Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis

Bu prosedürün genel amacı, embriyonik epitel hücre morfolojisini analiz etmek için canlı görüntüleme ve basit nicelleştirme yöntemlerini göstermektir. Bu, öncelikle tüm araç ve gereçlerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise, kurbağa embriyolarından X explanların çıkarılması ve uzun süreli kültür için kameralara yerleştirilmesidir.

Prosedürün üçüncü adımı, epitel hücrelerinin yüksek çözünürlüklü görüntülerinin gerçek zamanlı olarak toplanmasıdır. Prosedürün son adımı ise Image J kullanılarak epitel hücrelerinin morfolojik detaylarının nicelleştirilmesidir. Nihayetinde, yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi aracılığıyla izlenen hücre alanlarını ve membran yoğunluklarını gösteren sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, ben Pittsburgh Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü'ndeki Davidson Laboratuvarı'ndan Sagar Joshi.

Bugün size Xenos lavia embriyonik epitel hücrelerinin canlı hücre görüntüleme ve kantitatif analiz prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü, gerçek zamanlı hücre sitoskelet değişikliklerini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Hayvan kalotlarını kültüre etmek için odacıkları hazırlamak amacıyla, özel bir akrilik odacığı veya küçük bir naylon pulu, 45 by 50 milimetre boyutlarında büyük bir lam üzerine silikon gres kullanarak sabitleyin. Odacığa, üçte bir XMBS içerisinde %1BSA'dan oluşan bir mililitre ekleyin. Küçük lam fragmanlarını aynı solüsyonla kaplayın ve oda sıcaklığında iki ila dört saat veya dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin.

X explanın cama yapışmasını azaltmak için, chamber'ı DFA medyumu ile durulayın ve doldurun; The xs'leri aktarmadan hemen önce, cover slip fragmanlarını da aynı şekilde durulayın. Ardından, bunları bir üçüncü XMBS içindeki, bir ila dört hücre aşamasında istenen MR NA ile mikroenjeksiyonu yapılmış ve istenen aşamaya gelmiş DFA kültür embriyolarının bulunduğu bir kaba daldırın. Embriyoları, bir diseksiyon stereo mikroskobu altında DFA kabına aktarmak için eğimli açıklığa sahip bir transfer pipeti kullanın.

Embriyoları eksize etmek ve hayvan CapEx implantı yerleştirmek için forseps kullanın. Bir embriyoyu sabit tutmak için saç döngüsü (hair loop) kullanın. Hayvan kutbunda küçük bir insizyon yapmak için saç bıçağı (hair knife) kullanın.

Kesiği genişletmek ve şapka ektodermini uzaklaştırmak için tekrarlanan yumuşak hızlı kesikler yapın. Üç veya dört adet eksplantı aynı şekilde çıkarın. Bunları hazırlanan kültür odasına taşımak için bir transfer pipeti kullanın.

Saç döngüsünü kullanarak, epitelyum tabakası odacığın tabanına bakacak şekilde her bir X explanı yerleştirin. Pens kullanarak, bir lamel parçasını merkezinden tutun.

Uçlarını silikon gresine batırın. Her bir X explan üzerine bir fragman yerleştirin. Her bir fragmanı, küçük silikon gresi noktalarıyla hafifçe sabitleyin.

X açıklığının aşırı kuvvetle tamamen kırılmamasına dikkat edin. Hazneyi DFA ile doldurun ve haznenin üst kenarlarını silikon gresi ile kaplayın. Ardından üst kısmı 24 x 40 milimetrelik bir kapatma lamı ile mühürleyin.

Hava kabarcıklarını azaltmak için hazne içindeki DFA seviyesini ayarlayın ve taşan kısımları bir doku yardımıyla kurulayın. X bitkileri artık kapalı haznede oda sıcaklığında bir gün boyunca uzun süreli olarak kültüre edilebilir; konfokal mikroskobun 20 x objektifini yerleştirin. X explanını içeren hazneyi mikroskop tablasına yerleştirin ve hazneyi parlak alan altında sabit tutmak için üzerine küçük dengeleme ağırlıkları koyun.

Yüzeysel hücrelerin apikal uçlarını görüntülemek için odağı ayarlayın ve kaba ayar düğmesini kullanın. Floresan moduna ve daha yüksek büyütmeli bir objektife geçiş yapın. Açılmış epitelin tekil görüntülerini veya zaman serisi videolarını toplamak için, mümkün olan en iyi görüntüyü elde etmek üzere görüntüleme ayarlarını optimize edin.

Ayarlama ve görüntüleme ipuçları için bu protokolün yazılı kısmına bakınız. Lazer gücünü mümkün olduğunca düşük tutun. x explan epitelyumunun görüntülerini veya zaman ayarlı (time-lapse) videolarını kaydedin.

Veri toplama önerileri için protokolün yazılı kısmına bakınız. Konfokal görüntü dosyaları çeşitli yollarla veri madenciliğine tabi tutulabilir. Burada, Bio-Formats eklentisine sahip Image J analiz yazılımı kullanılarak veri dosyalarının nasıl analiz edileceğine dair iki örnek verilmiştir.

Bir epitel hücrenin hücre alanını ölçmek için, analiz menüsünü açın ve ölçümleri ayarla seçeneğine tıklayın. Araç çubuğundan seçim aracını seçerek hücrenin çevresini belirleyin; analiz menüsünden araçlar'ı ve ardından ROI yöneticisi'ni seçin. İlgi bölgeleri yöneticisini açmak için kontrol t tuşlarına basın.

Taslağı ROI yöneticisine eklemek için, görüntüden istenilen sayıda taslak seçin ve ekleyin. Ardından, ROI setini ROI yöneticisine kaydetmek için kaydet (save) düğmesine tıklayın. Ölç (measure) düğmesine tıklayın.

Sonuçlar penceresi artık her bir ROI'nin ölçülen alanlarını gösterecektir. Bir hücre membranının yoğunluğunu ölçmek için Image J araç çubuğundan düz çizgi aracını seçin. Membran üzerinden dik bir çizgi çizin.

Önceki örnekte olduğu gibi CTRL T tuşlarına basın. Seçimi ROI yöneticisine eklemek için analyze menüsünü açın ve hat boyunca bağıl yoğunlukların grafiğini oluşturmak için plot profile seçeneğine tıklayın. Grafiği bir görüntü olarak kaydetmek için açılan yeni grafik penceresindeki save düğmesine tıklayın.

Liste menüsünden dosyaya gelin, ardından farklı kaydet seçeneğini kullanın. Size, çıkarılmış hayvan CapEx eksplantlarından embriyonik epitel hücrelerinin nasıl canlı olarak görüntüleneceğini ve nicelendirileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü gerçekleştirirken, DFA'ya antibiyotik ve antibiyotik eklemeyi hatırlamak önemlidir. Bakteriyel ve fungal büyümeyi önlemek için, eksplantları lameller altına bastırırken ekstra dikkat gösterin çünkü gereğinden fazla basınç eksplantın ezilmesine neden olabilir.

Maksimum kalitede görüntü verisi elde etmek için konfokal mikroskobun optimal ayarlara sahip olduğunu hatırlamak da önemlidir. Şimdilik bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.