Çok Örnekli Deneylerde Toprak Mikroplarını Karakterize Etmek İçin Bir Lipid Ekstraksiyon ve Analiz Metodu

Bu videonun amacı, toprak mikrobiyal topluluk yapısını ve birçok örnekle yapılan çalışmaları belirlemek için hem toplam lipidleri hem de indikatör lipidlerin nispi bolluğunu karakterize etmede kullanılmak üzere mikroorganizmaların hücre zarlarından lipitlerin ekstraksiyonu için çaba ve doğruluğu dengelerken verimi artıran bir yöntemi tanımlamaktır. Sahada, toprak örneklerini sahanızı temsil edecek şekilde toplayarak toprak heterojenliğini hesaba katmalısınız. Numune alma sırasında mikrobiyal topluluğu korumak için, numuneler tarladan buz üzerinde taşınmalıdır.

Laboratuvara geri döndüğünüzde, kökleri ve taşları çıkarın ve kaba eleme ile kesekleri parçalayın. Bu aynı zamanda numunenizi homojenize etmeye de yarar. Alt numuneleri uygun kaplara koyarak dondurarak kurutmaya hazırlanın ve mümkün olan en kısa sürede dondurarak kurutun.

Kirler dondurularak kurutulduktan sonra, ekstraksiyona kadar kurutucu madde içeren kapalı bir kapta saklayın. Dondurucuda kurutulmuş toprakları ekstraksiyon hazırlığı C.As 80 derecede saklamak, dondurularak kurutulmuş toprakları depodan çıkarmak ve öğütmek en iyisidir. Öğütme yöntemleri arasında bilyalı değirmen, bilyalı metre veya havan ve havan tokmağı bulunur.

Toprağı öğüttükten sonra tekrar toprak numunelerinizi iyice homojen hale getirin ve derin dondurucuda saklayın. Tüm laboratuvar gereçleri titizlikle temiz olmalıdır. Herhangi bir deterjan kalıntısı, gres yağı veya kir, son GC kromatogramında bir tepe noktası olarak görünerek sonuçları etkileyebilir.

Ekstraksiyonlar, çözücü ile durulanması gereken 30 mililitrelik Teflon santrifüj tüplerinde gerçekleştirilir. Tüplere iki ila üç mililitre heksan ekleyin ve birkaç saniye girdap yapın. Hekzanı başka bir tüpe boşaltın ve girdap yapın.

Altı tüpü seri olarak durulamak için iki ila üç mililitre heksan kullanılabilir. Hekzan durulanmış tüpleri çeker ocakta baş aşağı saklayın ve kullanılmış hekzanı uygun bir atık kabına atın. Cam eşyalar kullanımdan hemen önce boğulabilir veya solvent ile durulanabilir.

Susturma, kalıntıların yüksek sıcaklıkta oksidasyonu ile cam eşyaların temiz olmasını sağlar. Cam eşyayı iki ila üç kat alüminyum folyoya sarın ve kül fırınına yerleştirin. 450 ° C'ye ayarlayın ve fırın ayar noktasına ulaştığında en az 4 1/2 saat pişirin.

Fırından çıkarmadan önce soğuması için en az bir saat bekleyin. Hekzan durulanmış Teflon tüpleri etiketleyin ve tartın. Teflon santrifüjlü tüplere toprak ekleyin ve toprak kütlesi için tekrar tartın.

Ekstraksiyonun doğru çalıştığını doğrulamak istiyorsanız, her zaman parti başına en az iki boşluk yapın ve bir kontrol standardı, tercihen daha önce ekstrakte edilmiş bir toprak ekleyin. Lipid ekstraksiyonları. Fosfat tamponu, kloroform ve metanol için üç adet beş ila 10 mililitrelik yeniden pipet hazırlayın.

Kloroform, düşük yüzey gerilimine sahip çok yoğun bir sıvıdır. Dağıttığınız miktarın doğru ve tutarlı olmasına dikkat edin. Şişeyi en az yarısı sıvı dolu tutun.

Çeker ocakta, reaktifleri Teflon tüpteki toprağa aşağıdaki sırayla ekleyin, fosfat tamponu, kloroform ve metanol. Bu, numune materyalinizden lipitlerin ilk fiziksel ekstraksiyonudur. Reaktif çözeltileri için tarifler yazılı protokole dahil edilmiştir.

Çözücü oranları ve ekleme sırası, organik ve sulu fazların uygun şekilde ayrılması için önemlidir. Kloroformu eklemeden önce tampon ilavesinden sonra toprakların ıslanmasına izin verin. Uygunsa, özütleyiciler birleştirilebilir ve ikinci ve sonraki ekstraksiyonlar için tek bir alikot olarak eklenebilir.

Teflon tüpleri sıkıca kapatın ve ışıktan korumak için üzerini kapatın. İyi sabitlendiklerinden emin olarak çalkalayıcıya yatay olarak yerleştirin. Yüksek hız ayarıyla, istediğiniz saat boyunca sallayın.

Tüpler çalkalanırken, her numune için aşağıdaki gibi iki uzun cam tüp hazırlayın. Tüpü etiketleyin, toprağa eklenen aynı hacimde kloroform ve eşit hacimde fosfat tamponu ekleyin. Teflon tüpleri çalkalayıcıdan 25 ° C'de çıkardıktan sonra, tüpleri 2.500 RPM'de 10 dakika santrifüjleyin.

Daha sonra, ışıklar kapalıyken davlumbazda, süpernatanı Teflon tüpten uzun tüplerden birine boşaltın. Faz ayrımı cam tüpte görünür olmalıdır. Alt katman, başta kloroform olmak üzere organik çözücüyü ve lipitleri içerir.

Bu çıkarma işlemi tekrarlanır. Süpernatanı daha önce hazırlanan ikinci tüpe dökün. Şimdi lipitleri topraktan iki kez fiziksel olarak çıkardınız.

Çoğu toprak için bu yeterlidir. Tüm uzun sınıf tüpleri Teflon kaplı kapaklarla güvenli bir şekilde kapatın ve karıştırmak için 10 kez ters çevirin. Fazları gece boyunca yerçekimi ile ayırın.

İki fazın ayrılmasını tamamlamak için numunelerin gece boyunca rahatsız edilmeden durmasına izin verin. Bunu yapmak için numuneleri karanlık bir dolapta saklayın veya oda sıcaklığında alüminyum folyo ile kaplayın. Ekstraktların hafta sonu boyunca ayrılmasına izin vermek sorun değil.

İkinci gün, lipitlerin izolasyonu. İkinci günde, sulu tabaka aspire edilir ve lipitler, çözücünün bir vakumlu buharlaştırma sisteminde uzaklaştırılmasıyla konsantre edilir. Numuneler ayrıca bir su veya kum banyosuna yerleştirilerek ve hafif bir nitrojen akışı uygulanarak kurutulabilir.

Tüplerdeki sıvı şimdi iyi ayrılmalı ve büyük ölçüde berrak olmalıdır. Değilse veya iki katman arasındaki arayüz özellikle kalınsa, ayrılmanın bir gün daha devam etmesine izin verin. Davlumbaza bir vakum aspiratörü kurun.

Bu, bir yaprak Tygon hortumu ve bir mera pipeti ile bir vakum pompasına bağlı bir yan kol şişesidir. Pompa çalışırken, sulu fazı şişeye çekmek için pipeti kullanın. Üst katmanı ve arayüzü aspire edin.

Bu, yolun yaklaşık 2 / 3'ü kadar olacaktır. Bunu iki ila üç set cam tüpe yapın. Üst tabaka birkaç toprak parçacığı içerebilir.

Mümkünse bunları kaldırın. İkinci ve/veya üçüncü tüp setindeki ekstraktı, dikkatlice boşaltarak ilk ikisindekiyle birleştirin. Herhangi bir katı malzemenin dökülmesini engellemeye çalışın ve tüpün duvarlarını döndürerek durulayın.

Her numune için temiz bir pipet kullanın ve kalan numuneler için bu işlemi tekrarlayın. Kloroform ekstraktları birleştirildikten ve birkaç dakika bekletildikten sonra, sıvının yüzeyini inceleyin. Çoğu zaman, ince bir artık su tabakası oluşacaktır.

Bu varsa, devam etmeden önce aspire edin. Artık su, yağ asidi çift bağlarına saldırabilir, ancak numuneler kurutuldukça çok küçük bir miktar çözücülerle birlikte buharlaşmalıdır. Vakumlu buharlaştırma aparatını kullanarak tüm numuneleri kurutun.

Tüpleri sıkıca kapatın ve 80 ° C'de bir dondurucuda saklayın. Üçüncü gün, sabunlaşma ve metilasyon. İlk önce su banyolarını açın. Su seviyesini kontrol edin ve banyoyu bir ila 95 derece C'ye ve banyo iki ila 80 derece C'ye ayarlayın.Yeniden pipet kullanarak, kurutulmuş lipitlere bir mililitre sabunlaştırma reaktifi, Reaktif 1 ekleyin.

Sıkıca kapatın, kısa bir süre sarın ve bir rafa yerleştirin. Bu adıma indikten sonra, tüp rafını 95 derece C su banyosuna yerleştirin ve beş dakika bekleyin. Tüp rafını banyodan çıkarın ve tüplerde sızıntı olup olmadığını kontrol edin.

Bu, tüpte bir köpük gibi yükselen kabarcıklarla gösterilecektir. Sızıntı yapan tüplerin kapaklarını yeniden sıkın veya değiştirin. Tüpleri su banyosunda 10 dakika daha ısıtmaya devam edin.

Su banyosundaki sıcaklık ayarını 80 ° C'ye düşürün ve inkübasyona 15 dakika daha devam edin. Tüpleri çıkarın ve rafı bir musluk suyu kabına yerleştirerek soğutun. Buzlu su kullanmayın.

Numuneler soğuduktan sonra, her numuneye iki mililitre metilasyon reaktifi, Reaktif 2 ekleyin. Yine, sıkıca kapatın ve beş ila 10 saniye boyunca girdap yapın. Granül tuzlar, çözelti içinde bir çökeltici olarak görünür hale gelebilir, bu da bazen aşırı reaktifler nedeniyle meydana gelir.

Rafı 80 derece C su banyosuna yerleştirin ve 10 dakika inkübe edin. Tüp rafını su banyosundan çıkarın ve soğutmak için bir musluk suyu kabına koyun. Soğutma işlemini hızlandırmak için rafı çalkalayın.

Bir yeniden pipet kullanarak, fazı çıkarmak için her tüpe 1.25 mililitre bir adet hekzan ve metil üçüncül bütil eter, Reaktif 3 ekleyin. Kapakları sıkıca kapatın ve tüpleri 10 dakika boyunca bir çalkalayıcıya koyun. Çalkaladıktan sonra, fazların ayrılması için tüp rafının 10 dakika oturmasına izin verin.

Artık en üst katman olan organik fazı bir mera pipeti kullanarak kısa bir cam tüpe aktarın. Sıvının çoğunu geri kazanmak en iyisidir. Sulu fazın çok küçük miktarları ekstraksiyonu tehlikeye atmayacaktır.

Reaktif 3 ekleyerek, çalkalayarak, fazların ayrılmasına izin vererek ve üst fazı aktararak sulu faz ekstraksiyonunu tekrarlayın. Alt fazın durumuna bağlı olarak, bunu toplam üç transfer için bir kez daha tekrarlayabilirsiniz. Kısa tüplerdeki ekstraktlara 3 mililitre baz yıkama, seyreltik bir sodyum hidroksit çözeltisi olan Reaktif 4 ekleyin.

Test tüplerini sıkıca kapatın ve 20 ila 30 saniye girdap yapın ve ardından 2.000 RPM'de üç dakika santrifüjleyin. Santrifüjlendikten sonra, temiz bir mera pipeti kullanarak üst organik fazı aspire edin ve dört mililitrelik kehribar bir şişeye aktarın. Sulu fazların hiçbirini aspire etmemeye çok dikkat edin.

Bir sonraki adım, çözücüyü bir vakumlu buharlaştırma aparatında kuruyana kadar buharlaştırmaktır. Dördüncü gün, GC analizi için ekstraktların hazırlanması. Pipetleyiciyi kullanarak, kurutulmuş fazı içeren 100 mililitrelik şişelerin her birine 3 mikrolitre Reaktif 4 ekleyin.

Numuneyi girdaplayın ve ardından 10 dakika bekletin. İkinci pipetleyiciyi kullanarak, askıya alınmış FAME'leri dikkatlice bir GC şişesine aktarın. Dört mililitrelik şişeye başka bir çözücü alikotu ekleyin ve kısaca girdaplayın.

Şişenin duvarlarında kalan FAME'lerin çözüldüğünden emin olmak için şişeyi yuvarlayın. İkinci pipetleyiciyi tekrar kullanarak, çözücüyü GC şişesine aktarın. Şişeye üçüncü bir çözücü alikotu ekleyerek, girdaplayarak ve GC şişesine aktararak aktarımı tamamlayın.

GC şişesini kapatın ve dondurucuda saklayın. Analizden önce kapalı GC şişelerini dondurucuda saklayın. GC analizi.

Bu sistemi kullanmak için, analizin belirli bir GC sütunu kullanılarak yapılması gerekir. Gaz kromatografı, devre dışı bırakılmış bir cam yünü tapaya sahip dört milimetrelik bir iç cam giriş astarı ile donatılmış bölünmüş bir bölmesiz giriş ile donatılmıştır. Giriş 250 ° C'ye ayarlanmıştır ve sabit bir basınç modunda çalıştırılır.

Taşıyıcı gaz hidrojendir. Dedektör destek gazları olarak nitrojen ve havaya ihtiyaç vardır. Bir Agilent Ultra 2 sütunu kullanılır.

Sütun 25 metre uzunluğunda, 2 milimetre iç çapa ve 33 mikrometre sabit faz film kalınlığına sahiptir. Bu kolondaki sabit faz, DB-5 tipi kolon olarak da bilinen %5 fenil, %95 metilpolisiloksandır. Lipid ekstraktlarını analiz etmek için, fırın sıcaklığı 170 derece C.Post enjeksiyonda iken 100: 1 bölünmüş bir oranda iki mikrolitrelik bir alikot enjekte edilir, fırın dakikada beş derecede 300 derece C'ye çıkacak şekilde programlanır ve ardından 12 dakika tutulur.

MIDI standardının bir dizi enjeksiyonu yapılır ve sonuçlar MIDI kılavuzundaki talimatlara göre ayarlamalar yapmak için kullanılır. Bu şekilde kalibre edildikten sonra, sistem zaman zaman küçük ayarlamalara ihtiyaç duyabilir, ancak genellikle bu parametreleri kullanarak iyi sonuçlar elde etmelidir. MIDI sistemi, gerçekleşen tepe noktası başına bir satır içeren bir tablo içeren her örnek için bir rapor üretir.

Yazılım, ECL veya tahmini zincir uzunluğu, tepe tanımlaması için kullanılan bir parametre ve tutma süresine göre varyasyonları ve dedektör yanıtını normalleştirmek için kullanılan bir parametre olan bir yanıt faktörü ile birlikte en yüksek tutma süresini, tepe alanını, tepe tanımlamasını bildirir. ECL, bir dizi düz zincirli FAME arasında her bilinmeyen FAME'in nerede ortaya çıktığını ifade eder. Örneğin, bilinmeyen bir kişinin tutma süresi 12 ve 13 karbon zincirininkiler arasında yarı yarıya ilerlerse, ECL 12.5 karbon zinciri olarak rapor edilir.

Yazılım, her bir zirvenin ECL'sini bir veritabanındaki FAME'lerinkilerle karşılaştırır ve eşleşmelerin meydana geldiği yerlerde karşılık gelen adı bilinmeyene atar. Veritabanındaki iki FAME'in çok yakın ECL'lere sahip olduğu durumlarda, yazılım her iki adı da en yakın olanı listeleyerek bildirir. Raporlardaki veri tabloları bir elektronik tabloda veya veritabanında harmanlanabilir.

Yanıt faktörü için ayarlama yapıldıktan sonra, tepe alanları daha sonra ekstraktın bir konsantrasyonuna ulaşmak için harici veya dahili bir standardın tepe alanı ile karşılaştırılabilir. Ekstrakte edilen toprak kütlesine bölünerek, veriler bir gram toprak başına FAME kütlesi olarak veya ayrıca her bir FAME'in moleküler ağırlığı kullanılarak bir gram toprak başına nanomol olarak ifade edilebilir. Biyobelirteç FAME'ler daha sonra mikrobiyal loncaların biyokütlesini elde etmek için toplanabilir ve bu loncalar daha fazla analiz edilebilir.

Örneğin, burada döllenmiş çayırlardan daha fazla FAME biyokütlesine sahip döllenmemiş çayırları görüyoruz. Her ikisi de yakındaki mısır tarlalarından daha fazla biyokütleye sahiptir. Ayrıca, FAME'ler mantarlar veya bakteriler gibi belirli fonksiyonel gruplarla ilişkilidir.

Bu dernekler ekosisteme özgüdür, bu nedenle onları aşırı genelleştirmemek önemlidir. Bu tür bir analiz, belirli grupların belirli ortamlarda daha bol olup olmadığını gösterir. Burada, döllenmemiş çayırlarda mantarlar mısır tarlasından daha bol miktarda bulunur.

Ve son olarak, genel mikrobiyal topluluk bileşimine bakmanın bir başka yolu, metrik olmayan çok boyutlu ölçeklendirme, NMDS veya temel bileşenler analizi, PCA gibi koordinasyon yöntemlerini kullanarak tüm FAME'lerin nispi bolluğuna bir kerede bakarak karşılaştırmaktır. Bir koordinasyonda, daha benzer olan mikrobiyal topluluklar birbirine daha yakın olacaktır. Bu nedenle, örnek verilerimize göre, mısır ve döllenmemiş çayırlar birbirinden çok uzakken, bazı döllenmiş çayır örnekleri mısırdan gelenlere benzeyen mikrobiyal topluluklara sahiptir ve diğerleri döllenmemiş çayıra benzemektedir.

Mikrobiyal topluluklar genellikle bir ortam içinde bile oldukça değişkendir, bu nedenle her zaman düzgün bir şekilde ayrılmazlar. Bu videoyu izledikten sonra, mikroorganizmaların hücre zarlarından lipid biyobelirteçlerinin topraktan çıkarılma sürecini iyi anlamak gerekir. Fosfolipid yağ asitlerinin ekstraksiyonu, benzersiz mikrobiyal biyobelirteçlerin tanımlanması yoluyla mikrobiyal loncaları ve toplam mikrobiyal biyokütleyi değerlendirmenin etkili, hızlı ve ucuz bir yoludur.