Primer Prostat Hücre Farklılaşma için hızlı Filtre Ekle tabanlı 3D Kültür Sistemi

Hasta kaynaklı primer hücreler için geliştirilen filtre insert tabanlı bu 3D kültür sisteminin genel amacı, prostat kanseri araştırmaları için biyolojik açıdan daha ilgili bir in vitro model sistem oluşturmaktır. Primer insan hücrelerinin kullanılmasıyla bu yöntem, prostat gelişimsel biyolojisinin yanı sıra prostat kanseri ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, diferansiye primer prostat hücrelerinin oluşturulması için nispeten hızlı bir in vitro metodoloji olması ve aynı zamanda RNA, DNA ve protein gibi biyomoleküllerin hızlı izolasyonuna olanak tanımasıdır.

Hücrelerin histoloji için veya RNA ve protein toplama için filtre insert üzerinde işlenmesi hassas ve zamana duyarlı süreçler olduğundan, bu yöntemlerin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Biyolojik güvenlik kabininde odacıklar arasındaki difüzyonu sınırlamaya yardımcı olmak için, insertlerin alt tarafına 0.1% jelatinin ince bir tabakası uygulayın ve kurumaya bırakın. Bu prosedürü iki kez daha tekrarlayın.

Ardından hücreleri jelatin kaplı insertlerin iç haznesine ekleyin ve iki haftaya kadar kültüre edin. İki hafta sonra, kültüre edilen filtre insertlerini doğrudan aşağıda detaylandırılan uygun alt uygulamalardan birinde kullanın. Bu işleme başlamak için, dış haznedeki PBS'yi aspire edin ve iç haznedeki PBS'yi dikkatlice uzaklaştırın.

Kültürlenmiş insertler, uygulama hazır olana kadar kısa bir süre PBS içinde tutulabilir ancak membranın kurumasına izin vermeyin. Ardından, her bir iç hazneye 100 µL %0,25 Trypsin EDTA ekleyin. Daha sonra bunları 37 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, 200 µL'lik bir pipetle yukarı-aşağı pipetleme yaparak membran yüzeyindeki hücreleri kısa bir süre ve dikkatlice sıyırın. Daha sonra hücreleri 37 °C'de bir dakika boyunca inkübe edin. Bir dakika sonra, ilk iç hazneye 250 µL kondisyonlu ortam ekleyin ve filtreyi durulamak için nazikçe yukarı-aşağı pipetleme yapın.

Bu transferin ardından, resüspande edilen hücreleri aynı medya koşullarını içeren bitişik filtre haznesine aktarın ve pipetleme işlemini tekrar edin. Bu prosedürü, tek bir koşulun her bir inserti için tekrarlayın. Ardından hücreleri toplayın ve 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Kalan hücreleri toplamak için her bir iç bölmeyi ek olarak 100 ila 200 µL kondisyonlu ortam ile durulayın ve bunları 1,5 mL'lik santrifüj tüpüne ekleyin. Ardından, hücreleri bir mikrosantrifüjde dört °C'de beş dakika boyunca döndürün. Sonrasında süpernatantı aspire edin ve hücre peletini bir kez 1.000 µL PBS ile yıkayın.

Hücreleri bir mikrosantrifüjde dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca tekrar döndürün. Beş dakika sonra PBS'yi aspire edin ve örneği daha sonra kullanmak üzere eksi 80 derece Celsius'ta dondurun. Bu prosedürde, iç bölmeye 200 mikrolitre guanidinyum tiyosiyanat fenol kloroform veya benzeri bir ekstraksiyon reaktifi ekleyin ve membran yüzeyindeki hücreleri pipetle aşağı yukarı hareket ettirerek kısaca karıştırın.

Ardından hücreleri ekstraksiyon reajentinde oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin ve dış bölmeyi kuru bırakın. Sonrasında, ekstraksiyon solüsyonunu pipetle yukarı ve aşağı çekerek filtre membranını yıkayın. Altı kuyucuklu plakayı eğerek ve kalan tüm sıvıyı aspire ederek mümkün olduğunca fazla ekstraksiyon reajentini toplayın.

Filtrenin ekten ayrılabiliceğini lütfen unutmayın. Eğer ekliyse, ayrılan filtre membranını yıkayın. Ardından, mümkün olduğunca fazla ekstraksiyon reaktifi toplayın ve DNA, RNA veya proteinin saflaştırılması ve geri kazanımı için üreticinin protokolünü izleyin.

Guanidinyum tiyosiyanat ile hücreleri ve filtreyi yıkarken dikkatli olunmalıdır; çünkü aşırı çalkalama düşük kaliteli RNA elde edilmesine neden olabilir. Filtre insertinden protein izole etmek için, filtre insertini buz üzerinde altı kuyucuklu plakaya yerleştirin. Ardından, iç bölmeye 10 µL protein liziz tamponu ekleyin.

20 µL'lik bir pipetle yukarı aşağı pipetleme yaparken membran yüzeyindeki hücreleri karıştırıp kazıyın ve lizis tamponunda kabarcık oluşmamasına dikkat edin. Ardından, filtre insertleri içeren altı kuyucuklu plakayı on dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Kazıma işlemini tekrarlayın ve ardından membran yüzeyini lizis tamponu ile durulayın.

Altı insertten elde edilen lizatları toplayın ve buz üzerinde 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, ilk membranı ek 10 mikrolitre lizis tamponu ile durulayın ve bir sonraki filtreye aktarın. Bu işlemi belirli bir deney koşulundaki tüm insertler için tekrarlayarak kalan tüm lizis tamponu çözeltisini toplayın ve 1,5 mililitrelik tüpe ekleyin.

Numuneyi buz üzerinde beş dakika daha inkübe edin. Ardından, dört °C'de 15 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin. İşlem tamamlandığında, lizatı taze bir 1,5 mm tüpe pipetleyin.

Ardından protein konsantrasyonu analizine geçiniz veya lizatları -80 °C'de saklayınız. Bu işlemde, iç ve dış hazneye sırasıyla 500 µL ve 1 mL %10 NBF ekleyiniz. Bunları 4 °C'de gece boyunca inkübe ediniz.

Ertesi gün dış bölmedeki NBF'yi aspire edin ve 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne bir mililitre HEA işlem jeli ekleyin. Agaroz eriyene kadar, düşük güçte ve tekrarlanan 10 saniyelik darbelerle mikrodalga fırında yavaşça eritin. Kullanıma hazır olana kadar katılaşmayı önlemek için HEA'yı 37 degrees Celsius sıcaklıktaki bir su banyosunda tutun.

Ardından, NBF'yi iç hazneden çıkarın. İç hazneye 25 µL erimiş HEA uygulayın ve agarozun katılaşması için iki ila beş dakika bekleyin. Daha sonra, iki adet köpük histoloji pedini %10 NBF ile ıslatın ve pedlerden birini bir gömme kasetine yerleştirin.

HistoGel kullanarak filtre ekindeki hücre tabakalarının bütünlüğünü korumak, histolojik kesit alma işlemi için sağlam hücre tabakasının muhafaza edilmesi açısından kritik bir adımdır. Ardından, plastik ek odasının alt tarafındaki filtreyi 11 numara bistüri ucuyla çizerek kısmen serbest bırakın. Bir petri kabına 100-200 µL NBF koyun ve kısmen yerinden çıkmış olan filtreyi NBF'ye daldırın.

10 numaralı bistüri ucuyla, filtreyi ekleme gövdesinden tamamen ayırmak için insert haznesinin içinden filtrenin ortasına nazikçe bastırın. Filtrenin gövdeye hala bağlı olan herhangi bir kısmı varsa, bunu bistüri ile kesin. Ardından, HEA kaplı filtreyi ortadan ikiye bölün.

Filtrenin her bir yarısını, hazırlanmış histoloji kasetindeki köpük pedin üzerine yerleştirin. Ardından, filtreyi sıkıştıracak şekilde %10'luk NBF'ye batırılmış ikinci süngeri kasete ekleyin. Son olarak kaseti kapatarak mühürleyin.

NBF içine yerleştirin ve gece boyunca inkübe edin. Bu aydınlık alan görüntüsü, gözenekli membranın üzerinde çok tabakalı hücre katmanlarını göstermektedir. Çekirdekler, P63 ve androjen reseptörü için bireysel floresan görüntüler ile her üç floresan işaretleyicinin birleştirilmiş görüntüsü gösterilmiştir.

Son olarak, floresan sinyalinin hücrelere ve filtreye göre lokalizasyonunu belirleyen, bileşik bir parlak alan ve immünofloresan üst üste bindirme görüntüsü gösterilmiştir. Burada, filtre insertimizin bir kesit görüntüsü, sağlam bir prostatın duktal epitel tabakaları ile karşılaştırmalı olarak sunulmuştur. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem iki hafta içinde tamamlanabilir ve uygun şekilde yürütüldüğünde hücrelerin ve filtre insertinin veya istenen biyomolekülün nihai izolasyonu 30 dakikadan kısa sürer.

Bu prosedürü gerçekleştirirken, hücre tabakasına veya altındaki filtreye zarar gelmemesi için filtre insertleriyle çalışırken her zaman dikkatli olunması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, yolak analizi ve kanser hücreleriyle ilgili ek soruları yanıtlamak amacıyla Western blot, RNA mikroarray ve proteom analizleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, prostat kanseri alanındaki araştırmacıların, primer prostat hücrelerini kullanarak prostat biyolojisini ve prostat kanserinin temel mekanizmalarını daha iyi keşsetmelerine yardımcı olacaktır.

Bu videoyu izledikten sonra, bu 3D kültür sisteminden kültürlenmiş primer prostat hücrelerinin nasıl uygun şekilde kurulacağını ve geri kazanılacağını mükemmel bir şekilde kavramış olmalısınız.