Enzim bazlı biyosensörlerin kullanılması Alzheimer Fare Modellerinde Tonik ve Fazik glutamat Ölçmek için

Bu prosedürün genel amacı, enzim bağlantılı Mikroelektrot Dizileri kullanarak in vivo tonik ve fazik hücre dışı glutamat değişikliklerini ölçmektir. Bu yöntem, hücre dışı nörotransmitter seviyelerinin ve nörotransmitter salınımının ve klerensinin hızlı dinamiklerinin hastalık durumlarında değişip değişmediği gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, Mikroelektrot Dizilerinin ayrı beyin bölgelerindeki spesifik nörotransmitter değişikliklerini ölçebilmesidir, bu da onu minimal invaziv olmakla birlikte mekansal ve zamansal olarak kesin bir yaklaşım haline getirir.

Prosedürü göstermek için laboratuvarımdan Holly Hunsberger ve Ryan Heslin olacak. Bu prosedüre başlamak için, istenen enzim ile bir MEA üzerinde bir çift kayıt bölgesi ve aktif olmayan protein matrisi ile farklı bir çift kayıt bölgesi kaplayın. Ardından, 10 mikrolitrelik bir Hamilton şırıngası kullanarak glutamat oksidaz veya protein matrisini çizin.

Şırınga ucuna küçük bir damla çözelti dağıtmak için pistona hafifçe bastırın. MEA kayıt bölgelerini hedeflemek için, bir diseksiyon mikroskobu altında, bir katmanı temsil eden çözelti damlacığı ile kayıt bölgelerine kısa bir süre temas ederek çözeltiyi uygun kayıt bölgelerine uygulayın. Kayıt bölgelerine kaplama uygulamaları arasında bir dakika için bir zamanlayıcı ayarlayın.

Şimdi, referans elektrodu plastik koldaki açıklıktan geçirin. Referans elektrodu PBS içeren bir behere indirin ve beherin tabanına temas etmediğinden emin olun. Ardından, referans elektrodu kafa aşamasına bağlayın ve MEA'yı kafa aşamasına kaplanmış mPD'ye bağlayın.

MEA'yı, yalnızca MEA ucu çözeltiye batırılacak şekilde çözelti kabına indirin. MEA ucunu siyah baloncuğun ötesinde sıvıya batırmayın. Bunu yapmak MEA'ya zarar verebilir.

Ardından, masaüstündeki galvanik simgeyi seçin. Galvanik kaplama aleti menüsünde doğru ayarların girildiğini doğrulayın. Ardından, galvanik kaplamayı bitirmek için çıkış yazılımını seçin.

mPD kaplı elektrot uçlarını DI su ile durulayın ve kalibrasyondan önce 24 saat saklayın. Bu prosedürde, 37 santigrat derecede bir ısıtma yastığını açın ve kafa aşamasını kayıt kontrol sistemine bağlayın. Ardından, MEA ucunu 40 mililitre karıştırılmış 0.5 molar PBS'ye yerleştirin.

Ardından, referans elektrodunu kafa aşamasına bağlayın. Hava kabarcığı olmadığından emin olmak için referans elektrot ucunu hafifçe vurun. Bundan sonra kayıt programını açın, ayarların doğru olduğundan emin olun, MEA numarasını seçin ve Kalibrasyon'a tıklayın ve başlat'a basın.

Dengeleme için beş ila 10 dakika bekleyin ve taban çizgisi stabilize olduktan sonra kalibrasyona başlayın. Ardından, Taban Çizgisi'ni seçin ve 500 mikrolitre askorbik asit ekleyin. Ardından, akım yeni bir sabit platoya ulaştığında Girişimsel'i seçin.

MEA uygun şekilde elektrolizle kaplanmışsa, herhangi bir değişiklik gözlenmemelidir. Daha sonra, 40 mikrolitre 20 milimolar L-glutamat ekleyin. Akım yeni bir sabit platoya ulaştığında, ilk ilaveyi analit olarak işaretleyin.

Toplam üç glutamat ilavesi için üç kez tekrarlayın. Ardından 40 mikrolitre dopamin ekleyin. Ve Test Maddesi'ni seçin.

Daha sonra 40 mikrolitre peroksit ekleyin. Test Maddesini seçin ve kalibrasyon bittiğinde durdur düğmesine tıklayın. Bu adımda, mikropipeti dört platin kayıt bölgesinin tümüne merkezi olarak yerleştirin ve yapışkan balmumu ve modelleme kili kullanarak MEA'nın 50 ila 100 mikrometre üzerine monte edin.

Bir DC adaptörü kullanarak, kırmızı pozitif kabloyu altın pim tarafında hazırlanan gümüş tele kelepçeleyin ve siyah negatif kabloyu platin banyo katoduna sıkıştırın. Ardından, DC adaptörünü takın ve doğru kaplama işlemini arayın. Banyo elektrodunda kabarcıklar görünmeli ve referans elektrot gümüş grisi bir renge dönmelidir.

Bu prosedürde, hayvanı stereotaksik cihaza yerleştirin ve başını stabilize etmek için kulak çubuklarını kullanın. Hayvanın sabitlendiğinden ve başının hareket etmediğinden emin olun. Ardından, steril bir pamuk aplikatörü kullanarak göz merhemi uygulayın.

Bundan sonra, kafayı bir düzeltici ile tıraş edin. Ve küçük cerrahi makas kullanarak kulakların yanındaki kürkü çıkarın. Daha sonra, alternatif olarak kafa derisine üç kez iyot ve ardından alkol uygulayın.

Bunu takiben, kafa derisinin ortasında bir kesi yapın ve cildi yayın. Steril bir pamuk ucuyla kanı emdirin ve bregma ve lambda görünümünü kolaylaştırmak için hidrojen peroksit uygulayın. Bregma ve lambda'nın dorsal-ventral ve medial-lateral bölgelerini ölçerek başın doğru şekilde konumlandırıldığından emin olun.

Bregma'daki koordinatları sıfıra ayarlayın ve hedef koordinatları işaretleyin. Ardından, işaretin etrafını delin. Daha sonra, MEA'yı kafa aşamasına takın.

Pipeti istenen ilk çözelti ile geri doldurun. Dışarı atılan çözeltinin incelenebilmesi için pipette çözelti olmadan bir boşluk bıraktığınızdan emin olun. Ardından, hortumu cam mikropipete takın.

MEA bağlıyken bregma'yı bulun ve koordinatları sıfıra ayarlayın. MEA'yı istenen koordinatlara getirin ve ucu beyne değene kadar MEA'yı yavaşça indirin. Daha sonra, dorsal-ventral koordinatı sıfırlayın ve ardından MEA'yı yavaşça beyne indirin.

Referans elektrodu, devreyi tamamlamak için beyinle hala sıvı teması halinde olacak şekilde MEA'dan uzak bir yere yerleştirin. Kayıt programında, istediğiniz kalibre edilmiş elektroda tıklayın ve ardından kayda başlamak için deney yap'a tıklayın. Kararlı bir taban çizgisi elde ettikten sonra, basınç ejektörünü 0.6 saniye ve 0.5 psi'ye ayarlayın ve çıkarmak için basınç ejektörü üzerindeki kırmızı düğmeye basın.

Enjeksiyon tabakası üzerinde hareket ettirilen zaman ve basıncın yanı sıra hacim işaretlerini kaydedin ve gerekirse not alın. Bundan sonra, mikropipet takılıyken MEA'yı çıkarın, DI suyla durulayın ve tüm kan gidene kadar gece boyunca PBS'ye batırın. Hipokampusun CA3 ve CA1 bölgelerinde, araçla tedavi edilen TauP301L farelerinde tonik glutamat seviyeleri önemli ölçüde artmıştır, bu da riluzol tedavisi ile zayıflatılan bir etkidir.

Burada, CA3'te potasyum klorür ile uyarılmış glutamat salınımının taban çizgisiyle eşleşen temsili kayıtları, riluzol tedavisinin, Vehicle-TauP301L farelerinde gözlenen glutamat salınımının genliğindeki önemli artışı azalttığını gösterdi. Potasyum klorürün lokal uygulaması, hücre dışı glutamatta hızla tonik seviyelere geri dönen güçlü bir artış üretti. Potasyum klorürün lokal olarak uygulanmasından sonra Taşıt ile tedavi edilen TauP301L farelerinde gözlenen DG, CA3 ve CA1'de önemli ölçüde artmış potasyum klorür uyarılmış glutamat salınımı riluzol tedavisi ile zayıflatıldı.

Hipokampusun bu kresil menekşe lekeli bölümü, CA3 ve CA1'deki MEA izlerinin yerini doğrular. Bu prosedürü denerken, el yazmasında listelenen sorun giderme adımlarını hatırlamak önemlidir. Örneğin, gürültülü sinyalleri azaltmak için sistemi topraklamayı ve adımları zamanında takip etmeyi unutmayın.