Antikor conjugates ilk değerlendirilmesi ile Viral kaynaklı peptidler hücresel birikimi artan ve tümör hedefleme artırmak için değiştirilmiş

Bu prosedürlerin genel amacı, ilk gelişim aşamalarında hedef hücreler ve tümörler içinde biriken antikor konjugatlarının özgüllüğünü ve etkinliğini değerlendirmektir, böylece sonuçta klinikte kullanılabilirler. Bu yöntem, nükleer lokalizasyonun verimliliği ve genel hücreler arası birikim gibi eşlenik alanların cevabına ilişkin kilit soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin bir avantajı, PET görüntüleme yoluyla araştırmacıların aday antikor konjugatlarının etkinliğini ve seçiciliğini değerlendirebilmeleridir.

Bu tekniklerin etkileri, kanserin tedavisine ve teşhisine kadar uzanır, çünkü etkisiz tümör hücresi birikimi, antikor konjugatları için bu uygulamalarda önemli bir sınırlamadır. Metin protokolüne göre bir kolik-asit nükleer lokalizasyon dizisi antikor konjugatını sentezledikten sonra, hedef TF1A hücrelerini 200 nanomolar 7G3 kolik-asit MLS antikor konjugatı ile tedavi edin. Modifiye edilmiş kontrol monoklonal antikorları ile tedavi edilen hücreleri içerir.

Konjugatlar bir saat boyunca 37 santigrat derecede ile altıncı antijen pozitif hücrelere beş kez 10 kez inkübe edin. Sonra süpernatanı çıkarın ve hücreleri üç kez yıkamak için bir mililitre buz gibi soğuk PBS kullanın. Taze ortam ekleyin ve hücreleri bir saat daha 37 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra,% 0.25 tripsin ve EDTA içeren 0.5 mililitre PBS ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derecede 30 dakikaya kadar inkübe edin. Daha sonra tripsini nötralize etmek için% 10 FBS ile 1,5 mililitre RPMI1640 ortamı kullanın. Hücreleri beş dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve hücreleri tekrar üç kez yıkamak için 0,5 mililitre buz gibi soğuk PBS kullanın.

Hücrelere 0,5 mililitre %1 PFA ve %1 sükroz ve PBS ekleyin ve sabitlemek için 30 dakika buzun üzerine koyun. Daha sonra hücreleri üç kez yıkamak için 0,5 mililitre buz gibi soğuk PBS kullanın ve örnekleri beş dakika boyunca 250 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra, hücrelere% 0.15 Triton X-100 ve PBS ekleyin ve beş dakika boyunca buz üzerinde geçirgenleştirin.

Ardından, buz gibi soğuk PBS ile hücreleri yıkayın ve santrifüjleme işlemini tekrarlayın. Hücreleri, Alexa Fluor 647'ye konjuge edilmiş bir antimirroring FC ikincil poliklonal antikorun mililitresinde iki mikrogram içeren 0.1 mililitre PBS'de askıya alın ve örnekleri karanlıkta oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Hücreleri beş dakika boyunca 250 kez G'de santrifüjleyin ve hücreleri üç kez yıkamak için 0,5 mililitre buz gibi soğuk PBS kullanın.

Daha sonra hücreleri 0,5 mililitre PBS'de askıya alın. Hücrelere mililitre propidyum iyodür başına 10 mikrogram ekleyin. Ardından, numuneyi bir cam kapak kızağı ile kaplamadan önce cam slaytlara 10 ila beşinci hücrelere bir kez monte etmek için montaj ortamını kullanın.

Hücreleri, ters çevrilmiş lazer taramalı konfokal mikroskopta Plan APO 60X yağa daldırma objektifi, sayısal açıklık 1.42 ile inceleyin. 488 nanometre argon lazeri ve 600 ila 650 nanometre için ayarlanmış spektral tarama prizmasını kullanarak PI floresansını tespit edin. AF 647 floresan için 633 nanometre helyum-neon lazeri ve 650 ila 700 nanometre için ayarlanmış spektral taramalı prizmayı kullanın.

PI ve AF 647'den 1024 x 1024 piksel, 2X çizgi ortalaması ile tüm hücre kalınlığı boyunca 0,5 mikron aralıklarla çekilen görüntüleri toplayın. Görüntüleri Z projeksiyonları olarak sunun. Hücreleri analiz etmek için, sitoplazmadaki hücre içi floresansın gruplanmış ve hücre yüzeyine yakın mı yoksa dağınık ve homojen mi olduğunu değerlendirin ve kaydedin.

Ayrıca hücre başına bağıl floresan yoğunluğunu da değerlendirin. Metin protokolüne göre radyoaktif işaretli kolik-asit NLS antikor konjugatını hazırladıktan ve konsantre ettikten sonra, bir ITLC şeridine 0,5 mikrolitre 0,1 molar PH5,5 sodyum sitrat veya ITLC eluent uygulayarak radyoetiketleme verimliliğini belirleyin. Şeridin bir otoradyografını oluşturun ve dijital bir görüntü elde edin.

Bağlı ve serbest Bakır-64 oranını elde etmek için dansitometri yapın. Serbest Bakır-64 içeriği %5'ten fazlaysa, numuneyi daha fazla konsantre edin. Bakır-64 hücresel birikim çalışmaları için, hücreleri daha önce tarif edildiği gibi bir, altı ve 24 saat boyunca 37 santigrat derecede 100 nanomolar Bakır-64 etiketli A14 konjugatı ile tedavi edin.

IL5R alfasitleri bloke etmek için hücreleri modifiye edilmemiş A14 ile ve reseptör aracılı içselleştirmeyi bloke etmek için dört santigrat derecede tedavi edin. Hücreleri yıkadıktan ve bu videoda daha önce gösterildiği gibi taze ortamla inkübe ettikten sonra,% 0.25 tripsin ve EDTA içeren 0.5 mililitre PBS ekleyin ve 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, hücreleri daha önce olduğu gibi nötralize edip yıkadıktan sonra, hücrelere plazma zarı lizis tamponu ekleyin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Plazma zarı parçalanmış hücreleri beş dakika boyunca 90 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve yeni bir tüpe aktarın. Bu, sitoplazmik fraksiyonu temsil eder.

Daha sonra çekirdekleri üç kez yıkamak için buz gibi soğuk PBS kullanın ve yıkamaları sitoplazmik fraksiyona ekleyin. Nükleer ve sitoplazmik fraksiyonları içeren şişelerin kapatıldığından emin olun, ardından ham sayıları megabekarile dönüştürmek için bunları Bakır-64 için kalibre edilmiş bir gama sayacına yerleştirin. Kısıtlı bir nükleer protein olan lamin AC için Western-Blot analizi yaparak çekirdek izolasyonunun kalitesini belirleyin; ve bol miktarda sitoplazmik protein olan Rab-7, toptan lizat, nükleer ve sitoplazmik fraksiyonlar üzerinde.

500 mikrolitre radyo-amino-çökeltme testi veya RIPA tamponu ve %1 2 ve% 4 NP-40 içeren plazma zarı lizis tamponu ile altı hücreye beş kez 10 muamele edin. Ayrıca, izole edilmiş nükleer proteinler elde etmek için izole edilmiş çekirdekleri 500 mikrolitre RIPA tamponu ile muamele edin. İzole edilmiş nükleer, sitoplazmik ve toptan proteinlere örnek hacminin dört katı soğuk aseton ekleyin ve eksi 20 santigrat derecede 60 dakika inkübe edin.

Numuneleri 10 dakika boyunca 13.000 kez G'de santrifüjleyin. Protein peletini yerinden çıkarmamaya dikkat ederek süpernatanı boşaltın. Daha sonra proteinleri çözmek için 100 mikrolitre PBS ekleyin.

Daha önce tarif edildiği gibi Western Blotting'i gerçekleştirdikten sonra, zarı 40 kilodalton moleküler ağırlık işaretleyicisinde ikiye bölün. Daha yüksek moleküler ağırlıklı proteinleri içeren lekeyi araştırmak için lamin-AC'ye özgü antikorlar kullanın ve zarın alt yarısını araştırmak için Rab-7'ye özgü antikorlar kullanın. Dört nodskit faresi içeren gruplarda, kuyruk damarına 20 ila 30 mikrogram radyoaktif işaretli A14 kolik-asit NLS antikor konjugatı, radyoaktif işaretli A14 NLS ve radyoaktif işaretli A14 enjekte edin.

Aynı gün, saniyedeki radyoaktif sayıları bir gram doku başına enjekte edilen doza dönüştürmek için beş megabecaril Copper-64 içeren silindirik bir fantomu PET tarayıcıya yerleştirin. 48 saat sonra, fareleri metin protokolüne göre uyuşturduktan sonra, bir fareyi izofluran için bir nosekon ile baş üstü yüzüstü pozisyonda bir PET tarayıcı masasına hızla aktarın. Normal bir örnekleme modu ayarı ve 250 ila 650 kiloelektron voltluk bir enerji penceresi kullanarak PET veri toplamayı başlatın.

Taramadan sonra, fareyi tarayıcıdan çıkarın ve tekrar kafese yerleştirin. Bu şekilde gösterildiği gibi, oklar, tripsinizasyon ile ve tripsinizasyon olmadan antikor konjugat birikimini değerlendirirken farkı göstermektedir. Tripsinizlenmemiş hücrelerde, hedef hücrenin yüzey reseptörlerinin aşırı ekspresyonu nedeniyle hücre içi birikim ve dağılımın değerlendirilmesi zordur.

Oklar, hücreler uygun şekilde tripnize edildiğinde iki antikor konjugat adayının hücre içi birikimi ve dağılımındaki farkı göstermektedir. Radyoaktif işaretli A14 kolik-asit NLS antikor konjugatı, IL5R alfa için nanomolar afinite gösterir. Radyoaktif işaretli A14 kolik-asit NLS antikor konjugatının artan konsantrasyonları ile, A14 kolik-asit NLS antikor konjugatının spesifik bağlanması, hem HT-1376 hem de HT-B9 hücrelerinde 3.5 nanomolar konsantrasyonlarda doygunluğa yaklaştı.

Gama sayımı, radyoaktif işaretli A14 kolik-asit NLS antikor konjugatından çekirdekteki ve sitoplazmadaki radyoaktivite artışının spesifik olduğunu ve zamanla arttığını ortaya koymaktadır. HT-1376 ve HT-B9 hücreleri, %1 2 veya %4 NP-40 içeren plazma-membran lizis tamponu ile inkübe edildi. HT-1376 ve HT-B9 hücreleri için, nükleer fraksiyonda bir veya% 2 NP-40 Rap-7 içeren lizis tamponu tespit edilmedi ve sitoplazmik fraksiyonda lamin AC tespit edilmedi.

PET görüntüleme, aday antikor konjugatlarının, antijen pozitif tümörleri, kırmızı ve mavi okları hedefleme yetenekleri ve ebeveyn peptit ile modifiye edilmemiş antikora kıyasla bunlarla ilişkili biyodağılım özellikleri açısından değerlendirilmesine olanak tanır. Gelişmiş bir antikor konjugatı potansiyelini seçmeye yardımcı olmak için tümördeki sinyal birikimi görülebilir. PET görüntüleme ayrıca karaciğer gibi sağlıklı dokularda aday antikor konjuge alımının değerlendirilmesine de olanak tanır.

Bu tekniklere hakim olduktan sonra, moleküler yüklerin hedeflenen tümör iletimi alanındaki araştırmacılar, endozom sıkışması nedeniyle tümör hücresi birikiminin engellendiği ek ajanları keşfedebileceklerdir.