Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ Hibridizasyon Salmonella Taze üretin

Bu prosedürün genel amacı, taze ürünlerin yapışkan bant bazlı örneklemesini, balık olarak da bilinen C iki hibridizasyonunda hızlı floresan kullanarak salmonella türlerinin tüm hücre moleküler tespiti ile birleştirmektir. Bu, önce istenen malzemeye yapışkan bant uygulanarak ve yüzeye bağlı hücrelerin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Hücre şarj bantları doğrudan analiz edilebilir veya katı veya sıvı faz zenginleştirmelerine tabi tutulabilir.

Prosedürün ikinci adımı, et suyuna dahil edilen veya et suyunda zenginleştirilmiş hücreler için bir etanol serisinde bant, kendi kendine fiksasyon ve dehidrasyondur. İkinci adım, süspansiyonda hücre fiksasyonunu ve ardından depolama tamponundaki hücrelerin Resus süspansiyonunu içerir. Prosedürün üçüncü adımı, bir salmonellaya özgü oligonükleotid prob kokteyli kullanılarak hızlı bir bant hibridizasyon adımının gerçekleştirilmesidir, ardından faks yoluyla analiz edilen numuneler için bir yıkama tamponu durulama ile fazla probun çıkarılmasıdır, balık adımı süspansiyon halinde gerçekleştirilir ve fazla prob, analizden önce basit bir seyreltme adımı kullanılarak çıkarılabilir.

Prosedürün son adımı, hibritleştirilmiş bant bağlı hücreleri DPI ile boyamak ve bunları floresan mikroskobu kullanarak incelemektir. Gerçeklere dayalı analizler için karşı lekeye gerek yoktur. Sonuç olarak, bu yöntem, numune alınan taze ürünlerde bulunabilecek salmonella türlerinin görsel veya sitometrik tespiti için bir araç sağlar.

Bu yöntem için ilk olarak, Roma aero taş kalıntıları üzerindeki bakteri topluluklarını incelemek için benzer bir yaklaşım kullanan bir İtalyan grubu hakkında okurken aklıma geldi. Ama r ve ben, gıda mikrobiyolojisinde hızlı yöntemler üzerine öğrettiğim bir sınıfta bu çalışma hakkında bir tartışma başlattık. Birkaç hafta sonra, taze ürünlere kadar izlenen bir salmonella salgını, 43 farklı eyalette yaklaşık 1500 kişiyi hasta etmeye başladı.

Deneysel yaklaşımımız, taze ürünlerdeki belirli bakteri türlerinin tespiti için zamanında ve pratik bir yol sunarken, aynı zamanda tarlada veya bir gıda üretim ortamında test yapılmasını sağlayacak kadar taşınabilirdir. Örnekleme için kullanılacak bir bant seçerek başlayın. Bazı seçenekler, steril olan ve ayrıca kullanım kolaylığı için paketlenmiş, ticari olarak temin edilebilen mantar bandını veya temaslıyı içerir.

Kalıcı bir işaretleyici ile, steril bir alüminyum şablon kullanarak 10 santimetrelik bir yapışkan bant parçasının hasta olmayan tarafına bir santimetre kareler çizin. Bu, yapışkan tarafı numune alınacak yüzeye bakacak şekilde CS şeklinde bir bant halkası oluşturan gıda veya çevresel yüzeyi numune almak için bandın hangi kısmının kullanıldığını not etmek için görsel bir kılavuz görevi görecektir. Bunu yapmak için, yapışkan uçları başparmak ve orta parmakla tutun ve işaret parmağını bandın arkasındaki çizilen kareye yerleştirin.

Bandı numune alınacak yüzeye yerleştirin ve bandın kenarlarını serbest bırakmadan işaretli alanı yüzeye hafifçe bastırın. Bandın yapışkan tarafının numune yüzeyi ile tam olarak temas ettiğinden emin olmak için işaret parmağını kullanın. Eşit bir hareket kullanarak baloncuklardan kaçınmak.

Bandı numuneden yavaşça çekerek çıkarın. Yüzeye bağlı mikropların fiziksel olarak çıkarılması hücre yükünü hızlandırır. Yapışkan tarafı yukarı bakacak şekilde bir cam mikroskop lamı üzerine bantlayın Jenerik şeffaf ofis bandı kullanarak, düz, kırışık olmayan bir yüzey oluşacak şekilde bandın uygun şekilde gerginliğini ve gerilmesini sağlayın.

Bu, bandın deformasyonu veya kıvrılması ile ilgili sorunları en aza indirmeye yardımcı olacaktır. Sonraki ısıtma sırasında. Hibridizasyon sırasında, bandın ağrı yüzeyinden kolayca çıkarılmasını kolaylaştırmak için örneklenen hücrelerin ağrı yüzeyi ile doğrudan temas halinde olması için bandı ksiloz dilimleme tertil dört veya XLT dört gri plakaya yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin.

Zenginleştirmeyi takiben, bandın şablonlu numune temas kısmı ağrı yüzeyi ile aynı hizada yerleştirilir ve bandın bir ucu gevşek bir şekilde yapıştırılır. Petri kabı plakalarının yan duvarı, yoğuşmayı önlemek için ters çevrilir ve 35 santigrat derecede inkübe edilir. Salmonella türlerinin yeterli büyümesine izin vermek için, hücreleri tespit edilebilir bir seviyeye zenginleştirmek için gereken kuluçka süresinin uzunluğu, başlangıçtaki salmonella kontaminasyon seviyelerine bağlı olacaktır.

İstenilen zenginleştirme süresinden sonra, agar plakasını açın, bant inkübasyon sırasında yapışkanlığını koruyacaktır. Oluşan mikro kolonilerin maksimum geri kazanımını sağlamak için işaret parmağınızı kullanarak bandı agar'a hafifçe bastırın Bant agar arayüzünde, bandı Petri kabının duvarına tutturulmuş kenardan kavrayın ve yavaş bir eşit hareketle çıkarın. Jenerik şeffaf ofis bandı kullanarak, hücre şarj bandını yapışkan tarafı yukarı bakacak şekilde bir mikroskop lamına monte edin, böylece düz, kırışık olmayan bir yüzey oluşturulur.

Numune temas alanını 500 mikrolitre %10 nötr tamponlu formin ile kaplayarak 25 santigrat derecede 30 dakika boyunca bant hücresi fiksasyonu üzerinde gerçekleştirin. Tahriş edici veya toksik buhara maruz kalmayı en aza indirmek için sabitleyiciyi kimyasal bir başlık altındaki sızdırmaz bir kaba atın, bandı bir x fosfat tamponlu tuzlu su veya PBS'de bir kez yıkayın, bant yüzeyini PBS ile hafifçe doldurarak numuneyi kurutun. Progresif bir etanol serisi kullanarak, bir nokta 22 mikrometre şırınga kullanarak ticari moleküler biyoloji sınıfı çözelti filtresini kullanarak ön hibridizasyon hibridizasyon ve yıkama tamponları hazırlayın ve hibridizasyonun ön ısıtmasını ve tamponları 55 santigrat dereceye kadar yıkayın.

Mikrolitre başına beş nanogramlık bir son prob konsantrasyonu için önceden ısıtılmış hibridizasyon tamponuna floresan etiketli oligonükleotid probları ekleyin, bandın şablonlu numune temas alanını, prob kokteyli ve hibritleştirilmiş bant bağlı hücreleri içeren 300 mikrolitre hibridizasyon tamponu ile kaplayın, doğrudan temaslı bir inkübatör için 55 santigrat dereceye ayarlanmış nemli sızdırmaz bir inkübasyon odasında, 15 dakika boyunca hibritleştirilmiş slayt modu enstrümanı gibi. Hibridizasyonun ardından, slaytlar çıkarılır ve hibridizasyon tampon kaplaması içeren prob atılır. Önceden ısıtılmış yıkama tamponu ile pipetleme ile kısa ve nazikçe durulayın.

Eğik bir slayt üzerinde küçük bir tampon hacmi, floresan mikroskobu ile salmonella türlerinin onap tespiti için slaytların havada kurumasına izin verir. Slaytı yaklaşık 10 mikrolitre vektör kalkanı H 1200, dpi içeren montaj ortamı ile kaplayın, nükleer karşı leke karanlıkta 10 dakika inkübe edilir. Daldırma yağını kapağa yerleştirin, kaydırın ve yüksek büyütmeli bir yağ objektifi kullanarak numuneleri inceleyin.

DPI filtresi, numuneyi odak noktasına getirmek için kullanılır. Mikroskop daha sonra uygun filtreye geçirilir ve salmonella hücreleri, probları etiketlemek için hangi boyanın kullanıldığına bağlı olarak yeşil veya kırmızı floresanlarına göre görsel olarak puanlanır. Ön sitrik algılama, PBS askıya alınmış numuneleri beş mililitrelik yuvarlak tabanlı numune alma tüplerine aktarın ve 647 nanometrede uyarmalı bir akış sitometresi kullanarak inceleyin.

FlowJo yazılımını kullanarak verileri analiz edin. Yapay olarak kontamine olmuş bir domatesin yüzeyinden terica serovar, Ty Murium'un yapışkan bantla örneklenmesi, mikroskopi veya akış sitometrisi hücre yükü yoluyla doğrudan balık sonrası analizi kolaylaştırır. Bantlar, salmonellaya özgü DNA problarının bir kombinasyonu kullanılarak C iki hibridizasyonunda hızlı floresan için işlendi ve bant üzerindeki salmonella hücrelerinin ilk yerel konsantrasyonuna bağlı olarak Texas Red ile etiketlendi.

Katı faz zenginleştirmesi, izole edilmiş mikro kolonilerden birleşik büyümeye kadar değişen sonuçlar verdi. Banttan örneklenen hücreler, örneklemeden hemen sonra veya beş saatlik bir sıvı yüzeyini takiben kombine balık ve akış sitometrisi yoluyla analiz edilebilir. 35 santigrat derecede mini kültür zenginleştirme.

Bant balığı tekniğinin gıda güvenliği için kullanımını tanımlamış olsak da, yöntem aynı zamanda çevresel mikrobiyoloji, bitki patolojisi veya klinik mikrobiyoloji dahil olmak üzere diğer disiplinlerde de kullanım için iyi bir potansiyele sahiptir. Bu prosedüre paralel olarak, bantla ekstrakte edilen numunelerden katı veya sıvı faz zenginleştirmeleri üzerinde biyokimyasal test veya PCR gibi ek deneyler yapılabilir. Testler, mevcut olabilecek bir salmonella ile ilgili soruları, balık prosedürünün kapsamı dışında kalan soruları yanıtlamak için kullanılabilir.