Nöromüsküler kavşak işlevleri ölçme

Bu prosedürün genel amacı, ex vivo bir deneysel yaklaşım aracılığıyla nöromüsküler bileşke işlevselliğini incelemektir. Bu, kas sinir preparasyonunun iki şekildele uyarılmasıyla gerçekleştirilir: doğrudan kas membranı üzerinden ve sinir aracılığıyla. Membran stimülasyonu nörotransmisyon sinyalini devre dışı bıraktığından, iki kontraktil yanıt arasındaki herhangi bir fark, nöromüsküler bileşke işlevselliğinin dolaylı bir ölçümü olarak değerlendirilebilir.

Burada, soleus siyatik sinir preparasyonundaki prosedürü sunuyoruz. Kas, siniriyle birlikte diseke edilir ve perfüze bir doku banyosuna yerleştirilir. Bir kuvvet ve uzunluk kontrolörüne sabitlenir ve kasla paralel olarak bir çift platin elektrot yerleştirilir.

Ardından, cam bir vakum elektrodu sinirin kesik ucuna yaklaştırılır. Daha sonra, hem nöromüsküler bileşkenin hem de kas fonksiyonelliğinin kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesi için kapsamlı bir test protokolü uygulanır. Kas ve sinir arasındaki fonksiyonel bağlantı, hem parça hem de hayatta kalan iki fraksiyon için sonuçtur.

Her iki dokunun seviyesindeki ilk bölgede, normalde basınç benzeri bir morfoloji sergileyen bu nöromüsküler bileşke iletişim kurar. Bununla birlikte, çeşitli patolojik durumlarda kas ve sinir arasındaki fonksiyonel etkileşim ciddi şekilde bozulur ve nöromüsküler bileşke karmaşık morfolojik organizasyonunu kaybeder. Prosedürümüzün genel amacı, ex vivo bir deneysel yaklaşım kullanarak nöromüsküler bileşke fonksiyonelliğini incelemektir.

Bu, kas sinir preparasyonunun iki farklı şekilde stimüle edilmesiyle gerçekleştirilir. Birincisi doğrudan kas membranının stimüle edilmesiyle, ikincisi ise sinirin stimüle edilerek kas özelliklerinin analiz edilmesiyle yapılır. Sirkülasyonlu su banyosunu açın ve sıcaklığı 30 °C'ye ayarlayın.

Banyoyu Krebs-Ringer çözeltisi ile doldurun. 0,4 bar gaz karışımının oxitüpten geçerek banyoya akmasını sağlayın. Aktüatör transduserini ve iki pals stimülatörünü açın.

Akım değerlerini membran stimülasyonu için 300 milyon çift, sinir stimülasyonu için ise beş milyon çift olarak ayarlayın. Fareyi servikal dislokasyonla sakrifiye ettikten sonra bacaklardaki deriyi çıkarın. Şimdi aşil tendonunu kesin ve tendonu sıkıca klempleyerek gastroknemius kası ile soleus kasını birlikte yukarı doğru çekin.

Soleus kasının proksimal tendonu açığa çıkarıldıktan sonra, baldırın tamamını tendonun üzerinden kesin ve örneği hızlıca stereo mikroskobun altında bulunan preparatuar doku havuzuna yerleştirin. Bir penset kullanarak soleus kasının proksimal tendonunu sıkıca tutun ve siyatik innervasyonu açığa çıkarmak için hafifçe çekin. İnnervasyon açığa çıktıktan sonra, sinirin yaklaşık beş milimetrelik kısmını ortaya çıkarmak için çevredeki dokuları temizleyin.

Ardından, siniri dikkatlice kesmek için ince uçlu bir makas kullanın. Soleus kasını gastroknemius kasından ayırmak için aşil tendonunu keserek kas ve sinir eksizyonunu tamamlayın. Artık kas ve sinir preparatı, test düzeneğine monte edilmeye hazırdır.

Naylon ipin ucunda bir kayan düğüm oluşturun ve bunu aşil tendonunun etrafında sıkılaştırın. Proksimal tendonu sabit klembin içine sıkıştırın ve naylon teli kuvvet dönüştürücüsünün kaldıraç koluna bağlayın. Kasın çözelti içinde dengelenmesini sağlayın.

Başlangıçtaki optimal uzunluğu belirlemek için, sünme yük değerini nazikçe değiştirirken kası bir dizi tekli darbe ile uyarın. Optimal uzunluk, seğirme kuvveti maksimum olduğunda elde edilir. Vakum elektrotlarını kasın yakınına yerleştirin ve siniri içeri çekin.

Ardından, puls akımı değerini nazikçe değiştirirken, kası bir dizi tek puls ile stimüle edin. Sinir üzerinden stimüle edildiğinde kas tarafından üretilen seğirme kuvveti, membran üzerinden stimüle edildiğinde ölçülen değerlere eşit olmalıdır. Optimal akım değeri belirlendikten sonra, siniri elektrottan çıkarın ve birkaç akım pulsu uygulayın.

Önceden seçilen akım miktarı aşırıysa, vakum elektrodu aracılığıyla iletilen akım darbeleri, akımı banyo üzerinden ileterek kas kasılmasına yol açar. Kendi geliştirdiğimiz bir yazılım kullanarak, soleus nöromüsküler kavşak fonksiyonelliğinin incelenmesi için otomatik bir test protokolü tasarladık. Protokol yaklaşık 65 dakika sürer ve dört farklı bölümden oluşur.

İlk bölümde, kas dört tekli impulsla uyarılır. Bunların ikisi doğrudan, ikisi ise sinir aracılığıyla uygulanır. Ardından, seyirme yanıtlarından tepe süresi, yarı gevşeme süresi, kuvvet türevinin maksimum değeri ve seyirme kuvveti ölçülür.

İkinci bölümde kas, 20 hertz ile tetanik frekans olan 80 hertz arasında değişen bir dizi impuls treni ile stimüle edilir. Böylece hem sinir stimülasyonu hem de doğrudan stimülasyon için kuvvet-frekans eğrileri hesaplanır. Protokolün üçüncü ve dördüncü bölümlerinde ise, nörotransmisyon yetersizliğini ve intratetanik yorgunluğu ölçmek amacıyla kas iki farklı yorgunluk paradigmasına tabi tutulur.

Bu yorgunluk paradigmaları sırasında kas, önce membran üzerinden iletilen bir darbe treni, ardından sinir üzerinden iletilen 14 darbe treni ile sürekli olarak stimüle edilir. Tüm sekans 20 kez tekrarlanır. İlk paradigma 35 hertz'lik bir ateşleme frekansında uygulanır.

İkincisi, 80 hertz'lik tetanik frekansta gerçekleşir. Nörotransmisyon yetmezliğinin; aksiyon potansiyeli yayılımının dışsal blokajı, transmitter salınımının azalması ve bileşke plak uyarılabilirliğinin azalmasıyla ilişkili olması nedeniyle, yorgunluğun gelişiminde önemli bir rol oynadığına inanılmaktadır. Nöromüsküler bileşke yorgunluğunun bir diğer yönü ise, tek bir tetanik kasılma sırasında kasın kuvveti koruma yeteneğinin bir tahmini olan ve yüksek frekanslı yorgunluğu yansıtan intratetanik yorgunluk ile açıkça ifade edilir.

Protokolün sonunda, kas kesit alanını hesaplamak amacıyla analog bir kumpas ve hassas terazi kullanılarak net kas uzunluğu ve ağırlığı ölçülür. Amyotrofik lateral sklerozun SOD1 transgenik fare modeli üzerine yapılan çalışmalar, bu metodolojinin potansiyelini vurgulamıştır. Nitekim, transgenik soleus kasları, doğrudan stimüle edildiklerinde hem kuvvet türevi hem de tetanik kuvvet için azalmış bir kontraktil yanıt verirken, sinir aracılığıyla stimüle edildiklerinde daha da belirgin bir azalma göstermektedir.

Örneğin tetanik kuvvetle ilgili olarak, bu deneyler kas kasılabilirliğinin hasarın %25'inden sorumlu olduğunu, geri kalan %45'inin ise nörotransmisyon kusurlarıyla ilişkili olduğunu göstermiştir. Bir diğer ilginç nokta, kontrol kasları doğrudan veya dolaylı olarak stimüle edildiğinde herhangi bir fark görülmemesidir. Bu bulgu, kontrol hayvanlarında nöromüsküler kavşağın tamamen fonksiyonel olması beklendiğinden, metodolojinin herhangi bir teknik artefakta yol açmadığını kanıtlamaktadır.

İntratetanik yorgunluğa ilişkin sonuçlar, transgenik soleus kaslarında kontrol grubuyla karşılaştırıldığında anlamlı derecede daha düşük değerler göstermiştir. İlginç bir şekilde, transgenik soleus kası tekrarlayan stimülasyon ile anlamlı düzeyde hasar görmekte, bu da nöromüsküler kavşak fonksiyonelliğinin maksimum sekiz dakikalık bir stimülasyon süresi boyunca değerlendirilebileceği anlamına gelmektedir. Sekiz dakikadan sonra, transgenik kas stimüle edildiğinde kuvvet değeri neredeyse sıfıra iner.

Videoyu izledikten sonra, nöromusküler kavşak fonksiyonelliğinin ve farenin soleus kasının nasıl ölçüleceği konusunda bilgi sahibi olmuş olmalısınız. Bu tekniğin nöromusküler kavşak fonksiyonelliğinin dolaylı ölçümüne dayandığı göz önüne alındığında, rapor edilen kusurların morfolojik veya biyokimyasal değişikliklerle ilişkili olup olmadığını belirlemeye olanak tanımaz. Öte yandan bu yaklaşım, söz konusu agresyonların nörotransmisyon sinyalinin kullanıcı fonksiyonelliğini etkileyip etkilemediğini değerlendirmek için temel bir yol sunmaktadır.

Son olarak, önerilen protokol, patolojik hastalıklara sıklıkla dahil olan bir başka kas olan diyaframın nöromüsküler bileşke işlevselliğini ölçmek için kolayca uyarlanabilir.