Çok Örnekli Deneylerde Toprak Mikroplarını Karakterize Etmek İçin Bir Lipid Ekstraksiyon ve Analiz Metodu

Bu videonun amacı, toprak mikrobiyal topluluk yapısını belirlemek ve çok sayıda numunenin incelendiği çalışmalar için hem toplam lipidlerin hem de belirteç lipidlerin bağıl bolluğunun karakterizasyonunda kullanılmak üzere, mikroorganizmaların hücre membranlarından lipid ekstraksiyonu için çaba ve doğruluk dengesini korurken verimliliği artıran bir yöntemi açıklamaktır. Sahada, saha alanınızı temsil edecek şekilde toprak numuneleri toplayarak toprak heterojenliğini göz önünde bulundurmalısınız. Örnekleme anındaki mikrobiyal topluluğu korumak için numuneler sahadan buz üzerinde taşınmalıdır.

Laboratuvara dönüldüğünde, kökler ve taşlar çıkarılmalı ve kaba eleme yoluyla topaklar parçalanmalıdır. Bu işlem aynı zamanda numunenizin homojenleştirilmesini sağlar. Alt numuneleri uygun kaplara koyarak dondurarak kurutma işlemine hazırlayın ve mümkün olan en kısa sürede dondurarak kurutun.

Topraklar dondurularak kurutulduktan sonra, ekstraksiyona kadar kurutucu içeren sızdırmaz bir kapta saklayın. Dondurularak kurutulmuş toprakların -80 °C'de saklanması en uygunudur. Ekstraksiyon hazırlığı olarak, dondurularak kurutulmuş toprakları saklama alanından çıkarın ve öğütün. Öğütme yöntemleri arasında bilyalı değirmen veya havan ve eli kullanıma dahil olabilir.

Toprağı öğüttükten sonra, toprak örneklerinizi tekrar iyice homojen hale getirin ve dondurucuda saklayın. Tüm laboratuvar malzemeleri titizlikle temizlenmiş olmalıdır. Kalan deterjan, gres yağı veya kir kalıntıları, nihai GC kromatogramında bir pik olarak görünerek sonuçları etkileyebilir.

Ekstraksiyonlar, solvent ile durulanmış olması gereken 30 mililitrelik Teflon santrifüj tüplerinde gerçekleştirilir. Tüplere iki ila üç mililitre heksan ekleyin ve birkaç saniye boyunca vorteksleyin. Heksanı başka bir tüpe aktarın ve vorteksleyin.

Altı tüpü seri olarak durulamak için iki ila üç mililitre heksan kullanılabilir. Heksan ile durulanan tüpleri çeker ocakta baş aşağı şekilde saklayın ve kullanılmış heksanı uygun bir atık konteynerine dökün. Cam malzemeler, kullanımdan hemen önce kalsine edilebilir veya çözücü ile durulanabilir.

Külleme, kalıntıların yüksek sıcaklıkta oksidasyonu ile cam malzemelerin temizlenmesini sağlar. Cam malzemeleri iki ila üç kat alüminyum folyo ile sarın ve küküme fırınına yerleştirin. Sıcaklığı 450 °C'ye ayarlayın ve fırın ayarlanan değere ulaştığında, malzemeleri en az 4 1/2 saat boyunca pişirin.

Fırından çıkarmadan önce soğuma için en az bir saat bekleyin. Hegzan ile durulanan Teflon tüpleri etiketleyin ve tartın. Teflon santrifüj tüplerine toprak ekleyin ve toprak kütlesi için yeniden tartın.

Ekstraksiyonun doğru çalışıp çalışmadığını doğrulamak istiyorsanız, her grup için en az iki boş kontrol hazırlayın ve tercihen daha önce ekstraksiyonu yapılmış bir toprak örneğini kontrol standardı olarak ekleyin. Lipid ekstraksiyonları. Fosfat tamponu, kloroform ve metanol için üç adet 5 ila 10 mililitrelik yeniden pipetleme tüpü hazırlayın.

Kloroform, düşük yüzey gerilimine sahip çok yoğun bir sıvıdır. Dağıttığınız miktarın doğru ve tutarlı olduğundan emin olun. Şişeyi en az yarıya kadar sıvı dolu tutun.

Çeker ocak içerisinde, Teflon tüpteki toprağa reaktifleri şu sırayla ekleyin: fosfat tamponu, kloroform ve metanol. Bu, örnek materyalinizden lipidlerin gerçekleştirildiği ilk fiziksel ekstraksiyondur. Reaktif çözeltilerinin tarifleri yazılı protokolde yer almaktadır.

Organik ve sulu fazların düzgün şekilde ayrılması için çözücü oranları ve ekleme sırası önemlidir. Kloroform eklemeden önce, tampon çözelti ilavesinden sonra toprakların ıslanması için zaman tanıyın. Uygunsa, ekstraksiyon çözücüleri birleştirilebilir ve ikinci ve sonraki tüm ekstraksiyonlar için tek bir alikot halinde eklenebilir.

Teflon tüpleri sıkıca kapatın ve ışıktan korumak için üzerini örtün. Tüpleri, iyice sabitlendiğinden emin olarak çalkalayıcıya yatay şekilde yerleştirin. Hız ayarı yüksek olacak şekilde bir saat boyunca çalkalayın.

Tüpler çalkalanırken, her bir örnek için iki adet uzun cam tüpü şu şekilde hazırlayın. Tüpü etiketleyin, toprağa eklenenle aynı hacimde kloroform ve eşit hacimde fosfat tamponu ekleyin. Teflon tüpler 25 °C'deki çalkalayıcıdan çıkarıldıktan sonra, tüpleri 2.500 RPM'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, ışıklar kapatılmış durumda çeker ocakta, Teflon tüpteki süpernatantı uzun tüplerden birine boşaltın. Cam tüpte faz ayrımı görünür olmalıdır. Alt katman, öncelikle kloroform olmak üzere organik çözücü ve lipidleri içerir.

Bu ekstraksiyon işlemi tekrarlanır. Üst fazı (süpernatant), daha önce hazırlanan ikinci tüpe aktarın. Böylece lipidleri topraktan fiziksel olarak iki kez ekstrak etmiş oldunuz.

Çoğu toprak için bu yeterlidir. Tüm uzun sınıf tüplerini Teflon kaplı kapaklarla sıkıca kapatın ve karıştırmak için 10 kez ters çevirin. Fazların gece boyunca yerçekimi ile ayrılmasını sağlayın.

İki fazın tamamen ayrışması için numunelerin gece boyunca rahatsız edilmeden bekletilmesine izin verin. Bunun için numuneleri oda sıcaklığında, karanlık bir dolapta veya alüminyum folyo ile örtülmüş halde tutun. Ekstraktların hafta sonu boyunca ayrışmasına izin verilmesi uygundur.

İkinci gün, lipidlerin izolasyonu. İkinci günde, sulu katman aspire edilir ve çözücü bir vakumlu evaporasyon sistemi ile uzaklaştırılarak lipidler konsantre edilir. Örnekler ayrıca, bir su veya kum banyosuna yerleştirilip hafif bir nitrojen akımı uygulanarak da kurutulabilir.

Tüplerdeki sıvı şu an iyi bir şekilde ayrılmış ve büyük oranda berrak olmalıdır. Eğer öyle değilse veya iki katman arasındaki arayüz özellikle kalınsa, ayrışmanın bir gün daha sürmesine izin verin. Çeker ocakta bir vakum aspiratörü kurun.

Bu, bir Tygon hortumu ve bir Pasteur pipeti ile vakum pompasına bağlanmış yan kollu bir balondur. Pompa çalışırken, sulu fazı balon içine çekmek için pipeti kullanın. Üst tabakayı ve ara yüzü aspire edin.

Bu, yaklaşık olarak yolun 2/3'sine denk gelecektir. Bunu iki ila üç cam tüp setine uygulayın. Üst katman birkaç toprak parçacığı içerebilir.

Mümkünse bunları uzaklaştırın. İkinci ve/veya üçüncü tüp setlerinden elde edilen ekstrakları, dikkatli bir dekantasyonla ilk iki tüpteki ile birleştirin. Dökme işlemi sırasında herhangi bir katı maddenin karışmamasına dikkat edin ve tüpü döndürerek çeperlerini durulayın.

Her örnek için temiz bir pipet kullanın ve bu işlemi geri kalan örnekler için tekrarlayın. Kloroform ekstraktları birleştirilip birkaç dakika bekletildikten sonra sıvının yüzeyini kontrol edin. Genellikle, ince bir kalıntı su tabakası oluşacaktır.

Eğer mevcutsa, devam etmeden önce aspire edin. Kalan su, yağ asidi çift bağlarına saldırabilir, ancak numuneler kurutulurken çok küçük bir miktarı solventlerle birlikte buharlaşmalıdır. Vakum evaporasyon düzeneğini kullanarak tüm numuneleri kurutun.

Tüpleri sıkıca kapatın ve -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın. Üçüncü gün, saponifikasyon ve metilasyon. İlk olarak, su banyolarını açın. Su seviyesini kontrol edin; birinci banyoyu 95 °C'ye, ikinci banyoyu ise 80 °C'ye ayarlayın. Bir re-pipette kullanarak, kurutulmuş lipidlere bir mililitre saponifikasyon reaktifi (Reaktif 1) ekleyin.

Sıkıca kapatın, kısa süreli vorteksleyin ve bir rafa yerleştirin. Bu adım tamamlandığında, tüplerin bulunduğu rafı 95 °C'lik su banyosuna yerleştirin ve beş dakika bekleyin. Tüplerin bulunduğu rafı banyodan çıkarın ve tüplerde sızıntı olup olmadığını kontrol edin.

Bu durum, tüpte köpük gibi yükselen kabarcıklar şeklinde belirtilecektir. Sızıntı yapan tüplerin kapaklarını yeniden sıkın veya değiştirin. Tüpleri su banyosunda 10 dakika daha ısıtmaya devam edin.

Su banyosunun sıcaklık ayarını 80 °C'ye düşürün ve inkübasyona 15 dakika daha devam edin. Tüpleri çıkarın ve rafı bir musluk suyu kabına yerleştirerek soğutun. Buzlu su kullanmayın.

Numuneler soğuduktan sonra, her bir numuneye iki mililitre metilasyon reaktifi (Reagent 2) ekleyin. Tekrar sıkıca kapatın ve beş ila 10 saniye boyunca vorteksleyin. Fazla reaktifler nedeniyle bazen meydana gelebildiği gibi, çözeltide çökelek şeklinde granüler tuzlar görülebilir.

Sırağı 80 °C'lik su banyosuna yerleştirin ve 10 dakika boyunca inkübe edin. Tüp sırağını su banyosundan çıkarın ve soğuması için musluk suyu dolu bir kaba koyun. Soğuma sürecini hızlandırmak için sırağı çalkalayın.

Bir re-pipet kullanarak, fazı ekstrakte etmek için her tüpe 1.25 milliliters heksan ve metil tersiyer bütil eter, Reagent 3 ekleyin. Kapakları sıkıca kapatın ve tüpleri 10 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin. Çalkalama işleminden sonra, fazların ayrılması için tüp rafının 10 dakika boyunca beklemesine izin verin.

Şu anda üst tabaka olan organik fazı, bir pastör pipeti kullanarak kısa bir cam tüpe aktarın. Sıvının büyük kısmını geri kazanmak en iyisidir. Çok küçük miktarlardaki sulu faz, ekstraksiyonu bozmayacaktır.

Reaktif 3 ekleyerek, çalkalayarak, fazların ayrılmasını bekleyerek ve üst fazı aktararak sulu faz ekstraksiyonunu tekrarlayın. Alt fazın durumuna bağlı olarak, toplam üç transfer olacak şekilde bu işlemi bir kez daha tekrarlayabilirsiniz. Kısa tüplerdeki ekstraktlara, sodyum hidroksit seyreltik çözeltisi olan bazik yıkama solüsyonu Reaktif 4'ten 3 milliliter ekleyin.

Deney tüplerinin kapaklarını sıkıca kapatın, 20 ila 30 saniye boyunca vorteksleyin ve ardından 2.000 RPM'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, temiz bir pastör pipeti kullanarak üstteki organik fazı aspire edin ve dört mililitrelik kehribar renkli bir flakona aktarın. Sulu fazdan herhangi bir miktar aspire etmemeye çok dikkat edin.

Bir sonraki adım, çözücüyü bir vakumlu evaporasyon cihazında kuruluk seviyesine gelene kadar uçurmaktır. Dördüncü gün, ekstraktların GC analizi için hazırlanmasıdır. Pipet kullanarak, kurumuş fazı içeren 4 mililitrelik viallerin her birine 100 µL Reagent 3 ekleyin.

Numuneyi vorteksleyin ve ardından 10 dakika boyunca bekletin. İkinci pipetleyiciyi kullanarak, süspansiyon halindeki FAME'leri dikkatlice bir GC şişesine aktarın. Dört mililitrelik şişeye çözücüden bir alikot daha ekleyin ve kısa süreliğine vorteksleyin.

Viyol duvarlarındaki kalıntı FAME'lerin çözünmesini sağlamak için viyolu yuvarlayın. İkinci pipetleyiciyi tekrar kullanarak çözücüyü GC viyolüne aktarın. Viyole üçüncü bir çözücü alikotu ekleyip, vorteksleyip ve GC viyolüne aktararak işlemi tamamlayın.

GC şişesini kapatın ve dondurucuda saklayın. Sızdırmaz GC şişelerini analizden önce dondurucuda muhafaza edin. GC analizi.

Bu sistemi kullanmak için analizin spesifik bir GC kolonu kullanılarak gerçekleştirilmesi gerekir. Gaz kromatografı, pasifize edilmiş cam yün tıkacı bulunan dört milimetre ID'li cam giriş borusu ile donatılmış bir split/splitless giriş sistemine sahiptir. Giriş 250 °C'ye ayarlanmıştır ve sabit basınç modunda çalıştırılmaktadır.

Taşıyıcı gaz olarak hidrojen kullanılır. Detektör destek gazları olarak azot ve havaya ihtiyaç vardır. Bir Agilent Ultra 2 kolonu kullanılır.

Kolon 25 m uzunluğunda, 2 mm iç çapta ve 33 µm sabit faz film kalınlığındadır. Bu kolondaki sabit faz, DB-5 tipi kolon olarak da bilinen %5 fenil, %95 metilpolisiloksandır. Lipid ekstraktlarını analiz etmek için, fırın sıcaklığı 170 °C iken 100:1 split oranında iki µL'lik bir alikvot enjekte edilir. Enjeksiyon sonrası fırın, sıcaklığı dakikada beş derece artacak şekilde 300 °C'ye kadar programlanır ve ardından 12 dakika boyunca sabit tutulur.

MIDI standartı ile bir dizi enjeksiyon yapılır ve sonuçlar, MIDI kılavuzundaki talimatlara göre ayarlamaları yapmak için kullanılır. Bu şekilde kalibre edildikten sonra, sistemin zaman zaman küçük ayarlamalara ihtiyacı olabilir, ancak genellikle bu parametreleri kullanarak iyi sonuçlar vermelidir. MIDI sistemi, her örnek için, gerçekleşen her pik başına bir satır içeren bir tabloya sahip bir rapor oluşturur.

Yazılım; pik tutunma süresini, pik alanını, pik tanımlamasını, ayrıca pik tanımlaması için kullanılan bir parametre olan ECL'yi (tahmini zincir uzunluğu) ve tutunma süresine göre varyasyonları ve dedektör yanıtını normalize etmek için kullanılan bir parametre olan yanıt faktörünü raporlar. ECL, bir dizi düz zincirli FAME'ler arasında her bir bilinmeyen FAME'nin nerede elüye olduğunu ifade eder. Örneğin, bilinmeyen bir maddenin tutunma süresi 12 ve 13 karbonlu zincirlerin tam ortasında elüye oluyorsa, ECL 12,5 karbonlu zincir olarak rapor edilir.

Yazılım, her bir pikin ECL değerini bir veri tabanındaki FAME'lerin değerleri ile karşılaştırır ve eşleşme olduğunda bilinmeyene ilgili ismi atar. Veri tabanındaki iki FAME'in ECL değerlerinin birbirine çok yakın olduğu durumlarda, yazılım en yakın olanı önce listeleyerek her iki ismi de bildirir. Raporlardaki veri tabloları bir elektronik tabloya veya veri tabanına derlenebilir.

Yanıt faktörüne göre ayarlama yapıldıktan sonra, ekstraktın konsantrasyonuna ulaşmak için pik alanları, bir dış veya iç standartın pik alanı ile karşılaştırılabilir. Ekstraksiyonu yapılan toprak kütlesine bölünerek, veriler gram toprak başına FAME kütlesi olarak veya her bir FAME'in moleküler ağırlığı da kullanılarak gram toprak başına nanomol cinsinden ifade edilebilir. Ardından, biyobelirteç FAME'ler toplanarak mikrobiyal loncaların biyokütlesi elde edilebilir ve bu loncalar daha ayrıntılı şekilde analiz edilebilir.

Örneğin, burada gübrelenmiş çayırlardan daha fazla FAME biyokütlesine sahip gübrelenmemiş çayırları görüyoruz. Her ikisi de yakındaki mısır tarlalarından daha fazla biyokütleye sahiptir. Ayrıca, FAME'ler mantarlar veya bakteriler gibi belirli fonksiyonel gruplarla ilişkilidir.

Bu ilişkiler ekosisteme özgüdür, bu nedenle bunları aşırı genellememe dikkat etmek önemlidir. Bu analiz türü, belirli grupların belirli ortamlarda daha bol olup olmadığını gösterir. Burada mantarlar, gübrelenmemiş çayırda mısır tarlasına kıyasla daha boldur.

Ve son olarak, genel mikrobiyal topluluk kompozisyonuna bakmanın bir başka yolu, nonmetrik çok boyutlu ölçekleme (NMDS) veya temel bileşenler analizi (PCA) gibi ordinasyon yöntemlerini kullanarak tüm FAME'lerin göreceli bolluklarını aynı anda karşılaştırmaktır. Bir ordinasyonda, birbirine daha benzer olan mikrobiyal topluluklar birbirine daha yakın konumlanır. Bu nedenle, örnek verilerimize bakıldığında; mısır ve gübrelemesiz çayır örnekleri birbirinden çok uzaktayken, bazı gübrelemeli çayır örneklerinin mikrobiyal toplulukları mısır örneklerine, diğerleri ise gübrelemesiz çayır örneklerine benzemektedir.

Mikrobiyal topluluklar, aynı ortam içerisinde bile genellikle yüksek değişkenlik gösterirler, bu nedenle her zaman net bir şekilde ayrılmazlar. Bu videoyu izledikten sonra, mikroorganizmaların hücre membranlarından gelen lipid biyobelirteçlerin topraktan nasıl ekstrakte edildiği sürecine dair iyi bir anlayışa sahip olunmalıdır. Fosfolipid yağ asitlerinin ekstraksiyonu, benzersiz mikrobiyal biyobelirteçlerin tanımlanması yoluyla mikrobiyal loncaların ve toplam mikrobiyal biyokütlenin değerlendirilmesi için etkili, hızlı ve düşük maliyetli bir yöntemdir.