Name: Primer Prostat Hücre Farklılaşma için hızlı Filtre Ekle tabanlı 3D Kültür Sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Öğrenin, filtre ekleme tabanlı 3D kültür sistemi ile primer prostat hücrelerini hızla farklılaştırma ve RNA, DNA, protein izolasyonu yöntemlerini. Bu teknik, prostat kanseri araştırmaları için biyolojik olarak daha uygun in vitro modeller oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma T32 (CA 9686-18) ve 1 TL (TL1TR001431) doktora sonrası eğitim bursu ödülleri (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA) yanı sıra tarafından desteklenmiştir U01 PAR-12-095 (Kumar) ve P30 CA051008-21 (Weiner). Örnek sabitleme, kesit ve boyama Lombardi Kapsamlı Kanser Merkezi Histoloji ve Doku Paylaşılan Kaynak gerçekleştirildi. Biz yararlı tartışmalar için Richard Schlegel teşekkür ederiz. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Kanser Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

3D Hücre 1. Kuruluş Kültür takın Sistemi <ol><li> Aşağı 6 kuyu plaka (Şekil 1A) bir ters yönde (yukarı filtre tarafı) 2 polikarbonat hücre kültürü ekler yerleştirin. </li><li> parçanın alt tarafına su içinde% 0.1 jelatin, ince bir tabaka halinde yayılır ve sterilliği korumak için, biyolojik bir güvenlik kabini (10-20 dakika) kurutun. </li><li> Adımı tekrar 1.2 insert% 0.1 jelatin 3 uygulama toplam iki kere daha. NOT: Jelatin kaplama odacıkları arasındaki sınır difüzyon yardımcı olacaktır. </li><li> kültür şişesi yıkamak için 5 ml PBS ekleyin standart kültür koşullarında birincil Literatürde KRK toplamak için. <ol><li> 37 ° C&#39;de 5 dakika süreyle% 0.25 tripsin-EDTA (T-75 T-25 ve 2 mL için 1 mL) kullanılarak hücreler tripsinize. Yavaşça hücreleri yerinden çıkarılmasına yardımcı olmak için balonun yan dokunun. Sonra tripsin reaksiyonu durdurmak ve tam DMEM 5 ml ekleyerek hücreleri toplamak için devam edin. </li><li> Toplamak<html> 15 ml bir tüp içinde hücreleri. 4 ° C ve 188 x g&#39;de tüpü santrifüjünde ve otomatik bir hücre sayacı ya hemasitometre kullanarak sayın. </li><li> Medya (CM) klimalı 250 uL 600.000 Literatürde KRK yeniden askıya ve düzgün odaklı (filtre tarafı aşağı) kültür insert (Şekil 1B) ekleyin. Bu iç hazne olarak adlandırılır. Not: CM ışınlanmış J2 hücreleri şartlandırılmış F ortamı ve daha önce 7, 8, 9, 11 tarif edilen şekilde 10 um Y-27632 içerir. </li></ol></li><li> 6 plaka dış haznesine CM 2 mL uygulayın ve (en azından 18 saat için) gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Dikkatlice 1 ml veya 200 uL pipet ile iç odasının CM kaldırmak ve yavaş yavaş tam kadar 1 ml pipet ile iç odaya farklılaşma medya (DM) ekleyin. Hücre tabakası rahatsız için dikkatli olun. </li></ol>3D Kültürlerin le &quot;&gt; 2. Bakım <ol><li> Her gün kültürleri kontrol edin. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, sağlıklı hücreler görünür. </li><li> Dış odasında CM her gün ya da hücrelerin metabolizması bağlı olarak her geçen gün değiştirin. </li><li> (Sarı), iç bölme değişiklikleri renk medya, dikkatli bir 1 ml veya 200 uL pipet ile iç filtre odasının medya kaldırdığınızda. </li><li> Bir aspirasyon ucu ile dış 6 kuyu plaka odasında medya aspire. </li><li> 1 ml pipet kullanarak, yavaşça tam kadar iç odaya taze DM uygulayın. kazımak veya başka hücre tabakası çıkarmak için dikkatli olun. </li><li> Taze CM 2 mL dış odasının ortamı değiştirin. </li><li> 2 hafta kültürleri korumak ve daha sonra istenen bimolecular izolasyonu için işleme devam edin. NOT: 6 plaka her satır, altı ekler (Şekil 1B) toplam, DN için yeterli hücre elde etmek için deney başına işleme tabi tutulmalıdırAnaliz için bir RNA ya da protein. </li><li> dış odanın aspire ortam ve 2 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) ile durulayın. </li><li> Dikkatlice 1 ml veya 200 uL pipet ile iç odasından ortamı çıkarın ve 500 uL PBS ekleyin. kazıma veya başka membran üzerinde hücrelerin rahatsız etmemek. </li><li> Aspire dış odasından PBS ve dikkatli bir 1 ml veya 200 uL pipet ile iç odasından PBS kaldırmak. PBS çıkarıldı sonra, aşağıda ayrıntılı olarak uygun bir uygulama direkt olarak devam edin. Membran kurumasına izin vermeyin. Uygulama başlamaya hazır olana kadar kültür PBS kısaca tutulabilir. </li></ol> 3. Pelet Bankacılık için filtreler İşleme <ol><li> her bir iç bölmeye 100 uL% 0.25 tripsin-EDTA ve 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edilir. </li><li> aşağı yukarı pipetleme ve süre Kısaca ve özenle / ajitasyon 200 uL pipet ile membran yüzeyinde hücreleri kazıyın (Punc önlemek) Membran açmadan. 37 ° C&#39;de 1 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Filtreyi durulama yavaşça ilk iç odaya CM 250 uL ekleyin ve yukarı pipet ve. </li><li> Transferi Aynı medya koşullarını içerir ve aşağı yukarı pipetleme tekrarlayın ve komşu filtre odasına hücreleri yeniden süspanse. </li><li> Tek bir durumun ekler her biri için bu işlemi tekrarlayın. Toplamak ve 1.5 ml santrifüj tüpüne hücreleri transferi. </li><li> kalan hücreleri toplamak için CM ek 100-200 uL her bir iç bölmeyi durulayın. Aşama 3.5, 1.5 ml santrifüj tüpüne ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de bir mikrosantrifüj içinde 423 xg&#39;de hücreleri dönerler. </li><li> Süpernatantı aspire ve 1000 uL PBS ile bir kez hücre pelet yıkayın. </li><li> 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de bir mikrosantrifüj içinde 423 x g hızında tekrar Spin. </li><li> PBS aspire ve daha sonra kullanılmak üzere -80 ° C&#39;de dondurularak. </li></ol> 4. RNA veya DNA İzolasyon için filtreler İşleme <ol&gt; <li> İç bölmeye guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform veya benzer ekstraksiyon reaktifi, 200 uL ilave edilmekte ve kısaca bir şekilde pipetli yukan aşağı çekilerek membran yüzeyinde hücreleri çalkalayın. </li><li> Dış oda kuru ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ekstre edici reaktif olarak inkübe edin. <ol><li> filtre elemanından ayırmak gibi, yukarı ve aşağı çekme çözüm pipetleme kopuk filtre membran yıkayın. 6 plaka devirme ve herhangi bir kalıntı sıvıyı aspire mümkün olduğunca çıkarma reaktif kadar toplayın. </li></ol></li><li> saflaştırılması ve DNA, RNA ya da protein geri kazanımı için imalatçının protokolü takip edin. </li></ol> 5. Protein İzolasyonu için filtreler İşleme <ol><li> Buz üzerinde 6 plaka filtre koyunuz. İç bölmeye, 10 ul 1 mM sodyum florit (NAF), 1 mM sodyum vanadat (NAV), 100 mM dithiothre ile takviye edilmiş bir protein liziz tamponu ilaveinositol (DTT) ve anti-proteaz kokteyli 100 uL. </li><li> / Çalkalamak yukarı ve aşağı pipetleme ise 20 uL pipet ile membran yüzeyinde hücreleri kazıyın. lizis tamponunda kabarcıkları üreten kaçının. </li><li> 10 dakika boyunca buz üzerinde filtre eklenmiş 6 yuvalı plaka inkübe edin. </li><li> kazıma Tekrar sonra lizis tamponu ile membran yüzeyin durulanması. </li><li> 6 uçlar arasında lisatlan toplayın ve buz üzerinde 1.5 ml santrifüj tüpüne aktarılır. </li><li> Bir sonraki filtreye liziz tamponu ve transfer ek olarak 10 uL ilk membran durulayın. </li><li> Tüm ekler için yineleyin 5.6, herhangi bir kalıntı lizis tampon çözeltisi toplama ve 1.5 mL tüp (adım 5.5) ekleyin. </li><li> ilave bir 5 dakika boyunca buz üzerinde örnek inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika maksimum hızda (bir masa üstü santrifüjü içinde 16.873 xg) dönerler. </li><li> Taze 1.5 ml tüp içine Pipet lizat süpernatant. </li><li> protein konsantrasyonu ya da taştan analizine devam edin-80 ° C&#39;de lizatları Re. </li></ol> H &amp; E ve Immuno-boyama 6. İşleme <ol><li> İç ve dış bölmeye 500 uL% 10 1 ml NBF (nötr tamponlu formalin) ilave edin ve 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edin. </li><li> Dış odasından NBF aspire ve 1 mL hidroksietil agaroz (HEA), 1.5 mL santrifüj işleme jeli ilave edin. Yavaş yavaş düşük güç kullanan bir mikrodalga agaroz eritebilir ve erimiş agaroz kadar 10-20 s darbeleri tekrarladı. </li><li> Kullanıma hazır olana kadar katılaşmasını önlemek için, 37 ° C sıcak bir banyoda HEA tutun. </li><li> iç odanın NBF çıkarın ve iç bölme erimiş HEA 25 uL uygulanır ve agaroz 2-5 dakika boyunca katılaşmaya sağlar. </li><li> % 10 NBF Islak 2 köpük histoloji yastıkları ve (Şekil 3D bakınız) gömme kaset bir ped yerleştirin. </li><li> parçanın alt tarafında filtreyi skor (çok keskin, ince uçlu bir bıçak olan) bir 11. bıçak neşter kullanabilirsinizodası kısmen plastik uç haznesinden bırakmadan. </li><li> Bir Petri kabındaki NBF küçük bir miktar (100-200 ul) yerleştirin ve NBF (Şekil 3A) kısmen yerinden filtreyi batırmayın. </li><li> Bir # 10 bıçak neşter ile hafifçe tam uç haznenin (Şekil 3B) filtre çıkarmak için, uç bölmenin içinden, filtre ortasında karşı baskı. hala hazne takılı filtrenin bir kısmı olması durumunda, neşter ile sever. </li><li> 10. bıçak neşter (Şekil 3C) ile ikiye HEA kaplı filtre kesin. </li><li> Aşama 6.4 (Şekil 3D) &#39;de hazırlanan histolojik kaset köpük ped üzerine, filtrenin her yarım yerleştirin. </li><li> Filtreyi sandviç, kaset ikinci% 10 NBF batırılmış sünger ekleyin. </li><li> Yapış NBF kaseti, yer mühür ve gece inkübe edin. </li><li> kesit ve boyama olarak parafin bloklar halinde süreç filtreleriDaha önce 12 tarif. </li></ol>

<ol><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).</li>
<li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+reprogrammed+cells+to+identify+therapy+for+respiratory+papillomatosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis.</a> N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).</li>
<li>Signoretti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63+is+a+prostate+basal+cell+marker+and+is+required+for+prostate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development.</a> Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).</li>
<li>Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prostate cancer stem cells.</a> J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).</li>
<li>Ringer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+the+p53+tumor+suppressor+protein+bridges+the+apoptotic+and+autophagic+signaling+pathways+to+regulate+cell+death+in+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).</li>
<li>Pollock, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strigolactone+analogues+induce+apoptosis+through+activation+of+p38+and+the+stress+response+pathway+in+cancer+cell+lines+and+in+conditionally+reprogrammed+primary+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).</li>
<li>Crogliom, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26910887">Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair.</a> Oncotarget. , (2016).</li>
<li>Saeed, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Drug+Testing+of+Patient-derived+Conditionally+Reprogrammed+Cells+from+Castration-resistant+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer.</a> Eur Urol. , (2016).</li>
<li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+induces+diffusible+feeder+cell+factor%28s%29+that+cooperate+with+ROCK+inhibitor+to+conditionally+reprogram+and+immortalize+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells.</a> Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).</li>
<li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> J Vis Exp. (99), e52868(2015).</li>
<li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Primer hücre hatları kanser araştırmaları için önemli ve hızla gelişen bir platform vardır. kültür insert tabanlı 3D kültür sistemi bir iki haftalık süre içinde birincil prostat CRClerin farklılaşmasını desteklemektedir. CRC filtre yöntemi prostat araştırma için yeni bir orta hacimli yöntemi temsil eder. Mevcut fare PDX modelleri zaman alıcı ve son derece pahalıdır ve PDX örneklerin birçok araştırmacı tarafından başlatılan deney ve kullanımını sınırlayan, kültür içinde yetiştirilen edilemez. PDX kurma başarı oranları bü...

bireylere kişiselleştirilmiş kimlik ve kanser tedavilerinin kullanımı kanser araştırmalarında bir birincil hedefi vardır. Son zamanlarda, yeni yaklaşımlar potansiyel olarak her iki belirleme ve kişiye özel tedavilerin test yolları sağlayan primer hücre kültürlerinde kurulmasında daha kolay izin geliştirilmiştir. Örneğin, R-spondin bazlı prostat organoid yaklaşım 1 bir ticari hücre dışı matris içinde normal ve metastatik prostat kanseri hücrelerinin üç boyutlu (3D) kültür (ör Matrigel) için Hücrelerin Şartlı yeniden programlanması (CRC) yöntemi ise Georgetown 2 geliştirilen, 3 daha fazla standart 2D kültür koşulları kullanır. Spesifik olarak, Rho kinaz inhibitörü (Y-27632) ve ışınlanmış J2 fare fibroblast besleyici hücreler kombinasyonu keratinosit CRC 2 belirsiz kültür yol açar. CRC metodolojiSon derece sağlam, birincil hücre hatları başarıyla kuruldu ve prostat ve diğer birçok normal ve malign epitelyal dokuların 3 süresiz muhafaza ile. Önemlisi, bizim CRC teknolojisi önceki ilaç tedavileri bir dizi başarısız olan bir hastada tekrarlayan solunum papillomatozis için etyolojik temeli hızla tanımlanması için izin verdi. Buna ek olarak, normal ve tümör kaynaklı Literatürde KRK kullanılarak bir FDA başarılı kimlik ilk doku biyopsisi iki hafta içinde yapıldı, vorinostat ilaç onaylanmıştır. Hastalar, hastalıkları 4 başarılı bir şekilde tedavi ile sonuçlanan vorinostat yerleştirildi. Normal prostat bezi luminal, bazal ve nadir nöroendokrin hücrelerden 5 oluşmaktadır. Luminal hücrelerin bezinin kolon epitel tabakasının oluşturulması ve androjen reseptörü (AR), hem de bu sitokeratin 8 ve 18 ve ön ve diğer lümen belirteçlerdevlet-spesifik antijen (PSA) 6. Tersine, bazal hücre lümen tabakasının altında lokalize ve sitokeratinin 5 ve p63, ama AR 5 düşük seviyelerde ifade edilir. Biz 7, 8, 9 ve diğerleri 10 başarılı bir şekilde klinik öncesi mekanik ilaç duyarlılığı araştırmalarda prostat Literatürde KRK kullandık. Standart 2D doku kültürü koşullarında yetiştirilen Ancak, bu hücrelerin tam 10 sinyalizasyon AR kavrayana başarısız. bağışıklık yetersizliği olan farelerde böbrek kapsülü altına En önemlisi, CRC permisif ortamına yerleştirildiklerinde prostat CRC kendi soy kararlılığını muhafaza belirten normal prostat glandüler mimarinin ve fonksiyonu geri kazanılmaz. Burada açıklanan Filtre elemanı dayalı hücre kültür sisteminin gelişimi hızlı (2 hafta) kanıtlandığı b prostat CRC in vitro farklılaşmasını sağlarY, artan Ar ve Ar, hedef genlerin ekspresyonu da azaldıkça p63 seviyeleri. Kullanılan filtre ekler memeli hücrelerinin kültürlenmesini destekleyebilir polikarbonat zarları (gözenek boyutu, 0.4 mikron) ihtiva ederler. Sistem, geliştirilmiş olarak normal ve habis prostat CRC, 6 oyuklu kültür tabaklarında ve filtre insertlerin kullanımını sağlar. J2 hücreleri 11 ile belirlenen hücre kültür ortamı, üst bölme alt bölmesi ve prostat ayırt ortam yerleştirilir. teknikler, burada kişiselleştirilmiş tıp hedefleriyle uyumlu bir 2 hafta süre içinde prostat lümen hücre farklılaşmasını destekleyen tarif. Kültürlerin kapsamlı, moleküler genetik ve hücresel profil izin metodolojiler geliştirilmesi de zorunluluk oldu. Filtre yüzeyinden salınan hücrelerden DNA, RNA ve protein izole edilmesine yönelik yaklaşımlar geliştirilmiş ve doğru tekrar numune işleme için aerodinamik edilmiştir. FinaLly, metodoloji H &amp; E, immünohistokimyasal ve immunofluorescent boyama, gömme etkinleştirmek için filtreyi kaldırma kesit için ve gerekli, tam bir şekilde anlatılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Corning Costar Snapwell Kültür Uçları</td><td>Corning</td><td>3801</td><td></td></tr><tr><td>Milicell Hücre Kültürü Uçları</td><td>Milipore</td><td>PIHP01250</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 6 Kuyulu</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Suda Jelatin %0.1</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>7903</td><td></td></tr><tr><td>Steril Saftey Scapel 10 Bıçaklı</td><td>Integra Miltex</td><td>4-510</td><td></td></tr><tr><td>Steril Standart Neşter 11 Bıçaklı</td><td>Integra Miltex</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lizis ve Ekstraksiyon Tamponu</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Florür</td><td>Fishcer Scientific</td><td>S299-100</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Vanadat</td><td>Fishcer Scientific</td><td>13721-39-6</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3483123</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitör Kokteyli (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin ve Pepstatin A)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr>% <tr><td>0.25 Tripsin-EDTA (1x)</td> <td>Thermofisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25030081 & nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>F-12 Besin Karışımı Ortamı</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihidroklorür Kaya inhibitörü</td><td>Enzo</td><td>ALX-270-333-M025</td><td></td></tr><tr><td>Hidrokortizon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Thermofisher Bilimsel</td><td>PHG0315</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Kolera Toksini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3012</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264550</td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Histogel Numune İşleme Jeli ( hidroksietil agaroz (HEA))</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Yapışmayan Pansuman</td><td>Telfa</td><td>KDL2132Z</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Kabı</td><td>Sigma</td><td>SIAL0167</td><td></td></tr><tr><td>HISTOSETTE II Doku İşleme / Gömme Kasetleri</td><td>Crystalgen</td><td>CG-M492</td><td></td></tr></tbody></table>

primer prostat hücre farklılaşma için hızlı filtre ekle tabanlı 3d kültür sistemi

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Şartlı yeniden programlanması hücreleri (CRC), birincil hücre kültürü ve hasta türevi hücre hatlarının geniş bir &quot;canlı biyobankalar&quot; geliştirilmesi yeteneğine için kalıcı bir yöntem sağlar. Epitel hücrelerinin pek çok türleri için, farklı üç boyutlu (3D) bir kültür yaklaşımları, geliştirilmiş bir farklılaşmış hallerinin destekleyen tarif edilmiştir. CRC de izole edildiği doku olarak soy kararlılığını muhafaza ederken, normal, iki boyutlu (2D) kültür koşulları altında yetiştirildiğinde kaynaklı doku ile ilişkili farklılaşma markörünü ifade etmiş başarısız olur. prostat kanseri araştırması için, hasta türevi CRC uygulama geliştirmek için, 3D kültür formatı, normal ve tümör türetilmiş prostat epitelial hücreleri hem de hızlı bir şekilde (2 gün toplam) lümen hücre farklılaşması sağlayan tanımlanmıştır. Burada, bir filtre elemanı tabanlı formatı, normal ve habis prostat CRC hem kültür ve farklılaşması için tarif edilmiştir. bir deimmünohistokimyasal ve immunofluorescent boyama hücre toplama ve işleme için gerekli prosedürlerin kuyruklu açıklaması verilmektedir. Topluca ilköğretim CRC hatları ile kombine tarif 3D kültür biçimi, biospecimen tabanlı prostat araştırma için verim model sistemi belirginleştirebilirsiniz önemli bir orta sağlar.

Hücre kültürü uç tabanlı sistem lümen hücre farklılaşmasını destekleyen prostat CRC 3D kültürleri üretmek için göreceli olarak basit ve hızlı bir yöntemdir. Sistemin şematik bir filtre elemanının alt yüzeyine jelatin kaplama uygulamasını öne (Şekil 1A) gösterilmektedir. dolgular yalnızca jelatin uygulanması için devrilmiştir. Şekil 1B filtreler kültürlenmesi için uygun doğrultuda bulunmaktadır. Şeffaf bir hücre ekleme kullanarak, sağlıklı bir 3D prostat ...

Burada, primer prostat epitel hücrelerinin üç boyutlu kültürlenmesini ve ardından luminal farklılaşmasını destekleyen hızlı bir in vitro sistemin kurulması için bir yöntem sunuyoruz.

Primer Prostat Hücre Farklılaşma için hızlı Filtre Ekle tabanlı 3D Kültür Sistemi

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

Hasta kaynaklı primer hücreler için geliştirilen filtre insert tabanlı bu 3D kültür sisteminin genel amacı, prostat kanseri araştırmaları için biyolojik açıdan daha ilgili bir in vitro model sistem oluşturmaktır. Primer insan hücrelerinin kullanılmasıyla bu yöntem, prostat gelişimsel biyolojisinin yanı sıra prostat kanseri ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, diferansiye primer prostat hücrelerinin oluşturulması için nispeten hızlı bir in vitro metodoloji olması ve aynı zamanda RNA, DNA ve protein gibi biyomoleküllerin hızlı izolasyonuna olanak tanımasıdır.Hücrelerin histoloji için veya RNA ve protein toplama için filtre insert üzerinde işlenmesi hassas ve zamana duyarlı süreçler olduğundan, bu yöntemlerin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Biyolojik güvenlik kabininde odacıklar arasındaki difüzyonu sınırlamaya yardımcı olmak için, insertlerin alt tarafına 0.1% jelatinin ince bir tabakası uygulayın ve kurumaya bırakın. Bu prosedürü iki kez daha tekrarlayın.Ardından hücreleri jelatin kaplı insertlerin iç haznesine ekleyin ve iki haftaya kadar kültüre edin. İki hafta sonra, kültüre edilen filtre insertlerini doğrudan aşağıda detaylandırılan uygun alt uygulamalardan birinde kullanın. Bu işleme başlamak için, dış haznedeki PBS'yi aspire edin ve iç haznedeki PBS'yi dikkatlice uzaklaştırın.Kültürlenmiş insertler, uygulama hazır olana kadar kısa bir süre PBS içinde tutulabilir ancak membranın kurumasına izin vermeyin. Ardından, her bir iç hazneye 100 µL %0,25 Trypsin EDTA ekleyin. Daha sonra bunları 37 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin.Ardından, 200 µL'lik bir pipetle yukarı-aşağı pipetleme yaparak membran yüzeyindeki hücreleri kısa bir süre ve dikkatlice sıyırın. Daha sonra hücreleri 37 °C'de bir dakika boyunca inkübe edin. Bir dakika sonra, ilk iç hazneye 250 µL kondisyonlu ortam ekleyin ve filtreyi durulamak için nazikçe yukarı-aşağı pipetleme yapın.Bu transferin ardından, resüspande edilen hücreleri aynı medya koşullarını içeren bitişik filtre haznesine aktarın ve pipetleme işlemini tekrar edin. Bu prosedürü, tek bir koşulun her bir inserti için tekrarlayın. Ardından hücreleri toplayın ve 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.Kalan hücreleri toplamak için her bir iç bölmeyi ek olarak 100 ila 200 µL kondisyonlu ortam ile durulayın ve bunları 1,5 mL'lik santrifüj tüpüne ekleyin. Ardından, hücreleri bir mikrosantrifüjde dört °C'de beş dakika boyunca döndürün. Sonrasında süpernatantı aspire edin ve hücre peletini bir kez 1.000 µL PBS ile yıkayın.Hücreleri bir mikrosantrifüjde dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca tekrar döndürün. Beş dakika sonra PBS'yi aspire edin ve örneği daha sonra kullanmak üzere eksi 80 derece Celsius'ta dondurun. Bu prosedürde, iç bölmeye 200 mikrolitre guanidinyum tiyosiyanat fenol kloroform veya benzeri bir ekstraksiyon reaktifi ekleyin ve membran yüzeyindeki hücreleri pipetle aşağı yukarı hareket ettirerek kısaca karıştırın.Ardından hücreleri ekstraksiyon reajentinde oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin ve dış bölmeyi kuru bırakın. Sonrasında, ekstraksiyon solüsyonunu pipetle yukarı ve aşağı çekerek filtre membranını yıkayın. Altı kuyucuklu plakayı eğerek ve kalan tüm sıvıyı aspire ederek mümkün olduğunca fazla ekstraksiyon reajentini toplayın.Filtrenin ekten ayrılabiliceğini lütfen unutmayın. Eğer ekliyse, ayrılan filtre membranını yıkayın. Ardından, mümkün olduğunca fazla ekstraksiyon reaktifi toplayın ve DNA, RNA veya proteinin saflaştırılması ve geri kazanımı için üreticinin protokolünü izleyin.Guanidinyum tiyosiyanat ile hücreleri ve filtreyi yıkarken dikkatli olunmalıdır; çünkü aşırı çalkalama düşük kaliteli RNA elde edilmesine neden olabilir. Filtre insertinden protein izole etmek için, filtre insertini buz üzerinde altı kuyucuklu plakaya yerleştirin. Ardından, iç bölmeye 10 µL protein liziz tamponu ekleyin.20 µL'lik bir pipetle yukarı aşağı pipetleme yaparken membran yüzeyindeki hücreleri karıştırıp kazıyın ve lizis tamponunda kabarcık oluşmamasına dikkat edin. Ardından, filtre insertleri içeren altı kuyucuklu plakayı on dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Kazıma işlemini tekrarlayın ve ardından membran yüzeyini lizis tamponu ile durulayın.Altı insertten elde edilen lizatları toplayın ve buz üzerinde 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, ilk membranı ek 10 mikrolitre lizis tamponu ile durulayın ve bir sonraki filtreye aktarın. Bu işlemi belirli bir deney koşulundaki tüm insertler için tekrarlayarak kalan tüm lizis tamponu çözeltisini toplayın ve 1,5 mililitrelik tüpe ekleyin.Numuneyi buz üzerinde beş dakika daha inkübe edin. Ardından, dört °C'de 15 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin. İşlem tamamlandığında, lizatı taze bir 1,5 mm tüpe pipetleyin.Ardından protein konsantrasyonu analizine geçiniz veya lizatları -80 °C'de saklayınız. Bu işlemde, iç ve dış hazneye sırasıyla 500 µL ve 1 mL %10 NBF ekleyiniz. Bunları 4 °C'de gece boyunca inkübe ediniz.Ertesi gün dış bölmedeki NBF'yi aspire edin ve 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne bir mililitre HEA işlem jeli ekleyin. Agaroz eriyene kadar, düşük güçte ve tekrarlanan 10 saniyelik darbelerle mikrodalga fırında yavaşça eritin. Kullanıma hazır olana kadar katılaşmayı önlemek için HEA'yı 37 degrees Celsius sıcaklıktaki bir su banyosunda tutun.Ardından, NBF'yi iç hazneden çıkarın. İç hazneye 25 µL erimiş HEA uygulayın ve agarozun katılaşması için iki ila beş dakika bekleyin. Daha sonra, iki adet köpük histoloji pedini %10 NBF ile ıslatın ve pedlerden birini bir gömme kasetine yerleştirin.HistoGel kullanarak filtre ekindeki hücre tabakalarının bütünlüğünü korumak, histolojik kesit alma işlemi için sağlam hücre tabakasının muhafaza edilmesi açısından kritik bir adımdır. Ardından, plastik ek odasının alt tarafındaki filtreyi 11 numara bistüri ucuyla çizerek kısmen serbest bırakın. Bir petri kabına 100-200 µL NBF koyun ve kısmen yerinden çıkmış olan filtreyi NBF'ye daldırın.10 numaralı bistüri ucuyla, filtreyi ekleme gövdesinden tamamen ayırmak için insert haznesinin içinden filtrenin ortasına nazikçe bastırın. Filtrenin gövdeye hala bağlı olan herhangi bir kısmı varsa, bunu bistüri ile kesin. Ardından, HEA kaplı filtreyi ortadan ikiye bölün.Filtrenin her bir yarısını, hazırlanmış histoloji kasetindeki köpük pedin üzerine yerleştirin. Ardından, filtreyi sıkıştıracak şekilde %10'luk NBF'ye batırılmış ikinci süngeri kasete ekleyin. Son olarak kaseti kapatarak mühürleyin.NBF içine yerleştirin ve gece boyunca inkübe edin. Bu aydınlık alan görüntüsü, gözenekli membranın üzerinde çok tabakalı hücre katmanlarını göstermektedir. Çekirdekler, P63 ve androjen reseptörü için bireysel floresan görüntüler ile her üç floresan işaretleyicinin birleştirilmiş görüntüsü gösterilmiştir.Son olarak, floresan sinyalinin hücrelere ve filtreye göre lokalizasyonunu belirleyen, bileşik bir parlak alan ve immünofloresan üst üste bindirme görüntüsü gösterilmiştir. Burada, filtre insertimizin bir kesit görüntüsü, sağlam bir prostatın duktal epitel tabakaları ile karşılaştırmalı olarak sunulmuştur. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem iki hafta içinde tamamlanabilir ve uygun şekilde yürütüldüğünde hücrelerin ve filtre insertinin veya istenen biyomolekülün nihai izolasyonu 30 dakikadan kısa sürer.Bu prosedürü gerçekleştirirken, hücre tabakasına veya altındaki filtreye zarar gelmemesi için filtre insertleriyle çalışırken her zaman dikkatli olunması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, yolak analizi ve kanser hücreleriyle ilgili ek soruları yanıtlamak amacıyla Western blot, RNA mikroarray ve proteom analizleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, prostat kanseri alanındaki araştırmacıların, primer prostat hücrelerini kullanarak prostat biyolojisini ve prostat kanserinin temel mekanizmalarını daha iyi keşsetmelerine yardımcı olacaktır.Bu videoyu izledikten sonra, bu 3D kültür sisteminden kültürlenmiş primer prostat hücrelerinin nasıl uygun şekilde kurulacağını ve geri kazanılacağını mükemmel bir şekilde kavramış olmalısınız.

a-rapid-filter-insert-based-3d-culture-system-for-primary-prostate

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu videoda, izole fare prostat epitel hücrelerinin matris jel halkası bazlı bir kültür tekniği kullanılarak kültürlenmesini gösteriyoruz. Bu yaklaşım, genetik veya farmakolojik manipülasyona yanıt olarak prostat epitel hücrelerinin 3D glandüler yapılar oluşturmak için farklılaşma kapasitesi hakkında tamamlayıcı bilgi sağlayabilir.

Prostat Organoid Testi: Prostat Epitel Hücrelerinin Farklılaşma Kapasitesini İncelemek İçin Matris Jel Halka Bazlı Ex Vivo Kültür Tekniği

Tümör mikroçevresini (TME) taklit etmek için geçirgen bir mikro gözenekli membran ekini uyarladık. Model, karışık bir hücre kültüründen oluşur, floresan etiketleme veya hücre sıralama kullanmadan yüksek oranda zenginleştirilmiş bireysel hücre popülasyonlarının basitleştirilmiş üretimine izin verir ve normal veya stres koşulları altında TME içinde hücreler arası iletişimin incelenmesine izin verir.

Tümör mikroçevresinin A Mimik: Hücreler arası İletişim Zenginleştirilmiş hücre popülasyonları oluşturma ve incelenmesi için Basit Bir Yöntem

Bu iletişim kuralı, retina pigment epitel hücreleri (RPE) pluripotent kök hücre üretmek açıklar. Yöntem farklılaşma kök hücre içine olgunlaşmamış RPE on dört gün ve olgun, fonksiyonel RPE üç ay sonra büyüme faktörleri ve küçük moleküller bir arada kullanır.

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

Genetik fareler prostat kanseri mekanizmaları araştıran için yararlı modellerdir. Burada bir fare ürogenital sistemden prostat loblar incelemek, Histoloji üzerinde göre ayırt etmek ve yalıtmak ve pulcuklarının aşağı akım analizleri için olarak birincil Prostat hücreleri vitro kültür için bir iletişim kuralı mevcut.

Kimlik, histolojik karakterizasyonu ve için fare Vitro 3D küresel kültür modelleri prostat lob diseksiyonu

Burada, insan birincil prostat organoid kullanım kılavuzu sonra fenotip değerlendirmek için bitiş noktaları önermek için bir protokol mevcut. Tohum, kültür bakım, matris jel, kurtarma morfolojik miktar, katıştırma ve kesit, FFPE kesit, Bütün Dağı boyama ve ticari deneyleri uygulanması anlatılmaktadır.

Kullanım ve insan birincil prostat Organoid kültürü değerlendirilmesi

Fare prostat organoidleri farklılaşmayı düzenleyen mekanizmaları değerlendirmek için umut verici bir bağlam temsil eder. Bu makalede prostat organoidleri kurmak için geliştirilmiş bir yaklaşım açıklanır ve (1) organoidlerden protein lysate toplamak için yöntemler tanıttı, ve (2) tam monte konfokal mikroskopi için düzeltve leke organoidler.

Organoid Kültürü Kullanarak Fare Prostat Epitel Hücrelerinin Ayırt Etme Kapasitesinin Değerlendirilmesi

Burada sunulan prostat epitel organoidleri farmakolojik yanıtları çalışma için bir protokoldür. Organoidler vivo biyolojiye çok benzer ler ve hasta genetiğini yeniden özetlerler, bu da onları çekici model sistemleri haline getirir. Prostat organoidleri wildtype prostatlar, genetiği değiştirilmiş fare modelleri, iyi huylu insan dokusu ve ileri prostat kanserinden kurulabilir.

Genotipleri ve Mutasyonel Profilleri Farmakolojik Tepkilere Çeviren Araçlar Olarak Prostat Organoid Kültürleri

İnsan primer prostat epitel hücreleri kullanarak, kök benzeri hücrelerin küresel tabanlı etiket tutma testi ile fonksiyonel karakterizasyonu için yeni bir biyomarker-free yöntemi ni rapor ediyoruz. BrdU, CFSE veya Far Red 2D hücre etiketlemesi için adım adım bir protokol tanımlanır; üç boyutlu küresel oluşum; immünositokimya ile etiket tutucu kök benzeri hücre tanımlama; ve FACS tarafından izolasyon.

3 Boyutlu Spheroid Kültürlerden Kök Benzeri Hücrelerin İzolasyon

Bu protokol, in vitro model bir insan kan-beyin bariyeri (BBB) oluşturmak için bir yöntem açıklar. Endotel hücreleri ve perisitler bir kesici uç filtrenin (kan bölmesi) her iki tarafına ekilir ve astrositler alt kuyucuğa (beyin bölmesi) ekilir. Karakterize edilen model, nanopartikül taşıma deneyleri için kullanılmıştır.

İnsan Kan-Beyin Bariyerini Modelleyen Üçlü Kültür Hücre Sistemi

Bu yazıda, yeni tasarlanmış bir 3D baskılı ek, bir ko-kültür modeli olarak sunulmuş ve endotel hücreleri ile keratinositler arasındaki parakrin hücreler arası iletişimin incelenmesiyle doğrulanmıştır.

Basit 2D ve 3D hücre kültürlerini mümkün kılmak için tasarlanmış yenilikçi bir 3D baskılı ek parça

Bu protokol, radikal prostatektomilerden fibroblastları izole etmek, genişletmek ve ölümsüzleştirmek için kapsamlı bir prosedür sağlar. Ayrıca, fibroblast-tümör hücresi karışmasının fonksiyonel etkilerini değerlendirmek için geliştirilen, hem şartlandırılmış ortamla tedaviden hem de birlikte kültürlemeden yararlanan tahlilleri açıklar.

Prostat Kanseri ile İlişkili Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

Öğrenin, filtre ekleme tabanlı 3D kültür sistemi ile primer prostat hücrelerini hızla farklılaştırma ve RNA, DNA, protein izolasyonu yöntemlerini. Bu teknik, prostat kanseri araştırmaları için biyolojik olarak daha uygun in vitro modeller oluşturur.

Primer Prostat Hücre Farklılaşma için hızlı Filtre Ekle tabanlı 3D Kültür Sistemi

Daha fazla video keşfet