Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis

Bu prosedürün genel amacı, embriyonik epitel hücre morfolojisini analiz etmek için canlı görüntüleme ve basit kantifikasyon yöntemlerini göstermektir. Bu, önce tüm alet ve aparatların hazır hale getirilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, kurbağa embriyolarından X explan'ı çıkarmak ve onları uzun süreli kültür için odalara yerleştirmektir.

Prosedürün üçüncü adımı, epitel hücrelerinin gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlüklü görüntülerini toplamaktır. Prosedürün son adımı, Görüntü J kullanılarak epitel hücrelerinin morfolojik ayrıntılarını ölçmektir.Sonuçta, yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile izlenen hücre alanlarını ve zar yoğunluklarını gösteren sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, ben Pittsburgh Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü'ndeki Davidson Laboratuvarı'ndan Sagar Joshi.

Bugün size canlı hücre görüntüleme ve Xenos lavia embriyonik epitel hücrelerinin kantitatif analizi için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü gerçek zamanlı hücre hücre iskeleti değişikliklerini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Hayvan şapkası kapaklarını kültürlemek için odalar hazırlamak için, özel bir akrilik hazneyi veya küçük bir naylon rondelayı 45 x 50 milimetrelik büyük bir kapak camına kapatmak için silikon gres kullanın. Hazneye üçte bir XMBS'de bir mililitre %1 BSA ekleyin. Küçük örtü astar parçalarını aynı çözelti ile kaplayın, oda sıcaklığında iki ila dört saat veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

X explan'ın cama yapışmasını azaltmak için, xs'ye aktarmadan hemen öncesine kadar hazneyi durulayın ve DFA ortamı ile doldurun, kapak astarı parçalarını da aynı şekilde durulayın. Daha sonra bunları, istenen MR NA ile bir ila dört hücre aşamasında mikro enjekte edilen DFA kültürü embriyolarından oluşan bir tabağa batırın, istenen aşamaya üçte bir XMBS'de sürükleyin. Embriyoları diseksiyon stereo mikroskobu altında bir DFA kabına aktarmak için eğimli bir açıklığa sahip bir transfer pipeti kullanın.

Bir hayvan CapEx bitkisini çıkarmak için embriyoları boyutlandırmak için forseps kullanın. Bir embriyoyu tek bir pozisyonda desteklemek için bir saç halkası kullanın. Hayvan direğinde küçük bir kesi yapmak için bir saç bıçağı kullanın.

Kesi uzatmak ve kapak ektodermini çıkarmak için tekrarlanan yumuşak fiske kesimleri yapın. Aynı şekilde üç veya dört x explan tüketim vergisi. Ve bunları hazırlanan kültür odasına taşımak için bir transfer pipeti kullanın.

Saç halkasını kullanarak, her X explan'ı, epitel odanın dibine bakacak şekilde konumlandırın. Forseps kullanarak. Ortasında bir kapak kayma parçası tutun.

Uçları silikon yağına batırın. Her X ex'in üzerine bir parça yerleştirin. Her parçayı küçük silikon gres damlaları ile hafifçe yerine sabitleyin.

X explan'ı aşırı kuvvetle tamamen parçalamamaya dikkat edin. Hazneyi DFA ile doldurun, haznenin üst kenarlarını silikon gres ile kaplayın. Ardından üst kısmı 24 x 40 milimetrelik bir kapak kaymasıyla

Hava kabarcıklarını azaltmak için hazne içindeki DFA seviyesini ayarlayın ve herhangi bir taşmayı temizlemek için doku kullanın. X bitkileri artık oda sıcaklığında bir gün boyunca kapalı odada uzun süreli olarak kültürlenebilir, konfokal bir mikroskobun 20 x objektifini yerine hareket ettirebilir. X explan'ı içeren hazneyi mikroskop tablasına yerleştirin ve parlak alan altında yerinde tutmak için haznenin üzerine küçük dengeleme ağırlıkları yerleştirin.

Odağı ayarlayın ve yüzeysel hücrelerin apikal uçlarını görselleştirmek için rota konumlandırmasını kullanın. Floresansa ve daha yüksek bir güç hedefine geçin. Explan epitelyumun tek görüntülerini veya hızlandırılmış videolarını toplamak için, mümkün olan en iyi görüntüyü elde etmek için çekimi ayarlayın.

Ayarlama ve görüntüleme ile ilgili ipuçları için bu protokolün yazılı kısmına bakın. Lazer gücünü mümkün olduğunca düşük tutmak. X explan epitelinin görüntülerini veya zaman atlamalı videolarını çekin.

Veri toplama ile ilgili öneriler için protokolün yazılı kısmına bakın. Konfokal görüntü dosyaları, veriler için çeşitli şekillerde çıkarılabilir. Burada, bio formats eklentisi ile Image J analiz yazılımı kullanılarak veri dosyalarının nasıl analiz edileceğine dair iki örnek verilmiştir.

Bir epitel hücresinin hücre alanını ölçmek için analiz menüsünü aşağı çekin ve ölçümleri ayarla'ya tıklayın. Araç çubuğundan seçim aracını seçin ve analiz menüsünde hücrenin ana hatlarını çizin, araçlar'ı ve ardından ROI yöneticisi'ni seçin. İlgilenilen bölgeleri açmak için yönetici, kontrol t tuşuna basın.

Anahattı ROI yöneticisine eklemek için, görüntüden istediğiniz kadar anahat seçin ve ekleyin. Ardından, ROI yöneticisinde ayarlanan ROI'yi kaydetmek için kaydet'e tıklayın. Hesaplama'ya tıklayın.

Sonuçlar penceresi artık her bir ROI'nin ölçülen alanlarını gösterecektir. Bir hücre zarının yoğunluğunu ölçmek için, görüntü J araç çubuğundan düz çizgi aracını seçin. Zar boyunca dik bir çizgi çizin.

Önceki örnekte olduğu gibi CTRL T tuşuna basın. Seçimi ROI yöneticisine eklemek için, analiz menüsünü aşağı çekin ve çizgi boyunca göreli yoğunlukların bir grafiğini oluşturmak için çizim profiline tıklayın. Grafiği görüntü olarak kaydetmek için, görüntülenen yeni çizim penceresinde kaydet'i tıklayın.

Dosyalamak için liste menüsünü aşağı çekin, ardından size eksize kesilmiş hayvan CapEx explan'ından embriyonik epitel hücrelerinin nasıl canlı görüntü alınacağını ve ölçüleceğini gösterdiğimiz gibi kaydedin. Bu işlemi yaparken, DFA'ya antibiyotik ve antibiyotik eklemeyi unutmamak önemlidir. Bakteri ve mantar üremesini caydırmak için, örtü kızaklarının altına eksplantlara bastırırken ekstra özen gösterin çünkü gerekenden daha fazla basınç ex ex'i parçalayabilir.

Maksimum kalitede görüntü verisi elde etmek için konfokal mikroskopta en uygun ayarlara sahip olmayı unutmamak da önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.