Gıda kaynaklı patojen tarama kullanarak Manyeto-floresan Nanosensor: E. Coli O157: H7 hızlı tespiti

Bu protokolün temel amacı, E.coli O157:H7 gibi bakteriyel kirleticileri tespit edebilen çift modlu nanosensörler tasarlamak ve sentezlemektir. Manyeto-floresan nanosensörler, demir oksit nanopartiküllerinin iki aşamalı bir prosedürle işlevselleştirilmesiyle sentezlenir. İlk olarak, hedefleme antikorları nanopartikülün yüzeyine konjuge edilir.

Daha sonra floresan boya kodlamasına yüklenir. Bu modalitelerin ayrıştırılması, hem düşük hem de yüksek konsantrasyonlu çözeltilerde bakteriyel kirleticilerin hızlı ve hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Az miktarda bakteri varlığında, konjuge antikorların hedeflenmesi nedeniyle nanosensörler bakterilerin etrafında toplanacaktır.

Bu kaynaşma, nanosensörlerin manyetik çekirdeğinin çevredeki su protonları ile etkileşimlerini değiştirerek, manyetik gevşeme değerlerindeki değişikliklerin hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Çözeltilerdeki bakteriyel kirleticilerin konsantrasyonu arttıkça, sürü oluşturma azalır ve manyetik modalitenin kontaminasyonu ölçme yeteneği azalır. Bununla birlikte, bakteri konsantrasyonu arttıkça, biyo nanosensörlerin floresan sunumu da artar.

Bu nedenle manyetik ve floresan modalitelerin eşleştirilmesi önemlidir. Kombinasyon, dakikalar içinde E.coli O157: H7'nin bir koloni oluşturan birimi kadar küçük bir şeyin tespit edilmesine izin verdi. Manyeto-floresan nanosensörlerin sentezindeki ilk adım, hem feröz hem de demir klorürden oluşan bir demir tuzu çözeltisinin hazırlanmasıdır.

Ütü, nanosensörlere manyetik gevşeme platformlarına uyarlanabilirliğini sağlayan manyetik bir çekirdek sağlayacaktır. İhtiyaç duyulan ek çözeltiler poliakrilik asit ve amonyum hidroksittir. Hidroklorik asit, demir tuzu çözeltisine eklenir ve daha sonra girdaplama sırasında amonyum hidroksit çözeltisine eklenir.

Son olarak, poliakrilik asit çözeltisi eklenir ve elde edilen karışım, reaksiyon devam ederken bir saat daha girdaplanır. Elde edilen çözelti, daha büyük molekülleri çökeltmek ve 100 nanometreden daha küçük nanopartikülleri izole etmek için santrifüjlenir. Çözelti daha sonra saflaştırma için gece boyunca diyalize edilir.

Bir sonraki adım, yeni sentezlenen demir asit nanopartiküllerinin poliakrilik asit kodlamasına hedefleme antikorlarının konjugasyonudur. İhtiyaç duyulan malzemeler arasında MES tamponu, EDC, NHS ve seçilen antikorlar bulunur. EDC önce nanopartikül çözeltisine, ardından NHS'ye ve son olarak antikora eklenir.

Karışım daha sonra reaksiyon devam ederken üç saat boyunca bir masa üstü karıştırıcıya yerleştirilir. Çözelti, manyetik bir kolon kullanılarak saflaştırılır. Mıknatıslanmış kolon, nanopartikülleri yakalar ve yalnızca serbest yüzen antikorların çıkmasına izin verir.

Daha sonra kolon PBS tamponu ile yıkanır ve konjuge nanosensörler toplanır. Nanopartiküller daha sonra floresan boya ilavesi için hazırdır ve tespit için kullanılan ikinci anahtar modaliteyi sağlar. Nanosensörümüzün en önemli özelliklerinden biri, birçok nedenden dolayı önemli olan manyetik ve floresan modalitelerinin kombinasyonudur.

İlk olarak, modalitelerin kombinasyonu, her birinin diğerini çapraz kontrol etmesine izin verir, bu da günümüzde kullanılan farklı tanı platformlarının karşılaştığı en büyük engellerden biri olan yanlış pozitifler ve yanlış negatifler riskini büyük ölçüde azaltır. İkincisi, modalitelerin kombinasyonu, bakteriyel kontaminasyonu sadece tespit etmekle kalmayıp aynı zamanda niceliklerini de belirleyebileceğimiz aralığı büyük ölçüde genişletir. Nanosensörlerin hazırlanmasındaki son adım, nanopartikülün kodlanmasında floresan boyanın kapsüllenmesidir.

Bu, girdap girdaplama sırasında çözeltiye boya eklenerek ve daha sonra boyanın nanosensörün kodlamasına yayılması için daha fazla zaman tanıyarak elde edilir. Tamamen işlevsel hale getirilmiş nanosensörler daha sonra saflaştırma için son bir kez diyalize edilir. Nanosensörleri karakterize etmek için, boyut ve floresan gönderimi bir zetasizer ve bir floresan plaka okuyucu kullanılarak kaydedilir.

Nanosensörün küçük bir numunesi bir küvet su çözeltisine eklenir ve boyutun kaydedilmesi için zetasizere yerleştirilir. Floresan analizi için, nanosensörün bir örneği 96 oyuklu bir plakaya yerleştirilir ve floresan plaka okuyucusuna yerleştirilir. İdeal olarak, nanosensörler yaklaşık 70 nanometre çapında olacak ve 575 nanometrelik bir floresan sunumuna sahip olacaktır.

Nanosensörlerin sentezine ek olarak, laboratuvarda bakteri hedeflerini sağlamak için bakterilerin kültürlenmesi de gereklidir. Besin suyunda bir kültür hazırlamak için bir gliserol bakteri stoğu kullanılır. Bu çözeltinin daha sonra inkübe edilmesine izin verilir.

İlk inkübasyon dönemini takiben, çok çeşitli bakteri konsantrasyonları elde etmek için seri seyreltmeler gerçekleştirilir. Her konsantrasyondan yüz mikrolitre bir besin burgu plakasına kaplanır ve daha sonra 24 saat inkübe edilir. Bu inkübasyonu takiben, koloni oluşturan birimi veya her seyreltilmiş stoğun mil başına CFU sayısını belirlemek için her bir plakadaki koloniler sayılır.

Artık bakteri stok çözeltileri hazırlandığına göre, hazırlanan nanosensörlerle birlikte kullanılabilirler. Ve bu özel bakteri serotipinin onu diğer serotiplerden ayıran önemli bir yönü, diğer serotiplerle enfekte olursanız, enfeksiyon kapmak için birçok koloni oluşturan birime sahip olmanız gerektiğidir. Ancak bu özel E.coli'de 10 ila 100 CFU veya koloni oluşturan birimler size bir enfeksiyon vermek için yeterince iyidir.

Teknolojimiz öyle bir şekilde kurulmuştur ki, tek bir koloni bakteri kontaminasyonunu bile kaçırmazsınız. Manyetik gevşetmeölçerde okumak için çözeltiler hazırlamak için, önce 300 mikrolitre PBS bir Eppendorf tüpüne pipetlenir. Daha sonra bir bakteri stoğu örneği eklenir, ardından nanosensörler eklenir.

Çözelti daha sonra bir cam tüpe aktarılır ve buharlaşmayı önlemek için üstüne bir parça parafilm yerleştirilir. Cam tüp daha sonra daha büyük bir NMR tüpünün içine yerleştirilir ve manyetik gevşeklik ölçere yerleştirilir. Gösterildiği gibi bir temel T2 okuması elde etmek için bakteri içermeyen ve yalnızca nanosensör ve PBS içeren bir temel çözelti kullanılır.

Daha sonra çeşitli konsantrasyonlarda bakteri içeren solüsyonlar analiz için manyetik gevşemeölçere yerleştirilir ve T2 değerlerindeki değişiklikler nanosensörler ile bakteriler arasındaki bağlanmadan kaynaklanır. Gösterildiği gibi, bu modalite kullanılarak dakikalar içinde en az bir bakteri CFU'sunun varlığı tespit edilebilir. Bununla birlikte, bakteri konsantrasyonu arttıkça MR okuması daha az ölçülebilirdir, bu nedenle floresan subsmisyon verilerinin kullanılması da doğru bir bakteri miktar tayini ile eşdeğerdir.

Floresan verileri toplanmadan önce, numune önce santrifüjlenmelidir. Çözelti cam tüpten bir Eppendorf tüpüne aktarılır ve daha sonra santrifüjlenir. Bu, bakterileri ve ona bağlı nanosensörleri çözelti içinde serbest yüzen nanosensörlerden ayırır.

Süpernatan atılır ve bakteri peleti PBS'de yeniden süspanse edilir. Son olarak, numune floresan gönderimi yoluyla analiz edilebilir. Emisyonun gücü, çözeltide kalan nanosensör miktarına ve dolayısıyla mevcut bakteri miktarına bağlı olacaktır.

Görüldüğü gibi, bakteri konsantrasyonu arttıkça floresan girişi güçlenir ve daha hassas hale gelir. Bu nedenle, hem manyetik hem de floresan modalitelerin eşleştirilmesi, hem erken hem de geç gelişim aşamalarında bakteriyel kontaminasyonun tespit edilmesine ve miktarının belirlenmesine olanak tanır. PBS gibi basit çözeltilerde bakterilerin tespit edilmesine ek olarak, bu nanosensörler ayrıca göl suyu veya süt gibi daha karmaşık ortamlarda da çalışabilme yeteneğine sahiptir.

Ayrıca, bu nanosensörler, hedef olmayan bakterilerin ve ısıyla etkisiz hale getirilen hedef bakterilerin varlığında özgüllük açısından test edilmiştir. Gösterildiği gibi, manyeto-floresan nanosensörler, konjuge antikorların özgüllüğü nedeniyle hedeflenmemiş veya canlı olmayan bakterilerle çok az reaksiyona girer veya hiç reaksiyona girmez. Bu, diğer türlerin varlığındayken belirli bakterilerin tespiti için etkinliklerini gösterir.

Son olarak, bu nanosensörlerin diğer patojenlerin tespiti için de kolayca özelleştirilebileceğine dikkat etmek önemlidir. Laboratuvarımızda yaptığımız bu nanosensörleri bir ay içinde sentezleyebilir veya formüle edebilirsiniz. Bunu bir ay içinde yapabilirsiniz ve bu bir aylık ürün size 10 yıllık bir uygulama süresi verebilir.