Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

Aşağıdaki deneyin genel amacı, mitojen ile aktive edilmiş protein ekspresyonunu tek hücre düzeyinde ölçmektir. Bunu başarmak için, STL bir promotör tarafından kontrol edilen ve domuz bir harita kinazının aktivasyonuna özgü floresan ekspresyon raportörü dörtlü Venüs'ü taşıyan bir maya suşu üretildi. Floresan protein ekspresyonu, floresanın gerçek zamanlı görünümünü kolaylaştırmak için hücrelerin doğrudan mikroskop üzerinde vurgulandığı bir canlı hücre mikroskobu deneyi veya akış sitometrisi ile ölçülebilir, bu durumda hücreler bir mikro tüpte vurgulanır ve protein sentezi belirli bir zamanda bloke edilir.

Siklo heid ilavesiyle, bir seferde sadece birkaç hücre canlı hücre mikroskobu ile analiz edilebilir, ancak tek tek hücrelerin kaderi doğrudan gözlemlenebilir ve diğer hücresel özellik akış sitometrisi ile ilişkilendirilebilir, ayrıca mitojen aktive olmuş protein ekspresyonunun değerlendirilmesine izin verir aynı anda çok sayıda hücrede de. Bu yöntem, gen ekspresyonunun düzenlenmesinde hangi proteinlerin yer aldığı gibi sinyalizasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem maya yolu hakkında bilgi sağlayabilse de, uygun ifadenin mevcudiyetine bağlı olarak diğer sinyalizasyon kaskadına da uygulanabilir. Muhabir.

Hücreleri canlı hücre mikroskobu için hazırlamak için, beş mililitre sentetik ortamı maya ile aşılayarak başlayın ve ardından hücreleri gece boyunca 30 santigrat derecede büyütün. Ertesi sabah, gece kültürünün OD 600'ünü ölçün ve ardından gece kültürünü beş mililitre sentetik ortamda 0.05'lik bir OD 600'e seyreltin. Seyreltilmiş kültürü en az dört saat daha 30 santigrat derecede büyütün.

Daha sonra, yaklaşık 200 mikrolitre taze hazırlanmış conna valent bir çözeltiyi kuyu slaydına süzün. 30 dakika sonra, con a çözeltisini çıkarın ve kuyuya 150 mikrolitre su ekleyin. Şimdi suyu çıkarın ve hücreler hazırlanırken kuyunun kurumasını bekleyin.

Hücre kültürünün OD 600'ünü tekrar ölçün ve daha sonra 0.02'lik bir OD 600 ve 1.5 mililitrelik bir mikro tüpte 300 mikrolitre hücre kültürü elde etmek için hücreleri seyreltin. Hücreleri 45 saniye boyunca bir su banyosunda sonikleştirin. Mikro tüpleri kısaca girdaplayın ve ardından hücreleri tekrar sonikasyon ve girdap haline getirin.

Şimdi 200 mikrolitre hücreyi kuyu lamına ekleyin ve ardından hücrenin yaklaşık 30 dakika kuyu dibine yerleşmesine izin verdikten sonra lamı mikroskobun üzerine yerleştirin. Ardından, kaydedilecek floresan kanalları ve iki parlak alan görüntüsü için aydınlatma ayarlarını seçin, uygun hücre segmentasyonuna izin vermek için parlak alan ayarlarından birini odak düzleminin yaklaşık üç mikron altına ayarlayın. Ardından zaman atlamalı ölçümler için zaman aralıklarını ayarlayın ve görüntüleme için görüş alanlarını seçin.

Şimdi birkaç kare için alıma başlayın ve ardından 100 mikrolitre taze hazırlanmış 0.6 molar sodyum klorür ortamı eklemek için alımı duraklatın ve hücreleri akış sitometrisi ile ölçüme hazırlamak için görüntülemeye devam edin. Mayayı beş mililitre sentetik ortama aşılayarak başlayın ve hücreleri gece boyunca 30 santigrat derecede büyütün. Ertesi sabah, gece boyunca kültürün OD 600'ünü ölçün ve daha sonra hücre süspansiyonunu beş mililitre sentetik ortamda 0.1'lik bir OD 600'e seyreltin.

0,2 ila 0,4 arasında bir OD 600'e ulaşmak için kültürü 30 santigrat derecede en az dört saat büyütün. Daha sonra, sıfır zamanında ölçülecek her zaman noktası için 1,5 mililitrelik bir mikro tüpe 100 mikrolitre taze hazırlanmış 0,6 molar sodyum klorür ekleyin. Her mikro tüpe 200 mikrolitre hücre ekleyin ve kültürleri 30 santigrat derecede çalkalayarak inkübe edin.

Daha sonra deneysel zaman noktalarının her birinde, mikro tüplerden birine 30 mikrolitre taze hazırlanmış siklo heide ekleyin. Mikro tüpler inkübe edilirken, her mikro tüp için karşılık gelen bir faks tüpüne 400 mikrolitre PBS ekleyin. İnkübasyondan sonra, mikro tüpleri kısaca girdaplayın ve daha sonra hücreleri sonikasyon yapın ve az önce gösterildiği gibi bir dakika boyunca su banyosu ekleyin.

Daha sonra, her bir mikro tüpten 100 mikrolitre hücre kültürünü, sitometre akışında karşılık gelen faks tüpüne ekleyin. Uygun uyarma ve algılama ayarlarını yükleyin ve eksprese etmeyen ve tam eksprese eden s'yi test edin.ampdedektör hassasiyet aralığına düştüklerini doğrulamak için. Son olarak, bu görüntülerdeki her bir örnek için 10.000 hücre ölçün, TL bir promotörün kontrolü altında ekspresyon raportörü dörtlü venöz proteini taşıyan ve bir kuyu slaytının dibine bağlanan maya hücreleri, stres ortamının doğrudan baskısı ile uyarıldı.

Az önce gösterildiği gibi, hücreler 10 dakikalık aralıklarla yaklaşık iki saat boyunca izlendi ve görüntüler, uyaranın yayınlanmasından önce ve sonra elde edildi. Raporun floresan ifadesi sırasında aktive edilmiş hücrelere dikkat edin. Bu görüntülerde yer alan nicel bilgileri çıkarmak için burada karmaşık bir görüntü analiz işlemi gerçekleştirilmelidir.

Maya miktar analiz platformu ile elde edilen sonuç gösterilmiştir. Her kırmızı iz, tek bir hücrenin ortalama floresan yoğunluğunun zamansal evrimini temsil eder. Mavi çizgi, aynı kuyudan beş farklı görüş alanından elde edilen beş hızlandırılmış filmin 20 karesi boyunca segmentlere ayrılan ve izlenen 500'den fazla hücrenin medyanını gösterir, açık mavi alan, aynı raportörün ifadesinin dinamiklerini akış sitometrisi ile incelemek için belirli bir zaman noktasında ölçülen tüm yoğunlukların 25. ve 75. yüzdelik dilimini temsil eder. Beş ila 10 dakikalık aralıklarla farklı zaman noktalarında hücre kültürleri.

İlaç, yeni proteinlerin sentezini bloke eder, ancak daha önce ifade edilen floresan proteinin olgunlaşması bozulmaz. Bu nedenle, histogramın sağa yer değiştirmesiyle görselleştirilen protein ekspresyonu, floresan protein olgunlaşması ile ilişkili sorunları atlatarak Döngü H baskısı sırasında ölçülebilir. Bu grafikte, mikroskopi veya akış sitometrisi ile ölçülen ekspresyon raportörünün dinamikleri karşılaştırılırken, floresan sinyali, mikroskopi tarafından ölçülen stres ortamının baskısından 30 ila 40 dakika sonra yükselirken, akış sitometrisi ölçümleri, proteinlerin, floresan proteinlerin yavaş olgunlaşmasını gösteren uyarandan 10 ila 15 dakika sonra zaten üretildiğini açıkça göstermektedir.

Her iki teknik de bu basit deneyler için tek hücre bilgisine erişime izin verir, üç biyolojik kopya arasındaki değişkenlik, mikroskopi veya akış sitometrisi ile tek hücre yanıtlarında gözlemlenen büyük değişkenliğe kıyasla küçüktür. Bu prosedürleri takiben, gen ekspresyonu için eşik olan gibi ek soruları yanıtlamak için bu yanıt ölçümleri gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, akış sitometrisi mikroskobu ile tek hücre düzeyinde protein ekspresyonunun nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.