreli bilgilere erişim sağlamaktadır; üç biyolojik tekrar arasındaki değişkenlik, mikroskopi veya akış sitometrisi ile gözlemlenen tek hücreli yanıtlarındaki yüksek değişkenliğe kıyasla küçüktür. Bu prosedürlerin ardından, gen ekspresyonu eşiğinin ne olduğu gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla söz konusu yanıt ölçümleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, mikroskop veya akış sitometrisi ile tek hücre düzeyinde protein ekspresyonunun nasıl ölçüleceği konusunda kapsamlı bir anlayış kazanmış olmalısınız.

temporal-quantification-mapk-induced-expression-single-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada sessiz çiftleşme lokusların HML ve HMR floresan gazetecilere uygulanan büyüyen immobilize maya hücreleri görünüm için hızlı bir...

Canlı İmmobilize Maya Hücreleri Görselleştirme Hızlı Tekniği

Maya Kronolojik yaşlanma, sabit faz zaman ile ilişkili hücre canlılığı kaybı anlamına gelmektedir. Burada maya kronolojik ömrü kantitatif olarak belirlenmesi için yüksek verimli bir yöntem açıklanmaktadır.

Yaşlı Hücre akıbet tarafından Maya Kronolojik Ömrü miktarının

FRET tabanlı gazetecilere giderek canlı hücre kinaz ve fosfataz aktiviteleri izlemek için kullanılır. Burada hedef fosforilasyon hücre döngüsü bağımlı değişiklikleri değerlendirmek için FRET tabanlı gazetecilere nasıl kullanılacağı hakkında bir metodu tanımlar.

Hücre Döngüsü FRET oranlı metrik sayesinde Kinaz ve Fosfataz Aktiviteleri İzleme

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Bu protokol, Flüoresans gerçekleştirmek için deneysel bir işlem...

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Biz floresan büyüyen maya hücreleri mikroskop film ve tek hücreli zaman serisi veri ayıklamak için bir GUI tabanlı yazılım paketi elde etmek için basit protokol mevcut. Analizi otomatik soy ve görsel denetim ve izlenen verileri manuel küratörlüğü ile entegre bölümü zaman atama içerir.

Tomurcuklanma Maya Floresan Time-lapse Filmler Kazanılması ve GREFTLERİ kullanarak Tek hücreli Dynamics analiz

Fisyon maya, Schizosaccharomyces pombe sitokinezi incelemek için mükemmel bir model sistemi, hücre bölünmesi son aşamasıdır. Burada canlı fisyon maya hücreleri farklı cytokinetic olayları analiz etmek için bir mikroskop yaklaşım açıklar.

Fisyon Maya Cytokinetic Olayların zamanmekansal Analizi

Burada, RNA-seq S. cerevisiae hücre hipoksik yanıt sırasında zamanla mRNA düzeyleri izlemek için bir iletişim kuralı'nı mevcut. Bu yöntem gen ekspresyonu herhangi bir hücresel yanıt sırasında analiz etmek için adapte edilebilir.

Maya S. cerevisiae hipoksik yanıt sırasında zamanla mRNA düzeyleri ölçme

Burada açıklanan protokolü yeni sentezlenmiş mRNA 4-thiouracil ile etiketli Maya hücrelerinden saf genom çapında miktar temel alır. Bu yöntem mRNA decay edilişi mRNA sentezi ölçmek için sağlar ve böylece, RNA polimeraz II transkripsiyon doğru bir ölçüm sağlar.

Saccharomyces cerevisiae Metabolik 4-thiouracil ve bir miktar ile etiketleme yeni mRNA RNA polimeraz II etkinlik için bir Proxy olarak sentezlenmiş

Hızlandırılmış mikroskopi, tomurcuklanan mayadaki mayozu incelemek için değerli bir araçtır. Bu protokol, mayotik kromozom ayrışması sırasında belirli bir proteinin işlevinin nasıl çalışılacağını göstermek için hücre döngüsü senkronizasyonunu, hızlandırılmış mikroskopiyi ve bir hedef proteinin koşullu tükenmesini birleştiren bir yöntemi açıklar.

S. cerevisiae'de Mayozu İncelemek için Hızlandırılmış Mikroskopi ve Proteinlerin Aşamaya Özgü Nükleer Tükenmesinin Kullanılması

Bu protokol, maya hücresi döngüsü durdurma ve isteğe bağlı salım için iki yöntemi detaylandırır ve hücre döngüsüne bağlı süreçleri incelemek için floresan mikroskobunun kullanımını detaylandırır.

Tomurcuklanan mayada hücre döngüsüne bağlı süreçlerin manipülasyonu ve analizi

Öğrenin, tek hücre düzeyinde MAPK yolak aktivasyonunu mayada canlı hücre mikroskobisi ve akış sitometrisi kullanarak nicelendirmeyi. Bu yöntemler gen ifadesi dinamiklerini detaylı analiz etmenizi sağlar.

Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

Daha fazla video keşfet