Tek Bir Numuneden Metabolitlerin, Lipidlerin ve Proteinlerin Kapsamlı Analizi için Basit Fraksiyonlu Ekstraksiyon Metodu

Bu yöntemin genel amacı, basit bir fraksiyonlanmış metil-tribütil eter ekstraksiyonu kullanarak tek bir numuneden polar ve yarı polar metabolitler, lipitler ve proteinler dahil olmak üzere tüm ana moleküler varlıkları kurtarmak ve analiz etmektir. Genel olarak, bilim adamları tek bir örnekten birden fazla bileşik sınıfını analiz etmeyi zor bulmaktadır. Burada tanıttığımız MTBE ekstraksiyonunu kullanarak, tek bir numuneden lipitler, metabolitler ve proteinler gibi birden fazla bileşik sınıfını çıkarabilir ve analiz edebilirsiniz.

Bu tekniğin ana avantajı, tüm moleküler bileşik sınıflarını az miktarda tek numune alikotundan sağlam bir şekilde ekstrakte edebilmesidir. Bu yöntem, proteomik, lipidomik ve metabolomik tarafından analiz için kullanılabilecek fraksiyonlar sağlayarak, multiomik analiz için deneysel temel sağladığından, sistem biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Aşağıdaki protokol Arabidopsis yaprak dokusu kullanılarak gösterilmiştir.

Arabidopsis, Brassicaceae familyasındaki küçük çiçekli bitkilerdir ve lahana ile ilgilidir. Bu prosedüre, doku homojenizatör tüp tutucularını sıvı nitrojen içinde en az 10 dakika önceden soğutarak başlayın. Numuneleri sıvı nitrojenden çıkarın ve tüp tutuculara yerleştirin.

Ve sonra tüp tutucuları sıvı nitrojenden çıkarın. Tüp tutucuları hızlı bir şekilde doku homojenizatörüne koyun ve homojenizatörü biyolojik materyali ince ve homojen bir toz haline getirecek şekilde ayarlayın. Yapraklar için bir dakika boyunca 20 hertz kullanın.

Homojenizasyon süresi ve hızı dokuya bağlı olarak değişebilir. Elde edilen numune çok ince bir toz olana kadar homojenize ettiğinizden emin olun. Ve numune homojenizasyonun her aşamasında donmuş halde tutulmalıdır.

Numuneleri homojenize edin, ardından biyolojik numuneleri tüp tutuculardan çıkarın. Ve hemen kullanılmayacaklarsa, daha fazla ekstraksiyon yapılana kadar eksi 80 santigrat derecelik bir dondurucuya koyun. Dört adet iki mililitrelik yuvarlak tabanlı güvenli kilitli mikrosantrifüj tüpünü numune numarasıyla etiketleyin.

Tüpleri ve bazı spatulaları sıvı nitrojene batırarak önceden soğutun. Tüpler ve spatulalar soğuduktan sonra, tüplerden birini analitik bir teraziye yerleştirin ve 25 miligram doku tozunu mikrosantrifüj tüpüne ayırmak için bir spatula kullanın. Her numune için tam ağırlığı kaydedin, ardından alikotik numuneleri hemen sıvı nitrojen içine yerleştirin.

Bitki materyalinin buzunun çözülmesini önlemek için bu adımı hızlı bir şekilde gerçekleştirin. Aliquoted numunelerini daha fazla ekstraksiyona kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Ekstraksiyona hazırlanmak için, ekteki belgede açıklandığı gibi hazırlanan metil tert-bütil eter veya MTBE metanol ekstraksiyon karışımını eksi 20 santigrat derece dondurucuda önceden soğutun.

Alıntılanmış numuneleri çıkarın ve her numune tüpüne önceden soğutulmuş ekstraksiyon karışımından bir mililitre ekleyin. Bu adımı hızlı bir şekilde gerçekleştirin. MTBE düşük viskoziteye sahiptir ve pipet ucundan damlayabilir.

Doku ekstraksiyon karışımı içinde iyi bir şekilde homojenize olana kadar her numuneyi hemen bir vorteks karıştırıcı üzerinde karıştırın. Tüm numuneler çıkarılana kadar tüpleri tezgah üzerinde bir rafta tutun. Bu adım çok önemlidir.

Burada proteinleri çökeltiyoruz ve enzimatik aktivitelerini etkisiz hale getiriyoruz. Tüm numuneleri 100 RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede 45 dakika inkübe edin. Daha sonra örnekleri buz gibi soğuk bir sonikasyon banyosunda 15 dakika boyunca sonikleştirin.

Daha sonra, faz ayrımı ile fraksiyonlamak için, her numune tüpüne 650 mikrolitre üçe bir su ve metanol çözeltisi ekleyin. Daha sonra bir dakika girdap yaparak karıştırın. Numuneleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 20.000 kez g hızında santrifüjleyin.

Bu adımdan sonra, iki sıvı fazın karışmasını önlemek ve çökelen peletin bozulmasını önlemek için tüpleri dikkatli bir şekilde kullanın. Bu aşamada, tüpün dibinde katı bir pelet bulunan iki kabul edilebilir sıvı faz vardır. Polar olmayan üst faz lipitler içerir.

Alt sulu faz, polar ve yarı polar metabolitleri içerir. Pelet proteinler, nişastalar ve hücre duvarı içerir. 500 mikrolitre çözücüyü üst lipid içeren fazdan etiketli 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Ardından, 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, kalan lipit fazını dikkatlice çıkarın ve atın. Daha sonra, 400 mikrolitre çözücüyü alt fazdan etiketli 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Gaz kromatografisi tabanlı metabolit analizi gibi daha fazla analiz yapmak için 200 mikrolitrelik ek bir alikotu bir mikro füj tüpüne aktarın.

Fazla hacmi pipetleyerek sulu fazın geri kalanını çıkarın ve atın. Daha sonra, elde edilen protein-nişasta-hücre duvar peletini yıkamak için 500 mikrolitre metanol ekleyin ve ardından bir dakika boyunca girdaplayın. Numuneleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 10.000 kez g hızında santrifüjleyin.

Lipitlerin oksidatif modifikasyonlarını önlemek için bir nitrojen akış evaporatörü kullanarak çözücüyü lipit numunelerinden buharlaştırın. Elde edilen kurutulmuş numuneler hemen analiz edilmelidir. Sulu numunelerdeki çözücüyü gece boyunca bir vakum yoğunlaştırıcıda ısıtmadan buharlaştırın.

Kurutulmuş sulu numuneler, analizden önce eksi 80 santigrat derecede birkaç hafta saklanabilir. Kurutulmuş lipit fraksiyonlarını, yedi ila üç asetonitril ila 2-propanol çözeltisinin 400 mikrolitresinde yeniden süspanse edin. Yeterli sıvıyı cam şişelere aktarın ve sıkıca kapatın.

Ardından, cam şişeleri dört santigrat derecede soğutulmuş bir otomatik örnekleyiciye koyun. Numune başına iki mikrolitre enjekte edin ve lipitleri, dakikada 400 mikrolitre akış hızında çalışan bir UPLC sistemi kullanarak 60 santigrat derecede tutulan ters faz C8 kolonunda ayırın. Kromatografik ayırma için ekteki belgenin Tablo 1'inde açıklanan mobil fazları kullanın.

150 ila 1500 yük-kütle oranı arasındaki kütle aralığını kapsayan uygun bir MS cihazı kullanarak pozitif ve negatif iyonizasyon modunda kütle spektrumlarını elde edin. Polar fazı, bire bir UPLC dereceli metanol çözeltisinin 200 mikrolitresinde suya yeniden süspanse edin. Yeterli sıvıyı cam şişelere aktarın ve sıkıca kapatın.

Ardından, cam şişeleri dört santigrat derece olan soğutulmuş bir otomatik örnekleyiciye koyun. Her numuneden iki mikrolitre enjekte edin ve dakikada 400 mikrolitre akış hızında çalışan bir UPLC sistemi kullanarak 40 santigrat derecede tutulan bir RP C-18 kolonundaki metabolitleri ayırın. Ekteki belgenin Tablo 2'sinde verilen parametrelerle kromatografik ayırma için mobil fazları kullanın.

50 ila 1500 kütle-yük oranı arasında bir kütle aralığını kapsayan uygun bir kütle spektrometresi kullanarak pozitif ve negatif iyonizasyon modunda tam tarama kütle spektrumları elde edin. Son olarak, ekteki belgede açıklandığı gibi protein ekstraksiyonu, sindirim ve analiz gerçekleştirin. 25 miligram Arabidopsis yaprak dokusu hasat edildi, öğütüldü ve üç analitik UPLC-MS platformuna tabi tutulmadan önce ekstrakte edildi.

Polar ve yarı polar primer ve sekonder metabolitler, ters faz C-18 UPLC-MS ile polar fazdan analiz edildi. Üst panelde gösterilen lipitlerin baz tepe kromatogramları ve alt panelde gösterilen yarı polar metabolitler, pozitif iyonizasyon modunda analiz edildi. Her kromatogramın sağ üst köşesindeki pasta grafiği, farklı kimyasal sınıflara atanan tanımlanmış lipitlerin ve metabolitlerin sayısını gösterir.

Örneğin, üst grafikte TAG olarak gösterilen triaçilgliserit grubuna 58 farklı lipid atandı. Ters fazlı malzeme üzerinde iyi tutma göstermeyen şekerler ve polar amino asitler gibi bu fraksiyondan daha fazla hidrofilik metabolit, GCMS veya hidrofilik etkileşim sıvı kromatografisi gibi diğer analitik yöntemlerle analiz edilebilir. Ekstraksiyondan elde edilen proteinler çözelti içinde sindirildi ve av tüfeği LCMS kullanılarak analiz edildi.

Sağ üst köşede gösterilen pasta grafiği, farklı biyolojik süreçlere atanan tanımlanmış proteinlerin sayısını gösterir. Örneğin, 268 protein lokalizasyon kategorisine atandı. Özetle, 200'den fazla lipid türü, 50 açıklamalı yarı polar metabolit ve birkaç bin protein, bu örnekte kullanılana benzer örneklerden rutin olarak tanımlanabilir.

Ek olarak, yöntem farklı dokular, organlar ve hücre kültürü materyali kullanılarak geniş uygulanabilirlik göstermiştir. Bu videoyu izledikten sonra, tek bir numuneden en temel bileşiklerin nasıl çıkarılacağını ve analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, tüm numuneleri donmuş halde tutmak, malzemeyi uygun şekilde öğütmek ve analitik dereceli çözücüler ve kimyasallar kullanmak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, ekstrakte edilen numunelerin moleküler bileşimini belirlemek için tüm analitik yöntemler kullanılabilir.