Name: Tek Bir Numuneden Metabolitlerin, Lipidlerin ve Proteinlerin Kapsamlı Analizi için Basit Fraksiyonlu Ekstraksiyon Metodu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Öğrenin, tek bir numuneden lipid, metabolit ve protein çıkarmak için metil-tert-bütil eter ekstraksiyon yöntemini. Arabidopsis yaprak dokusunda çoklu bileşik sınıflarının analizi için sistem biyolojisi araştırmalarına temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MS, GERLS-DAAD programından tam bir doktora bursu ile desteklenmektedir. Makale üzerindeki kanıtı okumak ve yorumlamak için Dr. Andrew Wiszniewski&#39;ye teşekkür etmek istiyoruz. Yardımları için Almanya&#39;nın Golm şehrindeki Max-Planck Moleküler Bitki Fizyolojisi Enstitüsündeki Giavalisco laboratuvarının tüm üyelerine çok minnettarız.

Dikkat : Ekstraksiyon esnasında kullanılan metanol (MeOH) ve metil tert -butil eter (MTBE) yanıcıdır ve uzun süreli maruz kalma ve / veya temas durumunda solunum, göz veya cilt tahrişine sahip olabilir. Lütfen bunları dikkatli bir şekilde davlumbazda tutun ve özümleme işlemi sırasında uygun güvenlik önlemlerini (laboratuar önlüğü, güvenlik gözlüğü, eldiven vb. ) Kullanın. Bu protokolün birkaç adımında kullanılan sıvı nitrojen ve kuru buz, cilt ile uzun süre temas ederse ciddi yanıklara neden olabilir. Lütfen koruyucu eldiven ve gözlük takarak onları dikkatli bir şekilde tutun. Kullanıcılar, bazıları zehirli olabilecek numune analizi için farklı kimyasallar, reaktifler veya dahili standartlar kullanabilirler. Kullanılan tüm kimyasal maddeler için ilgili kimyasal güvenlik bilgi formlarını inceleyiniz. 1. Biyolojik Örneklerin Toplanması ve Toplanması <ol><li> Etiketli hasat tüpleri hazırlayın. NOT: Burada, etiketli, 2 mL, yuvarlak tabanlı, güvenli lokta biyolojik numuneler hasat edilirK mikrosantrifüj tüpleri, doku homojenleştirici için iki adet 5 mm çaplı metal top içerir. </li><li> Dolu bir sıvı azot dewar&#39;ı hazırlayın. </li><li> Biyolojik numuneyi toplayın ve dokuyu sıvı nitrojende dondurun. Yaralanmadan kaynaklanan metabolik değişiklikleri önlemek için bu adımı birkaç saniye içinde olabildiğince çabuk yapın. Not: Gösteri amaçlı olarak, uzun gün koşulları altında toprakta yetiştirilen 30 günlük yabani tip Arabidopsis thaliana (Col-0) rozet yaprağı kullanın. </li><li> Hasat edilen numuneleri kısa süreli molalar için kuru buzda tutun veya daha uzun süre -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 2. Öğütme ve Doku Kesintisi <ol><li> Doku homojenleştiricisinin tüp tutucularını sıvı azot içinde en az 10 dakika önceden soğutun. Bir doku homojenleştirici yoksa, temiz ve önceden soğutulmuş harç ve havlu kullanın. </li><li> Sıvı azot, kuru buz veya -80 ° C dondurucudan numuneleri alın ve bunları ön soğutmalıTüp tutucuları. </li><li> Boru tutucularını doku homojenleştiricisine çabucak koyun. </li><li> Biyolojik materyali ince ve homojen bir toz haline getirin. Yapraklar için 1 dakika 20 Hz kullanın. Not; Homojenizasyon zamanı ve hızı dokuya bağlı olarak değişebilir, numunenin ince bir toz haline homojen hale getirildiğinden ve bu tozun homojenizasyonun her adımında dondurulduğundan emin olun. </li><li> Biyolojik örnekleri tüp tutucularından alın ve daha ileri çıkana kadar dondurun. </li></ol> 3. Dokuların tartılması <ol><li> Gerekli örnek miktarları için yeterli hassasiyette analitik bir denge kullanın. </li><li> Etiketli 2 mL&#39;lik yuvarlak tabanlı emniyetli mikro santrifüj tüpünü hazırlayın. </li><li> Tüpleri ve spatulaları sıvı nitrojende önceden soğutun. </li><li> Gerekli miktarda doku tozu 2 mL güvenli kilit mikrosantrifüj tüpüne bölün. Dikkat: Bitki materyalinin çözündürülmesini önlemek için wÖrnekleri okuyun. </li><li> Ölçülen numuneleri, sıvı nitrojene tartıldıktan hemen sonra gönderin. </li><li> Her bir numune için kesin ağırlığı kaydedin. Çoğu bitki dokusu için 10-50 mg ±% 10 kullanın. </li><li> Ayrılmış örnekleri -80 ° C&#39;de daha fazla ekstraksiyona kadar saklayın. </li></ol> 4. Reaktif Ayarları <ol><li> Metil tert -butil eter (MTBE) / metanol (MeOH) ekstraksiyon karışımı kullanın. <ol><li> 100 mL ekstraksiyon solventi hazırlamak için, MTBE: MeOH (3: 1, hacim / hacim) karışımı elde etmek için 75 mL MTBE&#39;yi 25 mL MeOH&#39;a ilave edin. </li><li> Analitik ihtiyaçlara göre post analizi normalleştirme için dahili standartlar ekleyin. Tipik olarak, 50 uL 1,2-diheptadekanoil- sn -glisero-3-fosfokolin (kloroformda 1 mg / mL), UPLC-MS temelli lipid analizi için bir dahili standart olarak ilave edilirken, 50 uL 13 C sorbitol 1 mg / mL su içinde), GC-MS bazlı primer analiz için dahili standartlar olarakmetabolitleri. UPLC-MS&#39;e dayalı metabolit analizi için dahili standartlar, 50 μL kortikosteron (metanolde 1 mg / mL) ve 25 μL ampisilin (metanolde 1 mg / mL )&#39;dir. </li><li> Çözücüyü, MTBE: MeOH karışımı ile durulanmış temiz bir cam şişeye aktarın. </li><li> Ekstraksiyon karışımını 4 ° C&#39;de 1 haftaya kadar saklayın. NOT: Yeniden üretilebilir sonuçların korunması için ekstraksiyon karışımını daha uzun süre muhafaza etmeyin. </li></ol></li><li> Faz ayrımını başlatmak için su (H2O) / metanol (MeOH) kullanın. <ol><li> 100 mL H20: MeOH hazırlamak için, H20: MeOH (3: 1, hacim / hacim) yapmak için 25 mL MeOH&#39;ye 75 mL H20 ilave edilir. </li><li> Çözücüyü, H20: MeOH karışımı ile durulanmış temiz bir cam şişeye aktarın. Bu çözücü oda sıcaklığında birkaç hafta saklanabilir. </li></ol></li></ol> 5. Örneklerin Çıkarılması <ol><li> Ekstraksiyon ön-soğutmalı mSıvı soğutma sistemi veya -20 ° C dondurucu kullanarak -20 ° C&#39;ye soğutulur (MTBE: MeOH, 3: 1, hac / hac). </li><li> Aliquoted örnekleri teker teker alın ve her örnek tüpüne önceden soğutulmuş ekstraksiyon karışımı 1 mL ekleyin. Dikkat: MTBE&#39;nin düşük viskozitesi nedeniyle bu adımı hızlı bir şekilde uygulayın. </li><li> Doku, ekstraksiyon karışımı içinde iyi homojen olana kadar hemen bir vorteks mikseri üzerinde karıştırın. NOT: Proteinlerin çökeltilmesi ve enzimatik faaliyetlerinin inaktive edilmesi nedeniyle bu adım çok önemlidir. </li><li> Bütün numuneleri bir yörünge çubuğu üzerindeki 100 rpm&#39;de 45 ° C&#39;de 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Numuneleri, buzla soğutmalı bir sonikasyon banyosunda 15 dakika sonikasyon yapın. </li></ol> 6. Faz Ayırımı ile Fraksiyonasyon <ol><li> Her numune tüpüne 650 uL H20: MeOH (3: 1, hacim / hacim) ilave edin. </li><li> 1 dakika vortekslenerek iyice karıştırın. </li><li> Numuneleri 4 ° C&#39;de 5 dakika süreyle 20.000 x g hızında santrifüjleyin. NOT: Bu adımdan sonra, tüpün tabanında katı bir pelet olan iki karışmaz sıvı faz bulunmaktadır. Dikkat: İki sıvı fazın karışmasını önlemek için tüpleri dikkatle tutun ve çökelen pelletin bozulmasını önleyin. </li></ol> 7. Kutupsal ve Hidrofobik Kesirlerin Ayırımı <ol><li> Solüsyonun 500 μL&#39;sini lipit içeren üst fazdan etiketli bir 1.5 mL&#39;lik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. NOT: Aliquoted lipid örnekleri doğrudan UPLC-MS analizi (adım 8.1) için konsantre edilebilir veya -80 ° C&#39;de birkaç hafta saklanabilir. </li><li> Örnekten 500 μL alındığında, 200 μL&#39;lik bir pipet kullanarak kalan lipid fazını çıkarın. </li><li> Alt fazdan (polar ve yarı polar metabolitler) 400 μL solventi etiketli bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Aliquoted kutup örnekleri hemen UPLC-MS analiz (adım 8.2) için doğrudan konsantre edilebilir veya-80 ° C&#39;de birkaç hafta. </li><li> İlave analiz yapmak için 200 uL&#39;lik ek bir örnek alınız, örn. Kosmetik olarak tanımlanan gaz kromatografisine dayalı metabolit analizi 16 . </li><li> Aşırı miktarı pipetle atarak sulu fazın kalan kısmını çıkarın. </li><li> Elde edilen protein, nişasta, hücre duvarı pelletini 1 dakika süreyle vorteksleyerek 500 μL metanol ile yıkayın. </li><li> Örnekleri 10,000 x g hızında 4 ° C&#39;de 5 dakika santrifüjleyin. </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi 16 protein ekstraksiyonu ve sindirim (adım 11) veya nişasta / hücre duvar analizi yapın. NOT: Hemen kullanılmazsa, bu topaklar -80 ° C&#39;de birkaç hafta saklanabilir. </li></ol> 8. Fraksiyonların Konsantrasyonu ve Depolanması <ol><li> Çözücüyü lipid örneklerinden (basamak 7.1&#39;den) ya ısıtmadan ısıtın (1-2 saat boyunca) bir vakum konsantratörde buharlaştırın ya da tercihen bir nitrLipidlerin oksidatif modifikasyonlarını önlemek için ojen akış buharlaştırıcısı. NOT: Kurutulmuş numuneler derhal analiz edilmelidir. Depolama için örnekleri MTBE çözeltisi içinde, ideal olarak cam şişelerde bırakın (adım 7.1). </li><li> Çözücüyü sulu numunelerden (adım 7.3 veya 7.4&#39;ten) bir gece boyunca bir vakum konsantratöründe ısıtmadan ısıtın. NOT: Kurutulmuş numuneler, analizden önce birkaç hafta boyunca -80 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 9. Lipidlerin UPLC-MS 24 ile Analizi <ol><li> 400 μL asetonitril: 2-propanol (7: 3, hacim / hacim) içinde kurutulmuş lipid fraksiyonlarını (adım 8.1&#39;den) tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Cam şişelere yeterli miktarda sıvı aktarın ve sıkıca kapatın. </li><li> Cam şişeleri soğutmalı bir otomatik örnekleyiciye (4 ° C) yerleştirin. </li><li> Örnek başına 2 μL enjekte edin ve 400 μL / dak&#39;lık bir akış hızında çalışan bir UPLC sistemi kullanılarak 60 ° C&#39;de tutulan bir Reversed Phase (RP) C8 sütunundaki lipidleri ayırın. </li><li> Cep telefonunu kullanKromatografik ayırma için Tablo l&#39; de açıklanan safhalar. </li><li> 150 ve 1,500 m / z arasındaki kütle aralığını kapsayan uygun bir MS enstrümanı kullanarak pozitif ve negatif iyonizasyon modunda kitle spektrumlarını elde edin. </li></ol> 10. Kutupsal ve Yarı Kutuplu Metabolitlerin UPLC-MS 25 ile Analizi. <ol><li> 200 μL UPLC dereceli metanol: su (1: 1, hacim / hacim) içinde kutup fazını tekrar tekrar askıya alın (basamak 8.2&#39;den itibaren). </li><li> Cam şişelere yeterli miktarda sıvı aktarın ve sıkıca kapatın. </li><li> Cam şişeleri soğutmalı bir otomatik örnekleyiciye (4 ° C) yerleştirin. </li><li> Her bir örnekten 2 μL enjekte edin ve 400 μL / dak&#39;lık bir akış hızında çalışan bir UPLC sistemi kullanarak 40 ° C&#39;de tutulan bir RP C 18 sütunundaki metabolitleri ayırın. </li><li> Tablo 2&#39;de verilen parametrelerle mobil fazları kromatografik ayırma için kullanın. </li><li> Pozitif ve negatif iyonizasyon modunda tam tarama kütle spektrumu elde edin50 ila 1,500 m / z arasında bir kütle aralığını kapsayan uygun bir kütle spektrometresi. </li></ol> 11. Protein Ekstraksiyonu, Sindirim ve Analiz 16 <ol><li> Seçilen protein ekstraksiyon tamponunun 200 μL&#39;sinde yıkanmış protein / nişasta / hücre duvarı pelletini (adım 7.8&#39;den) yeniden askıya alın. Not: Üre / tiyoüre tamponu (5 M üre, 2 mM tiyoüre, 15 mM DTT,% 2 CHAPS ve proteaz ve fosfataz inhibitörleri) 27&#39;yi kullanırız. </li><li> Numuneleri, buzla soğutulmuş sonik bir banyoda 10 dakika Sonikasyon yapın. </li><li> Örnekleri, oda sıcaklığında bir yörünge çubuğu (100 rpm) üzerinde 30 dakika inkübe edin. </li><li> Çözünmüş proteinleri 10,000 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Yeni bir tüp içinde protein süpernatantı toplayın. </li><li> Toplanan süpernatandan protein konsantrasyonunu belirleyin 28 . </li><li> Seçilen bir protokolle 50 μg protein in-solüsyonu sindirin. Tipik olarak, Trypsin / Lys-C mix accordiKullanım kılavuzuna bakın. </li><li> Sindirimden sonra, C18 aşamalı ipuçları kullanarak kütle spektrometrisinden önce peptidlerin tuzdan arındırılması gerçekleştirilir ve sindirilmiş peptitler 29 alınır. </li><li> Numuneleri, bir vakum konsantratöründe ısıtmaya gerek kalmadan yaklaşık kurumaya konsantre edin. </li><li> Numuneleri uygun yükleme tamponuna (örn.% 5 asetonitril,% 0.5 formik asit) yeniden askıya alın ve nano LC sistemine bağlı yüksek çözünürlüklü bir kütle spektrometresi kullanarak LC-MS / MS ile peptit karışımlarını analiz edin. NOT: Bu protokolde sunulan örnek proteomik veri setinde, Tablo 3&#39;te açıklandığı gibi bir gradyan kullanılmıştır. </li><li> Bir tam tarama (FS) ardından 15&#39;e kadar veri bağımlılığı olan MS / MS taramasının ardından aşağıdaki parametrelere kadar bir üst 15 strateji kullanarak kütle spektrometresini ayarlayın: FS, 200-2000 m / z&#39;lik kütle aralığındaydı 3x10 6 iyon hedef değeri ile 70.000 çözünürlük. Yüksek bağımlılıklara göre veriye bağlı MS / MS taramalarını elde edinÇarpışma ayrışması (HCD). MS / MS için hedef değerleri, maksimal iyon doldurma süresi 50 ms, bir izolasyon penceresi 4.0 m / z, normalleştirilmiş çarpışma enerjisi (NCE)% 30 ve bir doluluk oranı 1% ile 1e 5 iyonlara ayarlayın. MS / MS iyonlarını 17.500&#39;lük bir çözünürlükte ölçün ve dinamik dışlama 60 saniyeye ayarlandı. </li></ol>

<ol><li>Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+description+of+membrane+current+and+its+application+to+conduction+and+excitation+in+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve.</a> J Physiol. 117 (4), 500-544 (1952).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Yang, M. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+genomics+and+systems+biology+research+lead+to+systems+genomics+studies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The emerging genomics and systems biology research lead to systems genomics studies.</a> BMC Genomics. 15, Suppl 11 1(2014).</li>
<li>Sheth, B. P., Thaker, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+systems+biology%3A+insights%2C+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Plant systems biology: insights, advances and challenges.</a> Planta. 240 (1), 33-54 (2014).</li>
<li>Ideker, T., Galitski, T., Hood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+decoding+life%3A+Systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genom+Hum+G%22%5BJournal%5D)">A new approach to decoding life: Systems biology.</a> Annu Rev Genom Hum G. 2, 343-372 (2001).</li>
<li>Somvanshi, P. R., Venkatesh, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conceptual+review+on+systems+biology+in+health+and+diseases%3A+from+biological+networks+to+modern+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Syst+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">A conceptual review on systems biology in health and diseases: from biological networks to modern therapeutics.</a> Syst Synth Biol. 8 (1), 99-116 (2014).</li>
<li>Oliver, S. G., Winson, M. K., Kell, D. B., Baganz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the yeast genome.</a> Trends Biotechnol. 16 (9), 373-378 (1998).</li>
<li>Tweeddale, H., Notley-McRobb, L., Ferenci, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+slow+growth+on+metabolism+of+Escherichia+coli%2C+as+revealed+by+global+metabolite+pool+%28%22metabolome%22%29+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Effect of slow growth on metabolism of Escherichia coli, as revealed by global metabolite pool ("metabolome") analysis.</a> J Bacteriol. 180 (19), 5109-5116 (1998).</li>
<li>Kim, H. K., Verpoorte, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+for+plant+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemical+analysis+%3A+PCA%22%5BJournal%5D)">Sample preparation for plant metabolomics.</a> Phytochemical analysis : PCA. 21 (1), 4-13 (2010).</li>
<li>Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Method+for+the+Isolation+and+Purification+of+Total+Lipides+from+Animal+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A Simple Method for the Isolation and Purification of Total Lipides from Animal Tissues.</a> J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).</li>
<li>Weckwerth, W., Wenzel, K., Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+for+the+integrated+extraction%2C+identification+and+quantification+of+metabolites%2C+proteins+and+RNA+to+reveal+their+co-regulation+in+biochemical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Process for the integrated extraction, identification and quantification of metabolites, proteins and RNA to reveal their co-regulation in biochemical networks.</a> Proteomics. 4 (1), 78-83 (2004).</li>
<li>Wienkoop, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+metabolomic+and+proteomic+phenotypes%3A+analysis+of+data+covariance+dissects+starch+and+RFO+metabolism+from+low+and+high+temperature+compensation+response+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Integration of metabolomic and proteomic phenotypes: analysis of data covariance dissects starch and RFO metabolism from low and high temperature compensation response in Arabidopsis thaliana.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (9), 1725-1736 (2008).</li>
<li>Valledor, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+protocol+for+the+combined+isolation+of+metabolites%2C+DNA%2C+long+RNAs%2C+small+RNAs%2C+and+proteins+from+plants+and+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A universal protocol for the combined isolation of metabolites, DNA, long RNAs, small RNAs, and proteins from plants and microorganisms.</a> Plant J. 79 (1), 173-180 (2014).</li>
<li>Nakayasu, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPLEx%3A+a+Robust+and+Universal+Protocol+for+Single-Sample+Integrative+Proteomic%2C+Metabolomic%2C+and+Lipidomic+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses.</a> mSystems. 1 (3), (2016).</li>
<li>Alfonsi, K., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2008/GC/b711717e#!divAbstract">Green chemistry tools to influence a medicinal chemistry and research chemistry based organisation.</a> Green Chem. 10 (1), 31-36 (2008).</li>
<li>Salem, M. A., Juppner, J., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+a+fast%2C+comprehensive+and+reproducible+one-step+extraction+method+for+the+rapid+preparation+of+polar+and+semi-polar+metabolites%2C+lipids%2C+proteins%2C+starch+and+cell+wall+polymers+from+a+single+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: a fast, comprehensive and reproducible one-step extraction method for the rapid preparation of polar and semi-polar metabolites, lipids, proteins, starch and cell wall polymers from a single sample.</a> Plant Methods. 12, 45(2016).</li>
<li>Hemme, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-wide+analysis+of+acclimation+responses+to+long-term+heat+stress+and+recovery+in+the+photosynthetic+model+organism+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Systems-wide analysis of acclimation responses to long-term heat stress and recovery in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Cell. 26 (11), 4270-4297 (2014).</li>
<li>Sharma, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s10811-014-0407-2">UPLC-MS analysis of Chlamydomonas reinhardtii and Scenedesmus obliquus lipid extracts and their possible metabolic roles.</a> J Appl Phycol. 27 (3), 1149-1159 (2015).</li>
<li>Delgado, R., Munoz, Y., Pena-Cortes, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diacylglycerol+activates+the+light-dependent+channel+TRP+in+the+photosensitive+microvilli+of+Drosophila+melanogaster+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors.</a> J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).</li>
<li>Bozek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+evolution+of+brain+lipidome+revealed+by+large-scale+analysis+of+human%2C+chimpanzee%2C+macaque%2C+and+mouse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Organization and evolution of brain lipidome revealed by large-scale analysis of human, chimpanzee, macaque, and mouse tissues.</a> Neuron. 85 (4), 695-702 (2015).</li>
<li>Khrameeva, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neanderthal+ancestry+drives+evolution+of+lipid+catabolism+in+contemporary+Europeans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Neanderthal ancestry drives evolution of lipid catabolism in contemporary Europeans.</a> Nat Commun. 5, 3584(2014).</li>
<li>Bozek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exceptional+evolutionary+divergence+of+human+muscle+and+brain+metabolomes+parallels+human+cognitive+and+physical+uniqueness%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Exceptional evolutionary divergence of human muscle and brain metabolomes parallels human cognitive and physical uniqueness.</a> PLoS Biol. 12 (5), 1001871(2014).</li>
<li>Krueger, S., Steinhauser, D., Lisec, J., Giavalisco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+subcellular+metabolite+distributions+within+Arabidopsis+thaliana+leaf+tissue%3A+a+primer+for+subcellular+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of subcellular metabolite distributions within Arabidopsis thaliana leaf tissue: a primer for subcellular metabolomics.</a> Methods Mol Biol. 1062, 575-596 (2014).</li>
<li>Hummel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+performance+liquid+chromatography+and+high+resolution+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+plant+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22FrontPlant+Sci%22%5BJournal%5D)">Ultra performance liquid chromatography and high resolution mass spectrometry for the analysis of plant lipids.</a> FrontPlant Sci. 2, 54(2011).</li>
<li>Giavalisco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+formula+annotation+of+polar+and+lipophilic+metabolites+using+%2813%29+C%2C+%2815%29+N+and+%2834%29+S+isotope+labelling%2C+in+combination+with+high-resolution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using (13) C, (15) N and (34) S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry.</a> Plant J. 68 (2), 364-376 (2011).</li>
<li>Caldana, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+analysis+of+inducible+target+of+rapamycin+mutants+reveal+a+general+metabolic+switch+controlling+growth+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 73 (6), 897-909 (2013).</li>
<li>Giavalisco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+Arabidopsis+thaliana+by+two-dimensional+gel+electrophoresis+and+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionisation-time+of+flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of Arabidopsis thaliana by two-dimensional gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry.</a> Proteomics. 5 (7), 1902-1913 (2005).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
<li>Spagou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+chromatography+coupled+to+MS+for+metabonomic%2Fmetabolomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sep+Sci%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction chromatography coupled to MS for metabonomic/metabolomic studies.</a> J Sep Sci. 33 (6-7), 716-727 (2010).</li>
<li>Hauck, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uric+acid+accumulation+in+an+Arabidopsis+urate+oxidase+mutant+impairs+seedling+establishment+by+blocking+peroxisome+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance.</a> Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).</li>
<li>Avin-Wittenberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+the+role+of+autophagy+in+cellular+metabolism+and+energy+homeostasis+in+Arabidopsis+seedlings+under+carbon+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in Arabidopsis seedlings under carbon starvation.</a> Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).</li>
<li>Watanabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+dissection+of+spatiotemporal+metabolic+shifts+in+primary%2C+secondary%2C+and+lipid+metabolism+during+developmental+senescence+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive dissection of spatiotemporal metabolic shifts in primary, secondary, and lipid metabolism during developmental senescence in Arabidopsis.</a> Plant physiol. 162 (3), 1290-1310 (2013).</li>
<li>Lambers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteaceae+from+severely+phosphorus-impoverished+soils+extensively+replace+phospholipids+with+galactolipids+and+sulfolipids+during+leaf+development+to+achieve+a+high+photosynthetic+phosphorus-use-efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Proteaceae from severely phosphorus-impoverished soils extensively replace phospholipids with galactolipids and sulfolipids during leaf development to achieve a high photosynthetic phosphorus-use-efficiency.</a> New Phytol. 196 (4), 1098-1108 (2012).</li>
<li>Degenkolbe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+remodeling+of+the+lipidome+during+cold+acclimation+in+natural+accessions+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Differential remodeling of the lipidome during cold acclimation in natural accessions of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 70, 972-982 (2012).</li>
<li>Bromke, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+chromatography+high-resolution+mass+spectrometry+for+fatty+acid+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry for fatty acid profiling.</a> Plant J. 81 (3), 529-536 (2015).</li>
<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAX1%2C+a+novel+membrane+protein+mediating+plastid+fatty+acid+export%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">FAX1, a novel membrane protein mediating plastid fatty acid export.</a> PLoS Biol. 13 (2), 1002053(2015).</li>
<li>Kueger, S., Steinhauser, D., Willmitzer, L., Giavalisco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+plant+metabolomics%3A+from+mass+spectral+features+to+metabolites+and+from+whole-cell+analysis+to+subcellular+metabolite+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">High-resolution plant metabolomics: from mass spectral features to metabolites and from whole-cell analysis to subcellular metabolite distributions.</a> Plant J. 70 (1), 39-50 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok

Bu yazıda, tek bir 50 mg yaprak örneğinden kapsamlı lipidomik, metabolomik ve proteomik analiz için basit ve son derece uygulanabilir bir ekstraksiyon protokolü anlatılıyor ve gösteriliyoruz. Yöntem, çeşitli makalelerde 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37&#39;de yayınlanan çeşitli çalışmalarda daha önce kullanılmıştır Ve kanıtladı, düz ileri yanı sıraIş akışı ve yüksek uygulanabilirlik özelliklerinin sağlam ve tekrarlanabilir olması. Burada verilen uygulamalar karmaşık biyolojik bir numunenin başlangıç ​​taraması için bazı rutin yöntemler göstermektedir. Bu gösterilen büyük ölçekli metabolomik ve lipidomik veri setleri, analiz edilen biyolojik sistemin metabolizmasındaki geniş veya spesifik değişiklikler hakkında kapsamlı bilgi sağlayabilirken, proteinlerin analizinden elde edilen veriler, nicel (bolluk) ve nitel (modifikasyonlar ) Hücresel fonksiyonları ve makinaları kontrol eden enzimlerin, yapısal proteinlerin veya transkripsiyon faktörlerinin (TF&#39;ler) değişimi. Buna göre, bütünleyici omik veri, spesifik metabolik yollar veya hücresel süreçlerle ilişkili çeşitli moleküllerin moleküler değişimlerini aydınlatarak, biyolojik bir sistemin genetik veya biyotik ve / veya abiyotik bozulmalarının yol açtığı olası değişiklikler hakkında ilk bilgileri ortaya koyma potansiyeline sahiptir. Tabii ki, Başarılı bir sistem biyolojisi analizi için uzun vadede, analiz edilmiş ve açıklanan moleküler varlıkların sayısını en üst düzeye çıkarmak, hücresel işlevleri ve etkinlikleri mümkün olduğunca izlemek için oldukça şarttır. Bu amaçla, elde edilen fraksiyonlar, ilave bileşikleri veya bileşik sınıfları hedefleyen çeşitli analitik yöntemlere ilave olarak uygulanabilir ( Şekil 4 ). Bunu söyleyince, elde edilen verilerin küresel analiz stratejisinin iki farklı stratejiyle takip edilebileceği belirtilmelidir: Bir yandan bilinen bileşimlerin nicelenmesi ile hücresel işlevlerin aydınlatılmasına vurgu yapıyoruz. Öte yandan, ölçülen metabolitlerin ve lipidlerin birçoğu henüz bilinmiyor veya ek açıklanmıyor. Bu henüz açıklanmayan bileşik ölçümler, aynı zamanda, istatistiksel yöntemlerle sınıflandırma veya ayrımcılık için kullanılabilen, bol miktarda anlamlı bilgi içermektedir. BEtween gruplar veya tedaviler 20 , 21 , 22 . Yine de, bu bilinmeyen bileşikler, özellikle de grup sınıflamasıyla veya biyolojik belirteç olarak hizmet eden bileşikler tanımlanmalıdır. Bu tanımlama işlemi ne yazık ki oldukça sıkıcıdır ve ilave analitik ölçümler veya stratejiler olmadan başarılamaz.38 Şekil 4&#39;te görüldüğü gibi, açıklanmayan bileşikler sayısı oldukça fazladır (aslında büyük çoğunluk). Bununla birlikte, yukarıda belirtildiği gibi, bu kromatografik tepeler veri analizi kapsamında ele alınabilir ve bu nedenle önemli ölçüde etkilenen varlıklar aydınlatılabilir ve başka tanımlama stratejilerine tabi tutulabilir. Özetle, burada sunulan protokolün deneysel sistemler biyolojisinin yanı sıra klasik istatistiksel uygulama için birçok avantaj sağladığı sonucuna varabilirizations. Birincisi, tüm fraksiyonlar tek bir numuneden çıkarıldığından, farklı deneysel veri setleri (lipidler, metabolitler, proteinler) arasındaki varyasyon, her veri seti aynı numune alikotundan türetildiğinden önemli ölçüde azaltılır. Bu açıkça, elde edilen sonuçların karşılaştırılabilirliğinin artmasına yol açmaktadır. İkincisi, yöntem kolaylıkla ölçeklendirilebilir ve bu nedenle, küçükten büyük numune miktarlarıyla son derece uyumlu hale getiriyor. Düzenli olarak 10-100 mg doku örnekleri kullanıyoruz, ancak başarıyla gerçekleştirilen lipidomik çalışmalar, az 20 Arabidopsis tohumunda gerçekleştirildi 31 . Özellikle küçük numune miktarlarıyla uyumluluk, sınırlı miktarda biyolojik doku veya numune varsa bu yöntemi uygun kılar. Yine de, yeterli numune materyali mevcut olsa bile, burada sunulan metot, bu numuneleri, u yerine çok sayıda deneysel kopyada kullanmak için avantaj sağlamaktadırFarklı çıkarma prosedürleri için onları söyle. Bu, daha iyi ve rafine edilmiş istatistiksel veri analizine olanak tanır. Üçüncüsü, bu yöntem kutupsal ve polar olmayan moleküllerin sıvı-sıvı fraksiyonlamaya dayandığı için, basit tek fazlı özütleme yöntemlerinin ( örn., Metanol ekstraksiyonları) aksine, prosedürde önemli bir de-kompleksleştirme basamağı sağlar. Bu etkin örnek de-komplike etme, kimyasal olarak birbirine karışan moleküllerin birbirlerinden ayrılmasından ötürü, ayrı fraksiyonların kısmen saflaştırılmasına yol açar. Buna göre, kimyasal ayırma işlemi, ayıklanan numunelerin sistematik olarak farklı kimyasal sınıflara ayrılması için pratik bir avantaj sağlamakla kalmayıp aynı zamanda, kirletici bileşikleri farklı fraksiyonlardan uzaklaştırdığı için bireysel analitik ölçümleri de geliştirir. Açıkçası, özellikle organik faza bölünmüş ve çoğunlukla olumsuz olarak etkileyen lipidlerinPolar bileşiklerin kromatografik analizi, polar fraksiyonda neredeyse tamamen yok olacaktır. Aynı şey kutupsal bileşiklerden yoksun olacak olan hidrofobik lipidlerin analizi için de geçerlidir. Polar ve nonpolar bileşiklerin birbirlerinden arındırılmasının yanı sıra protein, nişasta ve hücre duvar analizi için kullanılabilecek ayrı bir fraksiyon sağlamakla kalmayıp aynı zamanda protein ve diğer makro molekülleri de örnekten tüketiriz. Bireysel fraksiyonlarda daha temiz bir numuneye yol açar. Bilhassa, büyük makromoleküllerin varlığının, analitik kolonların hasar görmesine veya en azından daha kısa bir ömrüne neden olduğu biliniyorsa, bu özellikle önemlidir. Daha az tehlikeli ve daha elverişli olan kloroform replasman solventi 15&#39;e dayanan tarif edilen MTBE ekstraksiyon yöntemi, grubumuzdan birkaç çalışma ile gösterilmiş olup, yaygın olarak applBitkiler 16 , algler 17 , 18 , sinekler 19&#39;dan farklı biyolojik numuneler için buzlanabilirlik, aynı zamanda birkaç memeli doku, organ veya hücre 20 , 21 , 22 .

Geçen yüzyılın ortalarında ortaya çıkan ve genomik ve transkriptomik veri setleri 2 , 3&#39;ün geniş ölçekli analizi ile geliştirilen sistem biyolojisi, kompleks biyolojik sistemlerin analizi için yeni ve vazgeçilmez bir yaklaşım haline geldi 4 , 5 . Sistem biyolojisinin temel amacı, biyolojik sistemlerde bileşen etkileşimlerini ve bağımlılıklarını deşifre etmek ve genotipler arasındaki bağlantıyı, gerçekleşmelerini, moleküler dönüşümlerini ve elde edilen fenotipleri köprü kurmaktır. Buna göre, genomik, transkriptomik, metabolomik, lipidomik ve proteomik gibi çeşitli büyük ölçekli analitik yaklaşımlarla üretilen kapsamlı veri kümelerinin entegrasyonu ve hesaplama analizi, karmaşık biyolojik sistemlerin tanımlanması ve anlaşılması için bir ön şart haline gelmiştir. Bas<html> Büyük bir kimyasal çeşitlilik ve biyolojik bileşenlerin herhangi bir canlı sistemdeki karmaşıklığı üzerine, büyük ve kapsamlı &#39;omiks&#39; veri setlerinin üretimi, uygulanan özütleme yönteminin kalitesi 9 üzerinde büyük bir oranda güvenir. Ayıklama yönteminin kalitesine ek olarak yöntemin ekonomisi de önemlidir; Bu, mümkün olduğunca az numune girişi kadar moleküler bilgi elde etmek için arzu edilir olduğu anlamına gelir. Genellikle numune miktarları sınırlayıcı olabilir ve bu nedenle verilen bir numunenin tek bir ekstraksiyonundan birçok moleküler sınıf elde edebilen bir ekstraksiyon yönteminden faydalanmak son derece arzu edilir. Bu, aynı numunenin farklı örnek alikotlarından farklı bileşik sınıflarının ekstraksiyonu için birkaç özel özütleme yöntemi kullanmak yerine, tek bir bölümün moleküler bileşenlerini farklı molekül fraksiyonlarına parçalayan ardışık bir özütleme yöntemi kullanılır. Bu fraksiyonlu ekstraksiyon yöntemleri için kullanılan ortak yöntem, 1957&#39;de geliştirilen Folch ve arkadaşlarının iki fazlı lipid özütleme yöntemine dayanmaktadır.10 Bu yöntem, polar ve hidrofobik metabolitlerin bir kloroform: metanol / su bölünmesine dayalıdır ve Yüksek kalitede lipid analizi için temizleme ve de-kompleks numuneleri tasarlamayı amaçlar.Folch yöntemi, çoklu omik sistem biyolojisinin gelişmesiyle birlikte, proteinlerin ve kutup metabolitlerinin ve lipidlerin numune bölümlemesi için kullanıldığı için aşamalı olarak geliştirildi. Sıvı ve sıvı kromatografi tabanlı metabolomik ve polar ve hidrofobik bileşiklerin lipidomikleri, sıvı kromatografi tabanlı proteomiklere 11 , 12 , 13 , 14 ek olarak . Ne ​​yazık ki, bu yöntemlerin tümü kloroform esaslı bir özütleme yöntemine dayanmaktadır, bu yöntem sadece IstenmeyenProtein pelletinin polar ve lipid fazı arasındaki bir ara faz olarak bulunması, fakat aynı zamanda yeşil bir kimya perspektifinden istenmeyen bir solvent olan 15,16. Bununla birlikte, çözücü metil tert -butil eter (MTBE), yukarıda belirtilen bu problemlerin ikisini de üstesinden gelir ve kloroform için uygun bir yedektir. Bu gerekliliklere dayanarak, yukarıda bahsedilen özelliklerin tümünü yerine getiren ve dolayısıyla kapsamlı çoklu omik analiz için ideal bir başlangıç ​​noktası olarak işlev gören bir MTBE: metanol: su bazlı özütleme yöntemi oluşturmaya karar verdik. Bu protokol, yaygın olarak gözlemlenen sorunların gidermek de dahil olmak üzere kullanıcıyı adım adım basit, hızlı ve tekrarlanabilir iş akışıyla adım adım yönlendirir. Ayrıca, ultra-performans sıvı kromatografısi-kütle spektrometresinden (UPLC-MS) örneklenmiş analitik verileri kısaca tanıtacağız -basLipidomik, metabolomik ve proteomik profilleme yöntemleri. Verilen örnekler, 50 mg bir Arabidopsis thaliana yaprak doku örneğinden türetilmiş olsa da, bu protokol algler 17 , 18 , böcekler 19 ve memeli hücreleri, organlar ve dokular 20 , 21 , 22 . Sunulan ekstraksiyon protokolünün kapsamı, ekstraksiyon öncesi numune alma işleminin ve ekstraksiyon işleminin kendisinin açık ve ayrıntılı bir tanımını sağlamaktır. Analitik uygulama için üç kısa örnek sunsak bile, analitik ve analitik olmayan veri işleme hakkında ayrıntılı bilgi, önceki yayınlarımız olan 16 , 23 , 24 , <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 25 , 26 .

<table><tbody><tr><td><güçlü > Reaktifler ve standartlar< güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Ampisilin & nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9393-5G</td><td>Metabolitler için iç standart</td></tr><tr><td>Kortikosteron&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>27840-500MG</td><td>Metabolitler için dahili standart, HPLC sınıf</td></tr><tr><td>13C Sorbitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>605514</td><td>Metabolitler için dahili standart, ISOTEC & reg; &nbsp; Kararlı İzotoplar</td></tr><tr><td>1,2-diheptadekanoil-sn-glisero-3-fosfokolin (17:0 PC)&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850360P</td><td>Lipidler için dahili standart</td></tr><tr><td>Metanol (MeOH)&nbsp;</td><td>Biosolve Kimyasalları</td><td>13684102</td><td>ULC-MS sınıfı</td></tr><tr><td>Su</td><td>Biosolve Kimyasalları</td><td>23214102</td><td>ULC-MS sınıfı</td></tr><tr><td>Metil tert-bütil eter (MTBE)&nbsp;</td><td>Biosolve Kimyasalları</td><td>13890602</td><td>HPLC sınıfı</td></tr><tr><td>Tripsin / Lys-C karışımı&nbsp;</td><td>Promega</td><td>V5072</td><td>Proteinlerin enzimatik sindirimi</td></tr><tr><td><güçlü>Ekipman</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Denge&nbsp;</td><td>Sartorius Şirketi&nbsp;</td><td>14 557 572</td><td></td></tr><tr><td>Doku öğütme mikser değirmeni&nbsp;</td><td>Retsch, Mikserli Değirmen MM 300</td><td>20.746.0001</td><td></td></tr><tr><td>Harç ve havaneli&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z247464-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı&nbsp;</td><td>Vortex-Genie 2, Model G560</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Vakum konsantratörü</td><td>Tarama Hızı Maxi Vac Alpha Evaporatörler</td><td>7.008.500.002</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Güvenli kilitli mikrosantrifüj tüpleri&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td>Numune alımı için kullanılır</td></tr><tr><td>1,5 mL Güvenli kilitli mikrosantrifüj tüpleri&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>Fraksiyonlar için kullanılır</td></tr><tr><td>Çalkalayıcı</td><td>Eppendorf Thermomixer 5436</td><td>2050-100-05</td><td></td></tr><tr><td>Sonikatör &</td><td>USC 300&nbsp;TH</td><td>142-0084</td><td></td></tr><tr><td>Soğutmalı mikrosantrifüj</td><td>Eppendorf, model 5427R</td><td>22620701</td><td></td></tr><tr><td>UPLC sistemi&nbsp;</td><td>Waters Acquity UPLC sistemi (Waters, Machester, İngiltere)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;MS sistemi&nbsp;</td><td>Exactive, Orbitrap tipi, MS (Exactive, Thermo-Fisher, Bremen, Almanya).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ters Faz (RP) Köprülü Etil Hibrit (BEH) C8 sütunu (100 mm ve kez; 1.7 &mu içeren 2.1 mm; m çaplı parçacıklar)</td><td>Sular, Machester, İngiltere</td><td>186002878</td><td>Lipidlerin analizi</td></tr><tr><td>RP Yüksek Mukavemetli Silika (HSS) T3 kolonu (100 mm ve kez; 1.8 & mu içeren 2.1 mm; m çaplı parçacıklar)&nbsp;</td><td>Waters, Machester, Birleşik Krallık</td><td>186003539</td> EASY-nLC 1000 sistemine bağlı Q ExactivePlus yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi <td>metabolitlerinin analizi</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher, Bremen, Almanya</td><td></td><td>Peptitlerin analizi</td></tr></tbody></table>

tek bir numuneden metabolitlerin, lipidlerin ve proteinlerin kapsamlı analizi için basit fraksiyonlu ekstraksiyon metodu

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Karmaşık biyolojik sistemlerin anlaşılması, genellikle transkriptomik, proteomik, metabolomik ve lipidomik ölçümlerle belirlenen, canlı hücrenin çoklu bileşik sınıflarının ölçülmesi, analizi ve entegrasyonunu gerektirir. Bu protokolde, metabolitlerin, lipidlerin ve proteinlerin biyolojik dokulardan, örnek başına tek bir alikot kullanılarak tekrarlanabilir şekilde ekstraksiyonu için basit bir yöntem sunuyoruz. Ekstraksiyon metodu sıvı için bir metil tert -butil eter: metanol: su sistemi üzerine kuruludur. Hidrofobik ve kutupsal metabolitlerin protein ve diğer macromoleküllerin katı bir pellet olarak çökeltilmesiyle birlikte karışmayan iki faza sıvı ile bölünmesi. Bu nedenle, bu yöntem, kütle spektrometreleriyle birleştirilen sıvı kromatografi (LC) veya gaz kromatografisi (GC) gibi ortak yüksek verimli &#39;omiks&#39; teknolojileri ile tamamen uyumlu üç farklı fraksiyona özel moleküler kompozisyon sağlar. Yöntem init olmasına rağmenFarklı bitki doku örneklerinin analizi için geliştirilmiş olup yosunlar, böcekler ve memeli dokuları ve hücre kültürleri gibi çeşitli sistemlerden biyolojik numunelerin çıkarılması ve analizi için tamamen uyumlu olduğu kanıtlanmıştır.

Kapsamlı çoklu omik veri setleri, kompleks biyolojik sistemleri anlamak için çok değerlidir. Başarılı bir biyolojik deney için strateji, genellikle, anlamlı bir deneysel tasarım, deney düzeneği ve performansın ardından örnek toplama, çıkarma, analitik veri toplama, ham veri işleme, istatistiksel veri analizi, ilgili metabolitin tanımlanması ve biyolojik veri yorumlamasından başlamaktadır. Yol haritası ve görselleştirme de dahil olmak üzere ( Şekil 1 ). Burada tanıtılan özütleme protokolünde, Şekil 2&#39;deki detaylı iş akışına genel bakışta tasvir edilen örnek toplama, işleme ve çıkarma adımlarına odaklanıyoruz. Gösterim amacıyla, 50 mg Arabidopsis yaprak dokusu seçildi. Bu malzeme hasat edilmekte, öğütüldükten ve öğütülmeden önce üçÖrnek analitik UPLC-MS platformları, hedeflenmiş ve hedeflenmemiş lipidomik, metabolomik ve proteomik analiz için kullanılabilen verileri sağlar. Şekil 2 ve 6 , ek olarak, standart koşullar altında ekstraksiyon solventinin nasıl görünmesi gerektiğinin temsili resimlerini içermektedir. Buna ek olarak, aşırı miktarda çökeltilmiş makromoleküller (proteinler ve nişasta) ve uygunsuz numune homojenizasyonu olan numuneler içeren örnekler gösterilmiştir ( Şekil 3 ). Bu iki yaygın problemin gidermesi Şekil 3&#39;de kısaca verilmekle birlikte, daha önceki yayınlarımızda da daha ayrıntılı olarak tartışılmıştır. Şekiller 4 ve 5 , lipitten türetilen üç analitik kromatogram örneğini özetlemektedir, polar / semI-polar metabolitler ve protein analizleri. Üst MTBE fazından alınan lipitler ( Şekil 2 ), yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisiyle birleştirilmiş ters faz (RP) C8 ultra performans sıvı kromatografisi ile analiz edildi. Lipitler, pozitif ve negatif MS iyonizasyon modları ( Şekil 4 , üst bölme) kullanılarak elde edilebilir 16 , 24 . Kutupsal ve yarı polar primer ve sekonder metabolitler polar (su / metanol) fazdan ( Şekil 2 ) ters fazlı (RP) C 18 UPLC-MS 25 ile analiz edildi. Gösterilen yöntem, ters fazlı kromatografiyi kullanarak, MS&#39;de pozitif ve negatif iyonizasyon modları kullanılarak analiz edilebilen yarı-polar metabolitlerin (yani, bitki ikincil metabolizmasından gelen metabolitler) oldukça uyumludur( Şekil 4 , alt bölme) 16 . Ters fazlı materyal üzerinde iyi bir tutuş göstermeyen bu fraksiyondan daha fazla hidrofilik metabolitler (şekerler, polar amino asitler, vs.), GC-MS 16 veya hidrofilik etkileşim sıvı kromatografisi 30 gibi diğer analitik yöntemlerle analiz edilebilir. Ekstraksiyon borusunun tabanındaki katı peletten alınan proteinler ( Şekil 2 ) solüsyonda sindirildi ve shot gun LC-MS ( Şekil 5 ) kullanılarak analiz edildi, nişasta ve hücre duvarı ekstraksiyon protokolü Materyal, önceden yayınlanmış protokolümüzden elde edilebilir 16 . Özetle, 200&#39;den fazla lipid türü, 50 açıklanmış yarı-polar metabolit ve birkaç bin proteiBizim örneğimizde kullanılan türden numuneler rutin olarak tanımlanabilir. Ek olarak, yöntem farklı dokuları, organları ve hücre kültürü materyalini kullanarak geniş uygulanabilirlik gösterdi ( Şekil 6 ). <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55802/55802fig1.jpg" /> Şekil 1: Büyük Ölçekli Hedefsiz Öykünme Analizi için Genel İş Akışı. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55802/55802fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55802/55802fig2.jpg" /> Şekil 2 : Biyolojik Bir Numunenin Tek Bir Kısmından Lipidlerin, Metabolitlerin ve Proteinlerin Analizi için Örnek Hazırlama ve Çıkarma İş Akışı.<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55802/55802fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55802/55802fig3.jpg" /> Şekil 3 : İki Fazlı Bölme Çıkarma Protokollerini Kullanan Yaygın Olarak Gözlemlenen Sorunların Açıklayıcı Örnekleri. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55802/55802fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55802/55802fig4.jpg" /> Şekil 4 : Arabidopsis thaliana Yaprak Özlerinden Lipid ve Yarı-Polar Metabolitlerin Temsilci Kromatogramları . Taban pik kromatogramı(Üst bölme) ve yarı polar metabolitler (alt bölme) pozitif iyonizasyon modunda analiz edildi 16 . Her kromatogramın sağ üst köşesindeki pasta grafikleri, farklı kimyasal sınıflara atanan belirlenmiş lipidlerin ve metabolitlerin sayısını gösterir. Chl, klorofiller; DAG, diasilgliserid; DGDG, digalaktosil-diasilgliserol; FA, yağlı asit; LizoPC, lizofosfatidilkolin; MGDG, monogalaktonuzikalgliserol; PC, fosfatidilkolin; PE, fosfatidiletanolamin; PG, fosfatidilgliserol; PI, fosfatidilinositol; PS, fosfatidilserin; SP, sfingolipid; SQDG, sülfoquinovosyildiasilgliserol; TAG, triaçilgliserid. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55802/55802fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55802/55802fig5.jpg" /> Şekil 5 <s<html> Trong&gt;: Arabidopsis thaliana Yaprak Özlerinden Peptidlerin Temsilci Zirve Pik Kromatogramı . Sağ üst köşedeki pasta grafiği, farklı biyolojik süreçlere ayrılmış tanımlanmış proteinlerin sayısını gösterir 16 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55802/55802fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55802/55802fig6.jpg" /> Şekil 6 : Vahşi tipli Arabidopsis thaliana&#39;dan çeşitli doku tiplerinin Temsilci Çıkarma Örnekleri . Tüm numuneler, belirtilen dokulardan 50 mg taze ağırlık kullanılarak özümlendi.&quot;&gt; Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Zaman (dak) </td><td> Tampon A&#39;dan Tampon B&#39;ye </td><td></td></tr><tr><td> 0 ila 1 dakika </td><td> 45% A </td><td> Tampon A:% 1 İM NH4-Asetat, UPLC MS dereceli suda% 0.1 asetik asit </td></tr><tr><td> 1 ila 4 dakika </td><td> % 45 A&#39;dan% 25 A&#39;ya lineer gradyan </td><td> Tampon B: asetonitril / izopropanol 7: 3 (v: v) içinde% 1 İM NH4-Asetat,% 0.1 asetik asit, </td></tr><tr><td> 4 ila 12 dakika </td><td> % 25 A&#39;dan% 11 A&#39;ya lineer gradyan </td><td> Akış hızı 400 μL / dak </td></tr><tr><td> 12 ila 15 dakika </td><td> % 11 A&#39;dan% 0 A&#39;ya doğrusal gradyan </td><td> Enjeksiyon hacmi 2 μL </td></tr><tr><td> 15 ila 19,5 dak. </td><td> Kolonu,% 0 A ile 4,5 dakika boyunca yıkayın. </td><td></td></tr><tr> &lt;Td&gt; 19.50 ila 19.51 dakika </td><td> % 45 A&#39;ya geri dönün </td><td></td></tr><tr><td> 19.51 ila 24 dakika </td><td> % 45 A ile dengeye getirin </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1: Lipidlerin RP-UPLC Ayrılması İçin Grade Parametreleri. RP, ters faz. UPLC, ultra-performans sıvı kromatografisi. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Zaman (dak) </td><td> Tampon A&#39;dan Tampon B&#39;ye </td><td></td></tr><tr><td> 0 ila 1 dakika </td><td> % 99 A </td><td> Tampon A: UPLC dereceli suda% 0.1 formik asit </td></tr><tr><td> 1 ila 11 dakika </td><td> % 99 A&#39;dan% 60 A&#39;ya lineer gradyan </td><td> Tampon B: UPLC grad asetonitril içinde% 0.1 formik asit </td></tr><tr><td> 11 ila 13 dakika </td><td> % 60 A&#39;dan% 30 A&#39;ya lineer gradyan </td><td> Debi 4001 L / dakika </td></tr><tr><td> 13 ila 15 dakika </td><td> % 30 A&#39;dan% 1 A&#39;ya doğrusal gradyan </td><td> Enjeksiyon hacmi 2 μL </td></tr><tr><td> 15 ila 16 dakika </td><td> Kolonu% 1 A ile 1 dakika boyunca yıkayın. </td><td></td></tr><tr><td> 16 ila 17 dakika </td><td> Lineer gradyan,% 1 A ila% 99 A </td><td></td></tr><tr><td> 17 ila 20 dakika </td><td> % 99 A&#39;da 3 dakika dengelenir. </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 2: Polar ve Yarı-Polar Metabolitlerin RP-UPLC Ayrımı İçin Gradyan Parametreleri. RP, ters faz. UPLC, ultra-performans sıvı kromatografisi. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Zaman (dak) </td><td> Tampon B&#39;den Tampon A&#39;ya </td><td></td></tr><tr><td> 0 ila 5 dakika </td><td> % 0 ila% 10 doğrusal gradyan </td><td> Tampon A: UPLC dereceli suda% 0.1 formik asit </td></tr><tr><td> 5 ila 80 dakika </td><td> % 10&#39;dan% 40&#39;a lineer gradyan </td><td> Tampon B:% 60 UPLC dereceli asetonitril içinde% 0.1 formik asit </td></tr><tr><td> 80 ila 85 dakika </td><td> % 40&#39;dan% 60&#39;a lineer gradyan </td><td> Akış hızı 300 nL / dak </td></tr><tr><td> 85 ila 86 dakika </td><td> % 60&#39;dan% 95&#39;e lineer gradyan </td><td> Enjeksiyon hacmi 5 μL </td></tr><tr><td> 86 ila 91 dakika </td><td> Kolonu 5 dakika boyunca% 95 </td><td></td></tr><tr><td> 91 ila 92 dakika </td><td> % 95&#39;den% 0&#39;a lineer gradyan </td><td></td></tr><tr><td> 93 ila 110 dakika </td><td> Kolonu 17 dakika süreyle% 0&#39;da dengeye getirin </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 3: Peptidlerin Nano-LC Ayırımı İçin Grade Parametreleri. LC, sıvı kromatografisi.

Bir örnek kullanarak biyolojik dokulardan lipidlerin, metabolitlerin ve proteinlerin kapsamlı şekilde ekstraksiyonu için bir protokol sunulmuştur.

Tek Bir Numuneden Metabolitlerin, Lipidlerin ve Proteinlerin Kapsamlı Analizi için Basit Fraksiyonlu Ekstraksiyon Metodu

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Bu yöntemin genel amacı, basit bir fraksiyonel metil-tributil eter ekstraksiyonu kullanarak tek bir örnekten polar ve yarı-polar metabolitler, lipidler ve proteinler dahil olmak üzere tüm ana moleküler yapıları geri kazanmak ve analiz etmektir. Genel olarak bilim insanları, tek bir örnekten birden fazla bileşik sınıfını analiz etmekte zorlanırlar. Burada tanıttığımız MTBE ekstraksiyonunu kullanarak; lipidler, metabolitler ve proteinler gibi çoklu bileşik sınıflarını tek bir örnekten ekstrakte edebilir ve analiz edebilirsiniz.Bu tekniğin temel avantajı, tek bir örnek aliquotunun küçük bir miktarından tüm moleküler bileşik sınıflarını sağlam bir şekilde ekstrakte edebilmesidir. Proteomik, lipidomik ve metabolomik analizlerde kullanılabilecek fraksiyonlar sağlayarak multiomik analizler için deneysel temel oluşturması nedeniyle, bu yöntem sistem biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Aşağıdaki protokol, Arabidopsis yaprak dokusu kullanılarak gösterilmiştir.Arabidopsis, Brassicaceae familyasından küçük çiçekli bitkilerdir ve lahanalarla akrabadır. Bu prosedüre, doku homojenizatör tüp tutucularını sıvı azot içerisinde en az 10 dakika boyunca ön soğutma yaparak başlayın. Numuneleri sıvı azottan çıkarın ve tüp tutuculara yerleştirin.Ardından tüp tutucuları sıvı azottan çıkarın. Tüp tutucuları hızlıca doku homojenizatörüne yerleştirin ve homojenizatörü, biyolojik materyali ince ve homojen bir toz haline gelecek şekilde öğütecek şekilde ayarlayın. Yapraklar için bir dakika boyunca 20 hertz kullanın.Homojenizasyon süresi ve hızı, dokuya bağlı olarak değiştirilebilir. Elde edilen örneğin çok ince bir toz haline gelene kadar homojenize edildiğinden emin olun. Ayrıca örnek, homojenizasyonun her adımında donmuş halde tutulmalıdır.Numuneleri homojenize edin, ardından biyolojik numuneleri tüp tutuculardan çıkarın. Eğer hemen kullanılmayacaklarsa, daha sonraki ekstraksiyona kadar -80 °C dondurucuya yerleştirin. Dört adet iki mililitrelik yuvarlak tabanlı, kilitli mikro santrifüj tüpünü numune numaralarıyla etiketleyin.Tüpleri ve bazı spatulaları sıvı azotun içine daldırarak önceden soğutun. Tüpler ve spatulalar soğuduktan sonra, tüplerden birini analitik teraziye yerleştirin ve bir spatula kullanarak mikrosantrifüj tüpüne 25 miligram doku tozu aliquot edin. Her bir örnek için kesin ağırlığı kaydedin, ardından aliquot edilen örnekleri derhal sıvı azota yerleştirin.Bitki materyalinin çözülmesini önlemek için bu adımı hızlıca gerçekleştirin. Alikotlara ayrılmış örnekleri, bir sonraki ekstraksiyona kadar -80 °C'de saklayın. Ekstraksiyona hazırlanmak için, ekteki belgede tarif edildiği gibi hazırlanan metil tert-bütil eter veya MTBE metanol ekstraksiyon karışımını -20 °C'lik bir dondurucuda ön soğutmaya tabi tutun.Alikotlanmış numuneleri çıkarın ve her bir numune tüpüne bir mililitre önceden soğutulmuş ekstraksiyon karışımı ekleyin. Bu adımı hızlıca gerçekleştirin. MTBE'nin viskozitesi düşük olduğundan pipet ucundan damlayabilir.Doku, ekstraksiyon karışımı içinde iyice homojenize olana kadar her örneği hemen bir vorteks karıştırıcıda karıştırın. Tüm örneklerin ekstraksiyonu tamamlanana kadar tüpleri tezgahtaki bir rakta tutun. Bu adım kritiktir.Burada proteinleri çöktürüyoruz ve enzimatik aktivitelerini inaktive ediyoruz. Tüm örnekleri bir orbital çalkalayıcıda 100 RPM'de, 4 °C'de 45 dakika boyunca inkübe edin. Ardından örnekleri buz gibi soğuk bir sonikasyon banyosunda 15 dakika boyunca sonike edin.Ardından, faz ayrımı ile fraksiyona ayırmak için her bir örnek tüpüne su ve metanolden oluşan üçe bir oranındaki çözeltiden 650 µL ekleyin. Daha sonra bir dakika boyunca vorteksleyerek karıştırın. Örnekleri 4 °C'de, 20,000 ×g hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin.Bu adımdan sonra, iki sıvı fazın karışmasını önlemek ve çökelmiş pelletin bozulmasını engellemek için tüpleri dikkatle taşıyın. Bu aşamada, tüpün dibinde katı bir pellet ile birlikte iki kabul edilebilir sıvı faz bulunmaktadır. Polar olmayan üst faz lipidleri içerir.Alt sulu faz, polar ve yarı polar metabolitleri içerir. Pelet ise proteinleri, nişastaları ve hücre duvarını içerir. Üstteki lipid içeren fazdan 500 µL çözücüyü, etiketlenmiş 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Ardından, 200 µL'lik bir pipet kullanarak kalan lipid fazını dikkatlice uzaklaştırın ve atın. Sonrasında, alt fazdan 400 µL çözücüyü etiketlenmiş 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Gaz kromatografisi tabanlı metabolit analizi gibi ileri analizleri gerçekleştirmek için 200 µL'lik ek bir alikotu başka bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Fazla hacmi pipetleyerek geri kalan sulu fazı uzaklaştırın ve atın. Ardından, elde edilen protein-nişasta-hücre duvarı peletini yıkamak için 500 µL metanol ekleyin ve bir dakika boyunca vorteksleyin. Numuneleri dört °C'de beş dakika boyunca 10,000 ×g hızda santrifüjleyin.Lipitlerin oksidatif modifikasyonlarından kaçınmak için lipid örneklerindeki çözücüyü bir nitrojen akışlı evaporatör kullanarak uçurun. Elde edilen kurutulmuş örnekler hemen analiz edilmelidir. Sulu örneklerdeki çözücüyü, ısıtma işlemi yapmadan bir vakum konsantratöründe gece boyunca uçurun.Kurutulmuş sulu örnekler, analizden önce birkaç hafta boyunca eksi 80 santigrat derecede saklanabilir. Kurutulmuş lipid fraksiyonlarını, 7:3 oranında asetonitril ve 2-propanol içeren 400 mikrolitre çözeltide tekrar süspande edin. Yeterli miktarda sıvıyı cam şişelere aktarın ve kapaklarını sıkıca kapatın.Ardından, cam şişeleri dört °C'ye soğutulmuş bir otomatik örnekleyiciye yerleştirin. Örnek başına 2 µL enjekte edin ve lipidleri, 400 µL/dak akış hızında çalışan bir UPLC sistemi kullanarak, 60 °C'de tutulan ters faz C8 kolonu üzerinde ayırın. Kromatografik ayırma için ekteki belgenin Tablo 1'inde açıklanan mobil fazları kullanın.150 ve 1500 yük-kütle oranı arasındaki kütle aralığını kapsayan uygun bir MS cihazı kullanarak pozitif ve negatif iyonizasyon modlarında kütle spektrumlarını elde edin. Polar fazı, birer oranda UPLC sınıfı metanol ve su içeren 200 µL'lik bir çözeltide yeniden süspanse edin. Yeterli miktarda sıvıyı cam şişelere aktarın ve kapaklarını sıkıca kapatın.Ardından, cam şişeleri 4 °C'ye soğutulmuş bir otomatik örnekleyiciye yerleştirin. Her örnekten 2 µL enjekte edin ve metabolitleri, 400 µL/dak akış hızında çalışan bir UPLC sistemi kullanarak, 40 °C'de tutulan bir RP C-18 kolonunda ayırın. Kromatografik ayırma için ekteki belgenin Tablo 2'sinde verilen parametrelere sahip mobil fazları kullanın.Uygun bir kütle spektrometresi kullanarak 50 ile 1500 kütle-yük oranı arasındaki kütle aralığını kapsayacak şekilde pozitif ve negatif iyonizasyon modlarında tam tarama kütle spektrumlarını elde edin. Son olarak, ekli belgede açıklandığı şekilde protein ekstraksiyonu, sindirimi ve analizini gerçekleştirin. 25 mg Arabidopsis yaprak dokusu hasat edilip öğütüldü ve üç analitik UPLC-MS platformuna tabi tutulmadan önce ekstrakte edildi.Polar ve yarı-polar primer ve sekonder metabolitler, polar fazdan ters faz C-18 UPLC-MS ile analiz edilmiştir. Üst panelde gösterilen lipidlerin ve alt panelde gösterilen yarı-polar metabolitlerin baz pik kromatogramları, pozitif iyonizasyon modunda analiz edilmiştir. Her kromatogramın sağ üst köşesindeki pasta grafik, tanımlanan lipidlerin ve farklı kimyasal sınıflara atanan metabolitlerin sayısını göstermektedir.Örneğin, üstteki grafikte TAG olarak belirtilen triasilgliserid grubuna 58 farklı lipid atanmıştır. Ters faz malzemesinde iyi tutunma göstermeyen şekerler ve polar amino asitler gibi bu fraksiyondan gelen daha hidrofilik metabolitler; GCMS veya hidrofilik etkileşimli sıvı kromatografisi gibi diğer analitik yöntemlerle analiz edilebilir. Ekstraksiyondan elde edilen proteinler, çözelti içinde sindirilmiş ve shotgun LCMS kullanılarak analiz edilmiştir.Sağ üst köşede gösterilen pasta grafiği, farklı biyolojik süreçlere atanan tanımlanmış proteinlerin sayısını belirtmektedir. Örneğin, lokalizasyon kategorisine 268 protein atanmıştır. Özetle, bu örnekte kullanılan örneklere benzer numunelerden rutin olarak 200'den fazla lipid türü, 50 anotasyonlu yarı polar metabolit ve birkaç bin protein tanımlanabilmektedir.Ayrıca yöntem, farklı dokular, organlar ve hücre kültürü materyalleri kullanılarak geniş bir uygulanabilirlik göstermiştir. Bu videoyu izledikten sonra, tek bir örnekten en temel bileşiklerin nasıl ekstrakte edileceği ve analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken tüm örnekleri donmuş halde tutmak, materyali uygun şekilde öğütmek ve analiz saflığındaki çözücüleri ve kimyasalları kullanmak önemlidir.Bu prosedürün ardından, ekstrakte edilen örneklerin moleküler bileşimini belirlemek için tüm analitik yöntemler uygulanabilir.

a-simple-fractionated-extraction-method-for-comprehensive-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Biz maya kullanarak anket-tarama elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (ESI / MS) gibi çok sayıda lipid türlerinin belirlenmesi için yeni bir nicel lipidomics yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, şu anda, lipidler, hassasiyet ve hız çeşitli moleküler formları çözmek için yeteneği lipid tanımlanması ve ölçülmesi için kullanılabilir yöntemleri aşıyor.

Nicel Değerlendirme Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi kullanarak Maya Lipidome

Bu protokol, hücrelerden serbest ve esterlenmiş biyoaktif yağ asitlerinin ekstraksiyonunu ve analizini gösterecektir. Yağ asitleri, kararlı izotop seyreltme, kiral sıvı kromatografisi, elektron yakalama, atmosferik kimyasal iyonizasyon, çoklu reaksiyon izleme, kütle spektrometresi (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS) kullanılarak doğru bir şekilde ölçülür.

Hücresel Lipid Ekstraksiyon Hedefli Kararlı İzotop Seyreltme Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Analizi

Hedefsiz metabolomik bir metabolik profili anlık üreten bir hipotez sağlar. Bu protokol, serum hücreler veya doku metabolitlerinin çıkarma ve analiz gösterecektir. Metabolitleri bir dizi sıvı-sıvı faz ekstraksiyon kullanılarak anket vardır, Mikrosirkülasyon Ultra Performanslı sıvı kromatografisi / diferansiyel analiz yazılımı için birleştiğinde yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (UPLC-HRMS).

Ultra Performanslı Sıvı Kromatografi-Yüksek Çözünürlüklü Kütle Spektrometre (UPLC-HRMS) kullanarak Biyolojik Kaynaklar gelen hedefsiz Metabolomik

Metabolomiks deneylerde sonuçların güvenilirliği numune hazırlama etkinliği ve yeniden üretilebilirlik bağlıdır. Daha sonra bileşikler bin kadar analiz, ya da ilgi sadece bileşik sınıfları seçeneği ile biyolojik sıvılardan metabolitlerin çıkarma sağlayan bir sıkı ve derinlemesine bir yöntem tarif edilmektedir.

Derinlemesine ve Bilgilendirici metabolomic Analizi Çoklu Metaboliti&#39;nin Bileşik Sınıfları Kurtar Multi-step Hazırlama Tekniği

Makale, birçok numuneyle yapılan çalışmalarda toprak mikrobik topluluk yapısını belirlemek için hem toplam lipidlerin hem de gösterge lipidlerinin göreceli olarak bolluğunun karakterize edilmesinde kullanılmak üzere, mikroorganizmaların hücre membranlarından lipidlerin ekstraksiyonu için çaba ve doğruluğu denkleştirirken, verimliliği arttıran bir yöntemi açıklıyor.

Çok Örnekli Deneylerde Toprak Mikroplarını Karakterize Etmek İçin Bir Lipid Ekstraksiyon ve Analiz Metodu

Bir iletişim kuralı aynı anda metabolitleri, proteinler ve yağlar bir tek toprak örneğinden ayıklanması, azaltılmış örnek hazırlama kez izin ve multi-omic kütle spektrometresi analizleri ile sınırlı miktarda örnekleri etkinleştirme için sunulmaktadır.

Toprak örnekleri Multi-omic analizleri için karmaşık iletişim kuralı

Protein-protein ve protein-metaboliti etkileşimler tüm hücresel fonksiyonları için önemlidir. Burada, biz seçim bir protein ile bu etkileşimlerin paralel analiz sağlayan bir protokol tanımlamak. Bizim iletişim kuralı bitki hücre kültürleri için optimize edildi ve benzeşme arıtma kütle spektrometresi tabanlı protein ve metaboliti algılama ile birleştirir.

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Bu iletişim kuralı tek bir üretim için doğal organik madde ve mikrobiyal proteomik farklı ekosistemleri içinde tam olarak eşleştirilmiş karakterizasyonu sonuçlanan tamamlayıcı analitik ve omics teknikleri açıklar. Bu yaklaşım sağlam karşılaştırmalar metabolik yollar ve sera gazı üretim tanımlamak ve çevresel değişimin yanıt tahmin için önemli dönüşümleri tanımlamak için izin verir.

Karmaşık doğal organik madde karışımları karakterize için tek işlem hacmi tamamlayıcı yüksek çözünürlüklü analitik teknikler

Bu makalenin amacı, metabolomik analiz için kültürlü yapışan hücrelerden sulu metabolitlerin çıkarılması için bir protokol açıklamak için, özellikle, kapiller Elektroforez-kütle spektrometresi.

Kılcal Elektroforez-kütle spektrometresi tarafından metabolomik analiz için kültürlü yapışan hücrelerden sulu metabolitlerin çıkarılması

Saccharomyces cerevisiae'dekimajör hücresel lipitleri tanımlamak ve ölçmek için tandem kütle spektrometresi ile birleşen sıvı kromatografi kullanılarak bir protokol sayılmaktadır. Bir maya hücresi içindeki majör lipid sınıflarının nicel bir değerlendirme için açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve duyarlıdır.

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Av tüfeği kütle spektrometrisine dayalı lipidomikler, çeşitli kemirgen dokularından tek bir ölçümde aynı anda geniş bir lipit sınıfları spektrumunun hassas bir kantitatif görüntüsünü sunar.

Kemirgen Dokularının Av Tüfeği Lipidomikleri

Öğrenin, tek bir numuneden lipid, metabolit ve protein çıkarmak için metil-tert-bütil eter ekstraksiyon yöntemini. Arabidopsis yaprak dokusunda çoklu bileşik sınıflarının analizi için sistem biyolojisi araştırmalarına temel oluşturur.

Tek Bir Numuneden Metabolitlerin, Lipidlerin ve Proteinlerin Kapsamlı Analizi için Basit Fraksiyonlu Ekstraksiyon Metodu

Daha fazla video keşfet