Eş Zamanlı Optik Stimülasyon ve Video Kaydı Yoluyla Fonksiyonel Bir Nöromüsküler Kavşağın Değerlendirilmesi

Odanın sütunları üzerinde desteklenen kollajen gömülü kas dokusu içeren bir kas odasına sahip bir biyoreaktör ile başlayın.

Nörosfer kanalı, bir kollajen matrisinde bir nörosfer içerir. Nörosferin motor nöronları ışığa duyarlı kanalları ifade eder.

Nöronları projeksiyonlarını genişletmeleri için uyaran nöral büyüme faktörlerini içeren bir farklılaşma ortamı ekleyin.

Nöromüsküler kavşaklar oluşturarak kas dokusuna doğru sürekli nöron uzantısını sağlamak için ortamı düzenli olarak değiştirin.

Biyoreaktörü bir kamera ve mavi ışık kaynağı ile donatılmış bir mikroskop altında gözlemleyin.

Nöronlardaki ışığa duyarlı kanalları açmak için mavi ışık darbeleri uygulayın, ortamdaki iyonların akmasına izin verin ve nöronları elektrik sinyalleri üretmeleri için uyarın.

Bu sinyaller, nöronal çıkıntılar yoluyla nöromüsküler kavşaklara gider ve elektrik sinyalini kas dokusuna iletir.

Aynı anda bir video kaydedin. Kas lifinin kademeli olarak kasılması, fonksiyonel bir nöromüsküler kavşağın gelişimini doğrular.

Mililitre başına 3 miligram kollajen I ve çözündürülmüş bazal membran matrisi 4'e 1 karışım hazırlayın. Ardından, bu taze hazırlanmış kollajen karışımındaki miyoblastları yeniden süspanse edin.

Daha sonra, biyoreaktörün her bir kas odasına bu hücre-kollajen süspansiyonundan 15 mikrolitre ekleyin ve süspansiyonu pipet ucunu kullanarak her iki sütuna da yaydığınızdan emin olun. Hücre jeli karışımının 37 santigrat derecede 30 dakika polimerize olmasına izin verin. Ardından, her bir biyoreaktörü 450 mikrolitre miyotonik büyüme ortamı ile iyice doldurun.

Motor nöron farklılaşmasının 11. gününde, hücreleri ve ortamı 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve nörokürelerin 5 dakika boyunca dibe çökmesine izin verin. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri, mililitre beyin kaynaklı nörotrofik faktör başına 20 nanogram ve mililitre glial hücre kaynaklı nörotrofik faktör başına 10 nanogram ile desteklenmiş 15 mililitre motor nöron süspansiyon kültürü ortamında yeniden süspanse edin.

Farklılaşma protokollerinin 14. gününde, motor nöronları platforma yerleştirin. Mililitre başına 2 miligram kollajen I ve çözündürülmüş bazal membran matrisi içeren 4'e 1 jel karışımı hazırlayın. Büyük nöroküreleri seçmek için 400 nanometrelik bir hücre süzgeci kullanın ve bunları hazırlanan jel karışımında yeniden süspanse edin.

Dikkatlice, rezervuardan ve nörosferden ortamı aspire edin. Daha sonra, 15 mikrolitre jel karışımını nörosfer kanalına ekleyin. 10 mikrolitrelik bir pipeti 10 mikrolitre jel ile yükleyin ve bir nörosfer seçin. Nörosferi nörosfer kanalına yatırın ve odanın içinde olduğundan emin olun. Ardından, nörosfer biriktikten sonra kalan jeli serbest bırakırken pipeti yavaşça kaldırın.

Jelin 37 santigrat derecede 30 dakika polimerize olmasına izin verin. Daha sonra, rezervuarlara mililitre beyin kaynaklı nörotrofik faktör başına 20 nanogram ve mililitre glial hücre kaynaklı nörotrofik faktör başına 10 nanogram ile desteklenmiş 450 mikrolitre NbActiv4 ekleyin.

Görüntüleme için, bilimsel bir tamamlayıcı metal oksit yarı iletken kamera yazılımı ile ters çevrilmiş bir floresan mikroskop kullanın. Gruplamayı 2'ye 2'ye, pozlamayı 20 milisaniyeye, deklanşörü açık, okuma hızını 540 megahertz'e, dinamik aralığı 12 bit ve kazanç 1'e ve sensör modunu örtüşecek şekilde ayarlayın. Mikro dokuları görüntülemek için mikroskopta 2x objektif kullanın ve mikroskop aşamasına bir canlı hücre odası takın.

Dosya boyutunu ve işlem süresini en aza indirmek için innerve iskelet dokularını içeren ilgili bölgeyi seçin. Ardından, kameradan gelen mavi ışık darbelerini filtrelemek için numune ile görüntüleme objektifi arasına 594 nanometre uzun geçiren bir emisyon filtresi yerleştirin. Ardından, canlı hücre hücre odasına dört biyoreaktör içeren dikdörtgen dört oyuklu bir plaka yerleştirin. Ardından, Canlı Görünüm'e tıklayın ve görüntüyü istediğiniz yatırım getirisi ile ortalayın ve odaklayın.

Sahne konumunu, Arduino kartını ve video alımını kontrol etmek için GitHub klasöründen özel makro kodunu indirin. Ardından, çıkış filmini şu şekilde ayarlayın: day_tissuegroup_tissuename_experiment. ND2 olarak adlandırılır. Makro kodunu, sahne alanında ayarlanan istenen x ve y koordinatlarıyla çalıştırın ve saniyede 50 kare hızında 1.700 kare ile hızlı bir zaman atlamalı çekim elde edin.

Görüntülemeden sonra, ortamı değiştirin ve numuneleri inkübatöre geri koyun. Doku yorgunluğunu önlemek için görüntü alma seansları arasında en az 24 saat bekleyin.