Primer Prostat Hücre Farklılaşma için hızlı Filtre Ekle tabanlı 3D Kültür Sistemi

Hastadan türetilen birincil hücreler için bu filtre ekleme tabanlı 3D kültür sisteminin genel amacı, prostat kanseri araştırmaları için biyolojik olarak daha ilgili bir in vitro model sistemi oluşturmaktır. Birincil insan hücrelerini kullanarak, bu yöntem prostat gelişim biyolojisinde ve prostat kanserinde önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, farklılaşmış primer prostat hücrelerinin kurulması için nispeten hızlı bir in vitro metodoloji olması ve aynı zamanda RNA, DNA ve protein gibi biyomoleküllerin hızlı bir şekilde izole edilmesine izin vermesidir.

Bu yöntemlerin görsel gösterimi, histoloji veya RNA ve protein toplama için filtre ekindeki hücrelerin işlenmesi hassas ve zamana duyarlı olduğundan kritik öneme sahiptir. Biyolojik güvenlik kabinindeki bölmeler arasındaki difüzyonu sınırlamaya yardımcı olmak için, eklerin alt tarafına ince bir %0,1 jelatin tabakası uygulayın ve kurumasını bekleyin. Bu işlemi iki kez daha tekrarlayın.

Daha sonra hücreleri jelatin kaplı eklerin iç haznesine uygulayın ve iki haftaya kadar kültürleyin. İki hafta sonra, kültürlenmiş filtre eklerini doğrudan aşağıda ayrıntıları verilen uygun aşağı akış uygulamalarından birine uygulayın. Bu prosedüre başlamak için, PBS'yi dış hazneden aspire edin ve PBS'yi iç hazneden dikkatlice çıkarın.

Kültürlenmiş ekler, uygulama başlamaya hazır olana kadar kısa bir süre PBS'de tutulabilir, ancak zarın kurumasına izin verilmez. Daha sonra her bir iç hazneye 100 mikrolitre% 0.25 Tripsin EDTA ekleyin. Sonra onları 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin.

Daha sonra, yukarı ve aşağı pipetlerken 200 mikrolitrelik bir pipetle zar yüzeyindeki hücreleri kısa ve dikkatli bir şekilde kazıyın. Sonra onları 37 santigrat derecede bir dakika inkübe edin. Bir dakika sonra, ilk iç hazneye 250 mikrolitre şartlandırılmış ortam ekleyin ve filtreyi durulamak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.

Bunu takiben, yeniden askıya alınan hücreleri aynı ortam koşullarını içeren bitişik filtre bölmesine aktarın ve pipetlemeyi yukarı ve aşağı doğru tekrarlayın. Tek bir koşulun eklerinin her biri için bu yordamı yineleyin. Daha sonra hücreleri toplayın ve 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Kalan hücreleri toplamak için her bir iç hazneyi 100 ila 200 mikrolitre şartlandırılmış ortamla durulayın ve bunları 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne ekleyin. Daha sonra, hücreleri beş dakika boyunca dört santigrat derecede bir mikrosantrifüjde döndürün. Daha sonra süpernatanı aspire edin ve hücre peletini bir kez 1.000 mikrolitre PBS ile yıkayın.

Hücreleri tekrar bir mikrosantrifüjde dört santigrat derecede beş dakika döndürün. Beş dakika sonra PBS'yi aspire edin ve numuneyi daha sonra kullanmak üzere eksi 80 santigrat derecede dondurun. Bu prosedürde, iç hazneye 200 mikrolitre guanidinyum tiyosiyanat fenol kloroform veya benzeri ekstraksiyon reaktifi ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek zar yüzeyindeki hücreleri kısa bir süre çalkalayın.

Daha sonra ekstraksiyon reaktifindeki hücreleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin ve dış hazneyi kuru bırakın. Daha sonra, ekstraksiyon solüsyonunu yukarı ve aşağı pipetleyerek filtre membranını yıkayın. Altı kuyucuklu plakayı eğerek ve kalan sıvıyı aspire ederek mümkün olduğunca çok ekstraksiyon reaktifi toplayın.

Filtrenin ek parçadan ayrılabileceğini lütfen unutmayın. Takılıysa ayrışmış filtre membranını yıkayın. Daha sonra mümkün olduğu kadar çok ekstraksiyon reaktifi toplayın ve DNA, RNA veya proteinin saflaştırılması ve geri kazanılması için üreticinin protokolünü izleyin.

Hücreleri yıkarken dikkatli olunmalı ve guanidinyum tiyosiyanat ile filtrelenmelidir, çünkü aşırı çalkalama düşük kaliteli RNA'ya neden olabilir. Filtre elemanından proteini izole etmek için, filtre elemanını buz üzerindeki altı oyuklu plakaya yerleştirin. Daha sonra iç hazneye 10 mikrolitre protein lizis tamponu ekleyin.

Yukarı ve aşağı pipetlerken 20 mikrolitrelik bir pipetle zar yüzeyindeki hücreleri çalkalayın ve kazıyın ve lizis tamponunda kabarcıklar oluşmasını önleyin. Daha sonra, altı oyuklu plakayı filtre ekleri ile on dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Kazıma işlemini tekrarlayın ve ardından membran yüzeyini lizis tamponu ile durulayın.

Lizatları altı parçadan toplayın ve bunları buz üzerinde 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, ilk zarı 10 mikrolitre ek bir lizis tamponu ile durulayın ve bir sonraki filtreye aktarın. Belirli bir deneysel koşulun tüm ekleri için bu prosedürü tekrarlayın, herhangi bir artık lizis tampon çözeltisini toplayın ve 1.5 mililitrelik tüpe ekleyin.

Numuneyi beş dakika daha buz üzerinde inkübe edin. Ardından dört santigrat derecede 15 dakika boyunca maksimum hızda döndürün. Tamamlandığında, lizatı 1,5 milimetrelik yeni bir tüpe pipetleyin.

Daha sonra protein konsantrasyonunun analizine devam edin veya lizatları eksi 80 santigrat derecede saklayın. Bu prosedürde, iç ve dış hazneye sırasıyla 500 mikrolitre ve bir mililitre% 10 NBF ekleyin. Onları gece boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın.

Ertesi gün NBF'yi dış hazneden aspire edin ve 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne bir mililitre HEA işleme jeli ekleyin. Agarozu düşük güç kullanarak bir mikrodalgada yavaşça eritin ve agaroz eriyene kadar 10 saniyelik darbeleri tekrarlayın. Kullanıma hazır olana kadar katılaşmayı önlemek için HEA'yı 37 santigrat derece ılık bir banyoda tutun.

Ardından, NBF'yi iç hazneden çıkarın. İç hazneye 25 mikrolitre erimiş HEA uygulayın ve agarozun iki ila beş dakika katılaşmasına izin verin. Daha sonra iki köpük histoloji pedini %10 NBF'de ıslatın ve bir pedi gömme kasetine yerleştirin.

HistoGel kullanılarak filtre eki üzerindeki hücre katmanlarının bütünlüğünün korunması, histolojik kesitleme için sağlam hücre katmanının korunması için kritik bir adımdır. Bundan sonra, filtreyi plastik yerleştirme haznesinin alt tarafından çalmak için 11 numaralı bir bıçak neşteri kullanın ve kısmen serbest bırakın. 100-200 mikrolitre NBF'yi bir petri kabına yerleştirin ve kısmen yerinden çıkmış filtreyi NBF'ye daldırın.

10 numara bıçaklı neşterle, filtreyi kesici uç haznesinden tamamen çıkarmak için kesici uç haznesinin içinden filtrenin ortasına hafifçe bastırın. Filtrenin hala namluya bağlı olan herhangi bir parçası varsa, neşter ile kesin. Daha sonra HEA kaplı filtreyi ikiye bölün.

Filtrenin her iki yarısını hazırlanan histoloji kasetindeki köpük pedin üzerine yerleştirin. Ardından, filtreyi sandviçleyerek ikinci% 10 NBF batırılmış süngeri kasete ekleyin. Ardından, kaseti kapatın.

NBF'ye yerleştirin ve gece boyunca inkübe edin. Bu parlak alan görüntüsü, gözenekli zarın üstündeki çok katmanlı hücre katmanlarını göstermektedir. Çekirdekler, P63 ve androjen reseptörü için ayrı ayrı floresan görüntüleri, üç floresan markörün tümünün birleşimi gibi gösterilir.

Son olarak, floresan sinyalin hücrelere ve filtreye göre lokalizasyonunu belirleyen bir kompozit parlak alan ve immünofloresan kaplama gösterilir. Burada, sağlam bir prostatın duktal epitel katmanlarına kıyasla filtre ekimizin enine kesit görüntüsü gösterilmektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, hücrelerin ve filtre ekinin veya istenen biyomolekülün son bir izolasyonu ile iki hafta içinde yapılabilir ve uygun şekilde yapılırsa 30 dakikadan az sürer.

Bu prosedürü gerçekleştirirken, hücre katmanına veya alttaki filtreye zarar vermemek için filtre ekleriyle çalışırken her zaman dikkatli olmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, yolak analizi ve kanser hücreleri ile ilgili ek soruları yanıtlamak için Western lekeleri, RNA mikroarray ve proteom analizleri gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu teknik, prostat kanseri alanındaki araştırmacıların prostat biyolojisini ve birincil prostat hücrelerini kullanarak prostat kanserinin temellerini daha iyi keşfetmelerinin önünü açmaya yardımcı olacaktır.

Bu videoyu izledikten sonra, bu 3D kültür sisteminden kültürlenmiş birincil prostat hücrelerinin nasıl düzgün bir şekilde kurulacağı ve kurtarılacağı konusunda mükemmel bir anlayışa sahip olmalısınız.