Mikroakışkan Cihazlarda Fonksiyonel Nöromüsküler Kavşaklara Sahip İnsan Motor Ünitelerinin Üretimi

Bu nispeten basit yöntem, sağlık ve hastalıkta motor nöronlara ve nöromüsküler kavşaklara odaklanan araştırmalara yardımcı olabilir. Bu protokol, standart kök hücre teknolojisini ve tekrarlanabilirliği artıran ticari olarak kullanılabilen mikroakışkan cihazları kullanır. Motor nöronların ve kas hücrelerinin kopukluğu, çeşitli nöromüsküler hastalıklarda erken bir fenomendir.

Basit bir insanlaştırılmış model, bu fenomene karşı koymak için stratejiler geliştirmeye yardımcı olabilir. Bu modeli motor nöron bozukluğunu, amyotrofik lateral sklerozu araştırmak için kullanıyoruz, ancak bu model motor ünitenin gerekli olduğu diğer bozukluklar için de kullanılabilir. Forsepsleri kullanarak cihazı nakliye kabından 10 saniye boyunca sterilizasyon için% 70 ila% 100 etanol içeren Petri kabına aktararak başlayın.

Cihazı forseps ile laminar akışında yaklaşık 30 dakika boyunca havayla kuruması için bir kağıt parçasına aktarın. Bir cihaz kuruduktan sonra, her cihazı tek bir 10 santimetre Petri kabına taşımak için tokmaklar kullanın. Cihazı Poli-L-ornitin veya FKÖ ile kaplamak için, üst kuyuya 100 mikrolitre FKÖ çözeltisi ekleyin ve üstten kanala doğru iyi geçen sıvıyı iyice gözlemleyin.

Ardından, tabana 100 mikrolitre FKÖ çözeltisi ekleyin ve mikro olukların diğer tarafında tekrarlayın. Mikro olukları kaplamak için cihazın iki aynalı tarafı arasında hacim gradyanı oluşturmak için bir tarafa 100 mikrolitre FKÖ çözeltisi ekleyerek bitirin. 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte üç saat kuluçkaya yatır.

Üç saat sonra, cihazı DPBS ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın. FKÖ kaplamaya benzer prosedürü izleyerek cihazı mililitre laminin ve nörobakal ortam başına 20 mikrogram ile kaplayın. Cihazı gece boyunca 37 santigrat derece ve%5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın.

Ertesi gün 200 mikroliter pipet kullanın ve laminin kaplamayı kuyulardan çıkarmak için ucu kanal açıklığın karşısındaki kuyuya yerleştirin. Tüm kuyulara DPBS ekledikten sonra, hücre tohumlama için ODA SıCAKLıĞıNDA Laminar Akışında DPBS'li cihazları bırakın. Her iki tarafta birkaç milimetre bırakırken SCM sayfalarını cihazın boyutuna kadar kesin.

Cihazları ve SCM levhalarını 10 saniye boyunca% 70 ila% 100 etanol içeren bir Petri kabında sterilize ettikten sonra, forsepsli cihazları altı kuyulu bir tabağa ve SCM levhalarını Laminar Akışında hava kurutmak için 10 santimetrelik bir Petri kabına aktarın. Tüm tarafların yaklaşık 30 dakika kurumasını sağlamak için cihazı kenara yerleştirin. Altı kuyulu plakadaki her cihaza kuyu başına bir mililitre FKÖ çözeltisi ekleyerek cihazları kapleyin.

Cihazın, kanal ve mikro oluk tarafı sıvıya bakacak şekilde FKÖ çözümünün üstünde yüzdür olduğundan emin olun. 10 santimetrelik Petri kabına 10 mililitre FKÖ çözeltisi ekleyerek SCM levhalarını kaplayın ve SCM levhalarını sıvıya itmek için forseps kullanın. Cihazları ve SCM sayfalarını daha önce gösterildiği gibi üç saat boyunca kuluçkaya yatırın.

Üç saat sonra, cihazları ve SCM levhalarını DPBS ile beş dakika boyunca iki kez yıkayın ve ardından steril suyla beş dakika boyunca başka bir yıkayın. Daha sonra her bir SCM levhasını hava kurutacak şekilde 10 santimetrelik tek bir Petri kabına aktarın. Laminar Akışı'nda mikroskop altında çalışırken, silikon cihazı kanal ve mikro oluk tarafı ile SCM levhasına 90 derecelik bir açıyla monte etmek için tüm tarafların hizalanmasını sağlamak için önps kullanın.

Sadece dış kenarları değil, kuyuları, kanalları ve mikro olukları da kapattığından emin olmak için cihazın üzerine hafifçe bastırın. Cihazı laminin ile kaplamak için, Laminar Akışı içinde ve mikroskop altında, 200 mikrolitre pipet kullanarak üst kuyuya mililitre başına 20 mikrogram lamininin 100 mikrolitre ekleyin. Kuyu ve kanalın etrafında herhangi bir sızıntı olmadan, kanaldan tabana giden sıvıyı iyi gözlemleyin.

Daha sonra, alt kısma 100 mikrolitre laminin çözeltisi ekleyin, mikro olukların diğer tarafında tekrarlayın ve mikro olukları kaplamak için cihazın iki aynalı tarafı arasında bir hacim gradyanı oluşturmak için bir tarafta ek 100 mikrolitre laminin ile bitirin, ardından cihazı bir gecede kuluçkaya bırakın. Ertesi gün, ucu kanal açıklığın karşısındaki kuyuya konumlandırarak 200 mikrolitre pipet ile kaplamayı kuyulardan çıkarın, tüm kuyulara DPBS ekledikten sonra, HÜCRE tohumlama için Oda sıcaklığında Laminar Akışında DPBS bulunan cihazları bırakın. Mikroakışkan cihazdaki sinir progenitör hücrelerini veya NPC'leri plakalamak için, 200 mikroliter pipet kullanarak cihazdaki mikro olukların bir tarafındaki iki kuyudan DPBS'yi çıkarın.

Toplam 250. Hücre süspansiyonunun kalan yarısını alt kuyuya eklemeden önce hücre süspansiyonunun kanaldan akmasını sağlamak için birkaç saniye bekleyin. Mikroskop olmadan cihazın kolay yönlendirilmeleri için tohumlu tarafı NPC veya eşdeğeri olarak işaretlemek için bir kalem kullanın ve hücre eki için beş dakika kuluçkaya yatırın.

Daha sonra, iki NPC tohumlu kuyuyu yavaşça ek bir gün 10 motor nöron ortamı ile kuyu başına toplam 200 mikrolitre hacimde toplar. 200 mikrolitre pipet kullanarak, DPBS'yi taze tohumlu NPC'lerin karşısındaki mikro olukların diğer tarafındaki iki kuyudan çıkarın.

Daha sonra kuluçka sırasında ortamın buharlaşmasını önlemek için cihazın etrafına 10 santimetrelik tabak başına altı mililitre DPBS ekleyin. Ortamı değiştirmek için, 200 mikrolitre pipet ucunu kanal açıklığının karşısındaki kuyu duvarının alt kenarına konumlandırarak NPC'lerle her iki kuyudaki medyayı yavaşça çıkarın. Güçlü bir ortam akışının kanaldaki hücrelere zarar vermesini önlemek için, üst ve alt arasında sürekli olarak iyice değiştirerek her kuyuya 50 ila 100 mikrolitre taze motor nöron ortamı ekleyin.

Her kuyu 200 mikrolitre orta içerene kadar işlemi tekrarlayın. Motor nöron farklılaşması 17. gününde, cihazdaki mikro olukların emişsiz tarafındaki motor nöron ortamını 200 mikroliter pipetle çıkarın ve kuyuları DPBS ile yıkayın. Toplam 200.000 insan birincil mezoangioblast veya MAB tohum, üst kuyu hücre süspansiyonunun yarısını tohumlayarak cihaz başına 60 ila 100 mikrolitre büyüme ortamı.

Hücre süspansiyonunun kalan yarısını alttaki tohumlamadan önce kanaldan akmasına izin vermek için birkaç saniye bekleyin, daha önce NPC'lerin kaplaması için gösterildiği gibi, hücre eki için cihazı beş dakika kuluçkaya bırakın. Daha sonra iki yeni MAB tohumlu kuyuyu ek bir büyüme ortamı ile toplar ve gösterildiği gibi tekrar kuluçkaya yatırın.

Motor nöron farklılaşmasında 21. günde kemoterapi taktiğini ve hacimsel gradyanı başlatmak için, Myotube bölmesine büyüme faktörleri içeren motor nöron nörobasal ortamın kuyusu başına 200 mikrolitre ekleyin, ardından motor nöron bölmesine büyüme faktörü olmadan motor nöron bazal ortamın kuyusu başına 100 mikrolitre ekleyin. Hücre hatlarının farklılaşma potansiyelini mikroakışkan cihazlarda birlikte kültlemeden önce değerlendirmek önemlidir. MGB'lerin füzyon indeksi belirlendi ve yaklaşık% 8'inin ortak kültür için yeterli olduğu tahmin edildi.

Üretilen motor nöron kültürleri motor nöron belirteçleri için %85 ila %95 pozitifti. Nöromüsküler kavşakların veya NMJ'lerin miktarını karakterize etmek ve ölçmek için, motor nöron ve pre-sinaptik belirteçler nörofilament ağır zincir ve sinaptofisin ve postsinaptik asetilen reseptör marker alfa bungarotoxin arasındaki ko-lokalizasyonların sayısı, her hastalık yığını boyunca sayıldı ve Z yığınında bulunan miyosin ağırlıklı zincirli Myotubes'ta normalleştirildi. NMJ'ler, neurite'in bir etkileşim noktasında ince bir kolin reseptörü kümesine dokunduğu tek temas noktası NMJ'ler olarak ortaya çıktı.

Ya da bir neurite'in daha büyük bir yüzey üzerinde ince bir kolin reseptör kümesiyle kaplandığı ve etkileşime girdiği birden fazla temas noktası NMJ olarak. Motor nöron yenilikli Myotubes yüzdesinin ölçülmesi, tüm Myotube'ların NMJ içermediğini gösterdi. Potasyum klorür ile motor nöron aktivasyonu üzerine, Fluo-4 etiketli Myotubes'ta kalsiyum akını gözlendi, bu da Myotube'daki motor nöron neurite ile fonksiyonel bir bağlantıyı doğruladı, Myotube bölmesine NMJ bloker d-tubocurarine veya DTC eklenmesi kalsiyum akınının inhibisyonuna neden oldu.

Bu modelde en büyük başarıya sahip olmak için bir hücre hattı kalite kontrolü yapmak ve cihazın kanallarında hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek inanılmaz derecede önemlidir. Bir tabaktaki nöromüsküler kavşağı diğer IPC doğrudan hücre tipleriyle birleştirmek, in vitro durumu daha da iyi taklit eder, bu aynı zamanda bu hücre tiplerinin rolünü incelemeye izin verir.