Name: Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ Hibridizasyon Salmonella Taze üretin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Keşfedin taze ürün yüzeylerinden Salmonella tespiti için yapışkan bant örnekleme ve floresan in situ hibridizasyon yöntemini. Bu hızlı moleküler teknik gıda güvenliği protokollerini geliştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

BFBS bir Iowa Değerler Büyüme Fonu ödülü tarafından bu iş için finansman sağlanmıştır.

1. Steril Yapıştırıcı Bant Yüzey Örnekleme <ol><li> Örnekleme için kullanmak üzere bir bant seçin. Piyasada bulunan Mantarlar-teyp veya Con-Tact örnekleme bantları kullanım kolaylığı için steril ve özel paketlenmiş. Ancak, şeffaf (optik açık) genel ofis bant da kullanılabilir olması bulduk. </li><li> , Yapışkan bant, 10 cm parça (bir kağıt şablonu kullanılabilir) yapışkan olmayan bir tarafında 1 cm 2 kare çizmek için kalıcı bir kalem kullanın. Bu bant kısmı gıda veya çevresel bir yüzeye örnek edildiği kaydetti için görsel bir kılavuz olarak görev yapacak. </li><li> Numune alınacak yüzeyine bakacak şekilde yapışkan tarafı ile "C" şeklindeki bant döngü oluşturur. Bunu yapmak için, arka (yapışkan olmayan tarafı) bant (Şekil 1) çizilmiş kare karşı başparmak, orta parmak ve pozisyon işaret parmağı ile yapışkan uçları tutun. </li><li> Numune alınacak yüzeyinde bant yerleştirin ve yavaşça yüzeye karşı işaretli alana basın. Bant kenarları bırakmadan, yapışkan bant yan kabarcıkları kaçınarak, numune yüzeyine tam olarak temas gelir sağlamak için parmağı kullanın. </li><li> Hatta bir hareket kullanarak, yavaş yavaş, fiziksel olarak yüzey bağlı mikropların açılan örnek uzak bant çekin. Cam bir mikroskop lamı üzerine, genel şeffaf ofis bant kullanarak, hücre ücret bant, yapışkan tarafı sabitleyin. Düz olmayan wrinkly bir yüzey oluşturulur, böylece bant düzgün gerginlik / germe olun. Bu bant hibridizasyon sırasında sonraki ısıtma sırasında deformasyon / kıvrık ile ilgili sorunları en aza indirmeye yardımcı olacaktır. </li></ol> 2. Katı-faz Zenginleştirme ve Sıvı Yüzey Miniculture <ol><li> Katı-faz zenginleştirme örneklenen hücrelerin agar yüzeyi ile doğrudan temas halinde yerleştirilir böylece Xylose Tergitol-lizin-4 (XLT-4) agar plaklarına yüzü aşağı bant yerleştirerek yapılır. Bant şablonu / örnek temas kısmı ile aynı hizada agar yüzeyi ve bandın bir ucunu gevşek zenginleştirme aşağıdaki agar yüzeyine bandı kolay çıkarılmasını kolaylaştırmak için Petri kabı yan duvarına yapıştırılır yerleştirilir. </li><li> Tabaklar ters (yoğunlaşma önlemek için) ve 35 inkübe - 37 ° C Salmonella spp yeterli büyüme izin verecek. Hücreleri tespit edilebilir bir seviyeye zenginleştirmek için gereken kuluçka süresinin uzunluğu ilk Salmonella kirlilik düzeylerine bağlıdır. Biz, 8 saat zenginleştirme sonra, düşük başlangıç ​​inocula mükemmel microcolony oluşumu gözlenen var. </li><li> İstenen zenginleştirme döneminden sonra, agar plaka açın. İnkübasyon sırasında bant yapışkanlık koruyacaktır. Agar-agar bant arayüzü oluşan mikrokoloniler maksimum iyileşme sağlamak için işaret parmağını kullanarak karşı bant hafifçe basın. Petri kabı duvara bağlı kenar bandı tutun ve yavaş bir hareket bile, onu kaldırmak. Yukarıdaki bölüm 1.5 'de açıklandığı gibi hücre ücret bant, yapışkan tarafı, bir mikroskop lamı üzerine monte edin. Aşağıda yer alan "Fiksasyon ve Dehidratasyon" adımı geçin. </li><li> Sıvı yüzey miniculture için, yukarıdaki bölüm 1.5 'te açıklandığı gibi, bir mikroskop lamı üzerine numune almak için kullanılan bant bağlayarak başlar. Sonra, oluşturan alt yukarı bakacak şekilde, hücre ücret bant oluşur yalıtılmış bir bölmede steril olmayan bir silikon perfüzyon odası (Coverwell, Grace Bio-Labs, Inc.) Bant şablonu / numune temas kısmı, kapsar. Sıkıca, ama nazikçe yerleştirin, su geçirmez bir mühür sağlamak için odasına basın. </li><li> Pipet, transferi ≤ 500 mcL Triptikaz Soya Broth ya da odasının küçük giriş limanlarından biri aracılığıyla diğer uygun zenginleştirme orta yükleme esnek bir jel kullanılması. 35 -37 buharlaşma ve inkübe slaytlar önlemek için, şeffaf ofis bant ile iki port Seal ° C yeterli zenginleştirme için gerekli gibi. Iyi bir numune alma ve işleme uygulamalarına göre tüm işlemler yapılmalıdır rağmen, port sızdırmazlık bandı veya perfüzyon odaları sterilite sıvı yüzey miniculture sırasında gerekli değildir. FISH ve flow sitometri kombinasyonu Salmonella spp açık bir ayrımcılık sağlayacaktır. hedef dışı bakterilerden örnek kendisinden gelmesi bekleniyor hedef olmayan flora en büyük katkı, mevcut olabilir. Aşağıda yer alan "Fiksasyon ve Dehidratasyon" adımı geçin. </li></ol> 3. Fiksasyon ve Dehidrasyon <ol><li> , Doğrudan yüzey örnekleme için veya katı faz zenginleşmesi için Salmonella spp . XLT-4 agar-teyp hücre fiksasyonu gerçekleştirmek az 30 dakika süreyle 25 ° C 500 mcL% 10 nötr ile örnek bir iletişim alanı kapsayan formalin solüsyonu. </li><li> Fiksatif yapışmalı, bir konteyner (toksik / tahriş edici buhar maruz kalma en aza indirmek için bir kimyasal kaputu altında) içine atın. </li><li> Etanol serisi (300 mcL / 3 dak Her konsantrasyon% 50,% 80 ve% 95) dehydrate. Aşağıda yer alan "hibridizasyon" adım devam edin. </li><li> 500 mcL sıvı yüzey miniculture örnek tespit içinlar, kaplanmadan perfüzyon odaları, ve esnek bir jel yükleme pipet enrichate ayıklamak için kullanılır. Aşağı yukarı hızlı ve pipetleme kalan herhangi bir bant bağlı hücreleri etkili bir şekilde çıkarılması sağlamak amacıyla kullanılacaktır. </li><li> Sonra, tüm 500 mcL miniculture hacmi mikrosantrifüj tüpüne transfer ve 2.000 xg (5 dk) aşağı döndü. Süpernatant atılır, pelet sonra% 10 eşit hacmi yeniden süspanse, 30-60 s için şiddetle vortekslenmiş olan nötr tamponlu formalin. Hücreler 30 dakika 25 ° C sabit </li><li> Sonra, fiksatif kaldırılır ve örnek hücre saklama tampon yeniden süspanse aşağıdaki gibidir. 60 s,% 50 denatüre etanol-% 50 eşit hacmi yeniden süspanse fosfat-numune 2.000 xg (5 dk, 25 ° C) süpernatantı atılır, pelet 30 şiddetle vortekslenmiş. Eğirilir tamponlu salin. Sabit hücreler, -20 ° C'de (yıl) süresiz olarak saklanabilir Not: sıvılar (örneğin, fiksatif veya farklı tampon tanıtan) değiştirilir zaman, iyice (vorteks) en az bir kısmında hücre pelet (~ 10 - 20 mcL) tekrar süspansiyon için önemlidir "giden" sıvı sistemi . Bu topaklanma önlemek ve tek tek hücreler bile süspansiyonları elde edilir olmasını sağlamak yardımcı olacaktır. Aşağıda yer alan "hibridizasyon" adım devam edin. </li></ol> 4. Melezleme <ol><li> Hibridizasyon / yıkama tampon ticari moleküler biyoloji dereceli çözümler Malzeme Tablo kaydetti kullanarak hazırlayın. Final tampon bileşeni konsantrasyonları 0,7 M NaCl, 0.1 M TRIS [pH 8.0, 10 mM EDTA,% 0.1 sodyum dodesil sülfat, 0.22 mikron bir şırınga ya da fincan filtre kullanarak molekül sınıfı su ve süzülür son İstenen hacme kadar yapılan. Sondalar (aşağıya bakın) ilavesi olmadan aynı tampon, bir çamaşır tampon olarak kullanılır. Onceden hibridizasyon ve tamponlar yıkama ile 55 ° C </li><li> Floresan etiketli ekle Sal3 (Nordentoft ve ark, 1997; 5'-AAT CAC TTC ACC TAC GTG-3 ') ve Salm-63 (Kutter ve ark, 2006; 5'-TCG ACT GAC TTC AGC TTK-3' Önceden ısıtılmış hibridizasyon tamponu) oligonükleotid problar (Malzeme Tablo). Toplam prob konsantrasyonu 5 ng mcL -1 (Bisha ve Brehm-Stecher, 2009a 2.5 ng mcL -1 her sonda) kullanılır. </li><li> Doğrudan-kaset ve katı faz zenginleştirme örnekleri için, prob kokteyl içeren hibridizasyon tamponu 300 mcL bant şablonu örnek temas alanı kaplaması ve 55 ° C'ye kadar nemli, kapalı kuluçka odasında bant bağlı hücrelerin melezleşme Slayt Moat aleti (Malzeme Tablosu) gibi bir doğrudan temas inkübatör kullanılması durumunda, örnekler 15 dakika süreyle melezleşmiştir ve&gt; 20 slayt aynı anda işlenebilir. Bambino aleti (Malzeme Tablosu) gibi, bir döner tarzı hibridizasyon fırın kullanılması durumunda, slaytlar hibridizasyon için 50 ml polipropilen santrifüj tüpleri, tüp başına bir slayt yerleştirilir. Isı transferi doğrudan olduğundan, bu örnekleri daha uzun süre (30 dakika kadar) için melezleşmiştir. </li><li> Hibridizasyon, slaytlar kaldırılır ve prob içeren hibridizasyon tampon kaplaması atılır. Slaytlar sonra önceden ısıtılmış yıkama tampon kaplaması ya (30 dakika kadar) ya da kısa ve hafifçe eğik bir slayt (300 mcL her 3 durular) üzerinde küçük bir tampon hacmi pipetleme tarafından önceden ısıtılmış yıkama tamponu ile durulanır, ya da resmi yıkanır Önceden ısıtılmış yıkama tamponu içeren 50 ml polipropilen santrifüj tüpüne daldırma. Deneyimlerimize göre, resmi bir yıkama gelişmiş sonuçları (bağlanmamış prob daha az bulanıklık) sağlayacak olsa da, basit bir durulama Salmonella spp net tespiti için yeterli olmaktadır. Sonra, slaytlar, aşağıdaki "Algılama" adıma geçmeden önce hava kuru. </li><li> Sıvı yüzey miniculture örnekleri Hibritleşme pelet vorteks ve dinç içeren 100 mcL önceden ısıtılmış hibridizasyon tamponu tabanda takip 2.000 xg'de 5 dakika (taze -20 ° C'de sabit veya depolama tamponda tutulan) numuneler iplik tarafından yapılır prob kokteyl. Örnekler 55 melezleşmiştir ° C 500 mcL önceden ısıtılmış yıkama tampon ilave edilerek takip eden bir ısı blok veya diğer uygun inkübasyon istasyonu (Malzeme Masa), 30 dk. Bant bağlı örnekler olduğu gibi, bu örnekler resmen için yıkanmış olabilir daha fazla inkübasyon 30 dakika 55 ° C yıkama tamponu, aralıklı vorteks bu. Alternatif olarak, numunelerin iyice analiz için hemen hasat (aşağıda) takiben, 500 mcL önceden ısıtılmış yıkama tampon eklenmesinden sonra vortekslenmiş olabilir. </li><li> Salmonella tespiti için hazırlık. flow sitometri ile, sıvı yüzey miniculture örnekleri 5 dakika boyunca 2.000 xg aşağı bükülmüş, süpernatantı atılır ve numuneler 300 mcL oda sıcaklığında yeniden süspanse (~ 25 ° C) PBS. Hibridizasyon ve analiz arasında bir gecikme beklenen ise, örnekleri uzak bir tesis taşıma ihtiyacınız varsa ya da numuneler önce ana buzdolabında veya buz üzerinde yapılan olabilirlizis. Alternatif olarak, numuneler hücre saklama tamponu (PBS ve mutlak etanol karışımı 50:50) transfer edilir ve kayda değer kayıpları olmadan bir hafta kadar -20 ° C'de tutulan olabilir prob-haiz floresan (Bisha ve Brehm-Stecher, 2009b) . </li></ol> 5. Bulma <ol><li> Salmonella spp-teyp tespiti için. floresan mikroskobu ile doğrudan-kaset ya da katı faz zenginleştirme örnekleri nükleer counterstain içeren 4 ~ 10 mcL Vectashield H-1200 montaj orta ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), bir kapak kayma ile monte, yerleştirilmiştir. sonra 10 dakika süreyle karanlıkta inkübe edildi. </li><li> Daldırma yağ kapağı astar üzerine yerleştirilir, ve örnekleri, yüksek büyütmeli yağ objektif (63x veya 100x) kullanılarak incelenir. DAPI filtre örnek odak noktası haline getirmek için kullanılır, mikroskop, daha sonra uygun filtre (yeşil ya da kırmızı, son-etiket probları için kullanılan boya bağlı olarak) ve Salmonella hücreleri açıldığında (floresans göre görsel gol Rakamlar 2 ve 3). </li><li> Sıvı yüzey miniculture örnekleri sitometrik tespiti için yerel olanaklara bağlı olarak, çeşitli aletler kullanılır. PBS-askıya örnekleri laboratuvarda, 5 ml yuvarlak alt örnekleme tüpleri (BD Falcon) aktarılır ve 647 nm (Malzeme Tablo) uyarma ile bir FACSCanto akış sitometresi kullanılarak incelenir. Yüksek sayılarda toplam bakteri içeren zenginleştirilmiş örnekleri için, "düşük akış hızı" ayarı (10 mcL min -1) kullanılır ve 5,000-50,000 olaylar toplanır. Veri FlowJo yazılımı (sürüm 8.8.6, Tree Star, Inc, Ashland, OR) veya başka uygun bir analiz yazılımı (Şekil 4, A ve B panelleri) kullanılarak analiz edilmektedir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Salmonella spp örnekleme için yapışkan bant kullanın. yapay olarak kontamine domates yüzeyinden. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Tipik bir domates (100 X yağ objektif) yüzeyinden doğrudan-kaset örnekleme ve Salmonella Typhimurium ATCC 14028 BALIK algılama sonuçlar Texas iki prob kokteyl Kırmızı etiketli sondalar (Sal3/Salm-63) kullanılır. bu hücrelerin etiket. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Salmonella Typhimurium ATCC 14028 mikrokoloniler 37 8 saat on-bant zenginleştirme ° C sonra ilk inokulum yapay olarak kontamine domates yüzeyinden örnekleri alındı ​​ksiloz Lizin Tergitol-4 (XLT-4) agar yüzeyinde oluşmuş. Katı-faz zenginleştirme tespiti için kullanılabilir hücre sayısını artırır ve aynı zamanda hücresel rRNA içeriğini arttırır. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. S. örnekleme için yapışkan bant kullanın enterica serovar Typhimurium FISH ve akım sitometri (panel A) aracılığıyla veya doğrudan analizi ile 500 mcL Triptikaz Soy Broth (panel B ile dolu bir perfüzyon odasında 5 saat non-selektif sıvı yüzey miniculture zenginleştirme sonra yapay olarak kontamine domates, yüzeyden .)

<ol><li>Almeida, C., Azevedo, N. F., Fernandes, R. M., Keevil, C. W., Vieira, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+method+using+a+peptide+nucleic+acid+probe+for+the+identification+of+Salmonella+spp.+in+a+broad+spectrum+of+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for the identification of Salmonella spp. in a broad spectrum of samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 4476-4485 (2010).</li>
<li>Barnetson, R. S., Milne, L. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+sampling+for+Candida+with+adhesive+tape%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Skin sampling for Candida with adhesive tape.</a> Br. J. Dermatol. 88, 487-491 (1973).</li>
<li>Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+adhesive-tape-based+sampling+of+tomato+surfaces+combined+with+rapid+fluorescence+in+situ+hybridization+for+Salmonella+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simple adhesive-tape-based sampling of tomato surfaces combined with rapid fluorescence in situ hybridization for Salmonella detection.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1450-1455 Forthcoming.</li>
<li>Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-through+imaging+cytometry+for+characterization+of+Salmonella+subpopulations+in+alfalfa+sprouts%2C+a+microbiologically+complex+food+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Flow-through imaging cytometry for characterization of Salmonella subpopulations in alfalfa sprouts, a microbiologically complex food system.</a> Biotechnol. J. 4, 880-887 (2009).</li>
<li>Edwards, R. W., Hartman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+collecting+fungus+specimens+from+infected+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Lloydia%22%5BJournal%5D)">A simple technique for collecting fungus specimens from infected surfaces.</a> Lloydia. 15, 39-39 (1952).</li>
<li>Evancho, G. M., Sveum, W. H., Moberg, L. J., Frank, J. F. Microbiological monitoring of the food processing environment. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEvancho%2C+GM+%22Compendium+of+Methods+for+the+Microbiological+Examination+of+Foods%22">Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods</a>. Pouch Downes, F., Ito, K. , 4th edition, American Public Health Association. Washington, D.C. (2001).</li>
<li>Fung, D. Y. C., Lee, C. Y., Kastner, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+tape+method+for+estimating+microbial+load+on+meat+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food.+Prot%22%5BJournal%5D)">Adhesive tape method for estimating microbial load on meat surfaces.</a> J. Food. Prot. 43, 295-297 (1980).</li>
<li>Kutter, S., Hartmann, A., Schmid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+barley+%28Hordeum+vulgare%29+with+Salmonella+enterica+and+Listeria+spp%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Colonization of barley (Hordeum vulgare) with Salmonella enterica and Listeria spp.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 56, 262-271 (2006).</li>
<li>La Cono, V., Urz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+applied+on+samples+taken+with+adhesive+tape+strips%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization applied on samples taken with adhesive tape strips.</a> J. Microbiol. Meth. 55, 65-71 (2003).</li>
<li>Lakshmanan, C., Schaffner, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+and+controlling+microbiological+contamination+of+beverage+dispensers+in+university+foodservice+operations%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Prot.+Trends%22%5BJournal%5D)">Understanding and controlling microbiological contamination of beverage dispensers in university foodservice operations.</a> Food Prot. Trends. 26, 27-31 (2005).</li>
<li>Langvad, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+method+for+qualitative+and+quantitative+study+of+the+fungal+flora+of+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid method for qualitative and quantitative study of the fungal flora of leaves.</a> Can. J. Microbiol. 26, 666-670 (1980).</li>
<li>Nordentoft, S., Christensen, H., Wegener, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+fluorescence-labelled+oligonucleotide+probe+targeting+23S+rRNA+for+in+situ+detection+of+Salmonella+serovars+in+paraffin-embedded+tissue+sections+and+their+rapid+identification+in+bacterial+smears%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a fluorescence-labelled oligonucleotide probe targeting 23S rRNA for in situ detection of Salmonella serovars in paraffin-embedded tissue sections and their rapid identification in bacterial smears.</a> J. Clin. Microbiol. 35, 2642-2648 (1997).</li>
</ol>

Basit ve hızlı yöntemler üretmek yüzeylerin patojenlerin saptanması için zamanında ve aksiyona yönelik veri sağlayan gıda kaynaklı hastalık azaltılmasına yardımcı olabilir. 1950&#39;lerden beri, çevre klinik ve gıda mikrobiyolojisi Yapıştırıcı bant tabanlı örnekleme yöntemleri kullanılabilir ve direkt mikroskobik inceleme ya da için sağlam bir medya yapışık mikroorganizmalar transferi, mikroorganizmaların giderilmesi için yüzeylere &quot;Scotch&quot; tarzı kaset basarak dahil edilmiştir var büyüme (Barnetson ve Milne, 1...

<table><tbody><tr><td>Fungi-Tape örnekleme bandı</td><td>Scientific Device Laboratory</td><td>745</td><td>http://www.scientificdevice.com/</td></tr><tr><td>Con-Tact-It örnekleme bandı</td><td>Birko Corporation, Denver, CO</td><td></td><td>http://www.birkocorp.com/</td></tr><tr><td>Şeffaf ofis bandı, jenerik</td><td>Çeşitli</td><td></td><td>Optik olarak şeffaf olmalı ve düşük iç floresans değerine sahip olmalıdır</td></tr><tr><td>Gıda yüzeyi</td><td>Yerel Bakkal/Market</td><td></td><td>Burada domat&amp;#8211;ler (dalında kırmızı domat&amp;#8211;ler, mumlanmamış veya yağlanmamış) kullanılmıştır</td></tr><tr><td>Trypticase Soy Broth</td><td>Difco Laboratories</td><td>211768</td><td>Selektif olmayan sıvı yüzey minikültür zenginleştirmesi için</td></tr><tr><td>Xylose-lysine-Tergitol 4 agar bazı</td><td>Difco Laboratories</td><td>223420</td><td>&lt;em&gt;Salmonella&lt;/em&gt;-selektif agar (XLT-4) için</td></tr><tr><td>Xylose-lysine-Tergitol 4 agar takviyesi</td><td>Difco Laboratories</td><td>235310</td><td>&lt;em&gt; Salmonella&lt;/em&gt;-selektif agar (XLT-4) için</td></tr><tr><td>Formalin çözeltisi </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5011</td><td>%10'luk çözelti, nötr, tamponlu (hücre tespit edici/fiksatif)</td></tr><tr><td>Absolüt etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Moleküler biyoloji saflığında (hibridizasyon öncesi dehidrasyon için)</td></tr><tr><td>1.5 ml mikrocentrifüj tüpleri</td><td>Çeşitli</td><td></td><td>RNaz ve DNaz içermeyen</td></tr><tr><td>Mikroskop lamları ve lamel kapakları</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td><td>Moleküler biyoloji saflığında, 5M çözelti (hibridizasyon tamponu bileşeni)</td></tr><tr><td>Tris-EDTA tampon çözeltisi (100X konsantre)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hibridizasyon tamponu bileşeni)</td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td>18 megohm su içerisinde %10'luk çözelti (hibridizasyon tamponu bileşeni)</td></tr><tr><td>Sal3 ve Salm-63 oligonükleotid probları</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-etiketli 6-karboksifloresein (FAM) veya Texas Red (mikroskopi için) veya Cy5 (sitometri için), HPLC-saflaştırılmış</td></tr><tr><td>Değişken hızlı mikrocentrifüj</td><td>Çeşitli</td><td></td><td>Protokolde belirtilen RCF değerleri için gereken RPM'yi hesaplamak amacıyla rotor çapını kullanın</td></tr><tr><td>CoverWell perfüzyon odası </td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td>PC1R-2.0</td><td>Steril olmayan</td></tr><tr><td>Jel yükleme pipet uçları (FS MultiFlex)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>05-408-151</td><td>Küçük örnekleme portlarına kolay erişim ve oda içinde manevra kabiliyeti için uzun, ince uçlar</td></tr><tr><td>Alüminyum ısı bloğu veya hassas kontrollü ısıtma istasyonu</td><td>Çeşitli</td><td></td><td>Burada Eppendorf Thermomixer R kuru blok ısıtma ve soğutma shaker kullanılmıştır</td></tr><tr><td>Bambino mini hibridizasyon fırını</td><td>Boekel Scientific</td><td>Model 230300</td><td>Lamlar hibridizasyon için 50 ml polipropilen santrifüj tüplerine yerleştirilir, ısı transferi doğrudan değildir</td></tr><tr><td>Slide Moat lam hibridizatörü</td><td>Boekel Scientific</td><td>Model 240000</td><td>Cam lam üzerinden hızlı ve doğrudan ısı iletimi sağlar</td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) içeren Vectashield H-1200 montaj medyumu</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Mikroskopi sırasında floresans sönümlenmesini minimize eder, DAPI karşıt boyama sağlar</td></tr><tr><td>Floresan mikroskop</td><td>Çeşitli</td><td></td><td>Burada Leitz Laborlux S kullanılmıştır</td></tr><tr><td>Dijital kamera</td><td>Çeşitli</td><td></td><td>Burada Canon PowerShot A640 kamera kullanılmıştır</td></tr><tr><td>Görüntüleme yazılımı</td><td>Çeşitli</td><td></td><td>Axiovision yazılım v. 4.6 (Carl Zeiss) kullanılmıştır</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td>Görüntülerin minimal işlenmesi için (farklı kanallarda çekilen görüntülerin üst üste bindirilmesi)</td></tr><tr><td>Akış sitometresi</td><td>Çeşitli</td><td></td><td>Kırmızı (647 nm) eksitasyon ile FACSCanto akış sitometresi (BD Biosciences, San Jose, CA) kullanılmıştır</td></tr><tr><td>Akış sitometrisi analiz yazılımı</td><td>Çeşitli</td><td></td><td>FlowJo yazılım v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) kullanılmıştır</td></tr></tbody></table>

yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve floresans kombinasyonu in situ</emhızlı algılama> hibridizasyon salmonella taze üretin

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Bu protokol, domates ve diğer taze ürün yüzeyleri yapışkan bant tabanlı örnekleme bant floresan in situ hibridizasyon (FISH) Salmonella spp hızlı kültür-bağımsız tespiti için takip için basit bir yaklaşım açıklanmıştır . Hücre ücret bantları da algılama önce katı faz zenginleştirme için seçici agar yüzü aşağı yerleştirilmiş olabilir. Alternatif olarak, düşük hacimli sıvı zenginleşmesi (sıvı yüzey miniculture), akım sitometri analizi ile FISH ve non-selektif suyu bant yüzeyi, yapılabilir. Başlamak için, steril yapışkan bant, taze ürün ile temas getirilen hafif basınç uygulanır ve bant fiziksel olarak bu yüzeyler üzerinde bulunan mikropların açılan kaldırılır. Bantlar cam mikroskop lamı üzerine yapışkan yüzü yukarı monte edilip edilmediğini ve örneklenen hücrelerin% 10 formalin (30 dk) ve kurutulmuş kademeli etanol serisi (50, 80, ve% 95; 3 dakika Her konsantrasyon) ile sabittir. Sonra, hücre ücret bantları Salmonella hedefli DNA prob kokteyl içeren tampon ile tespit ve 15 melezleşmiştir - 55 30 dk ° C, kısa bir bağlanmamış prob kaldırmak için bir çamaşır tamponunda durulama takip. BALIK-etiketli hücreleri, yapışkan sonra floresan mikroskopi kullanılarak izlenebilir boya 4 DNA &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ve sonuçları ile zıt olan. Katı faz zenginleşmesi için uygun bir seçici agar yüzeyinde, hücre ücret bantlar yüzü aşağı yerleştirilir ve yukarıda açıklandığı gibi, FISH ve mikroskopi takip Salmonella mikrokoloniler yerinde büyüme izin inkübe . Sıvı yüzey miniculture için, hücre ücret bantlar yapışkan tarafına yerleştirilir ve silikon perfüzyon odasının uygulanır, böylece bant ve mikroskop lamı formu, su geçirmez bir odasına alt Triptikaz Soya küçük bir hacmi (≤ 500 mcL) Broth (TSB) tanıtıldı. Giriş çıkış portları kapalı ve odaların 35 inkübe - 37 ° C, teyp çıkarılan mikropların büyüme tabanlı amplifikasyon sağlar. Inkübasyon sonrasında, giriş portları kaplanmadan, hücreler müstakil ve karışık kuvvetli geri ve ileri pipetleme, santrifüj yoluyla hasat ve% 10 oranında sabit nötr tamponlu formalin. Son olarak, örnekler melezleşmiştir ve Salmonella spp varlığını ortaya çıkarmak için akım sitometri yöntemiyle incelenir . Burada açıklandığı gibi, &quot;tape-FISH&quot; yaklaşımı domates yüzeylerde, basit ve hızlı bir örnekleme ve Salmonella algılama sağlayabilir. Ayrıca, ıspanak ve jalapeño biber taze ürünler de dahil olmak üzere diğer türleri, örnekleme için bu yaklaşım kullandık.

Bu protokol, ardından hızlı bir şekilde tüm hücre algılama, domates ve diğer taze ürün yüzeyler örnekleme için basit bir yapışkan bant tabanlı yaklaşım, açıklar<em&gt; Salmonella</em&gt; Floresan kullanarak<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH).

Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ</emHızlı Algılama> Hibridizasyon Salmonella Taze üretin

Bu protokol, domates ve diğer taze ürün yüzeylerinin yapışkan bant tabanlı örneklemesi ve ardından bant üzerinde floresan... ile gerçekleştirilen basit bir yaklaşımı açıklamaktadır.

Bu prosedürün genel amacı, taze ürünlerden yapışkan bant tabanlı örnekleme yöntemini, FISH (floresan yerinde hibridizasyon) olarak da bilinen hızlı floresan in situ hibridizasyon yöntemi kullanılarak salmonella türlerinin tüm hücre moleküler tespiti ile birleştirmektir. Bu işlem, önce yapışkan bandın istenen malzemeye uygulanması ve yüzeye bağlı hücrelerin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Hücre yüklü bantlar doğrudan analiz edilebilir veya katı veya sıvı faz zenginleştirmelere tabi tutulabilir.Prosedürün ikinci adımı, besiyerinde çözünmüş veya zenginleştirilmiş hücreler için bant üzerinde fiksasyon ve bir etanol serisi ile dehidrasyondur. İkinci adım, süspansiyonda hücre fiksasyonunu ve ardından hücrelerin saklama tamponunda yeniden süspansiyonunu içerir. Prosedürün üçüncü adımı, salmonella'ya özgü bir oligonükleotit prob kokteyli kullanarak bant üzerinde hızlı bir hibridizasyon adımı gerçekleştirmek ve ardından fazla probun bir yıkama tamponu ile durulanarak uzaklaştırılmasıdır; FISH yöntemiyle analiz edilen örnekler için FISH adımı süspansiyonda gerçekleştirilir ve fazla prob, analizden önce basit bir dilüsyon adımı kullanılarak uzaklaştırılabilir.Prosedürün son adımı, hibridize

combination-adhesive-tape-based-sampling-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada etiketleme olanak sağlayan bir...

Floresan immuno-Kimya tespiti için kullanılması Edwardsiella ictaluri Kanal kedibalığı ( I. punctatus) Örnekleri

Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, ve Typhimurium hızlı tespiti için bir multipleks PCR açıklar. Belirli Salmonella serovars, belirli bir serovar O-antijen biyosentezi küme ve flagellin benzersiz genler ve dizileri bir multipleks PCR hedef tespit edilebilir. Serovar hedef allel ilgili özel, boyut amplikonlarının (PCR ürünü) görünümünü dayalı izole Salmonella sonra atanır.

Allelotyping belirlenmesi için bir PCR Salmonella enterica Serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg ve Typhimurium

Biz son zamanlarda basit bir bakteriyel tespiti için floresan assay "mix-ve-okuma" kurmak için uygulanabilir Flourogenik DNAzyme probları üretmek için yeni bir yaklaşım bildirdin. Bu özel DNA sondaları böylece floresans sinyali kuşağa bakteriyel algılama çevirme belirli bakteri tarafından üretilen ham hücre dışı karışımı (CEM) varlığında, bir kromofor-değiştirilmiş-DNA RNA kimerik substratın bölünme katalize. Bu yazıda, "RFD-EC1" ifade belirli bir DNAzyme prob modeli bakterinin tespiti için...

Flourogenik DNAzymes kullanarak Bakterilerin Tespiti

Biz hızlı bakteri bulunması ve belirlenmesi için bir elektrokimyasal sensör test yöntem açıklanmaktadır. Tahlil, ribozomal RNA (rRNA) türe özgü dizileri için DNA oligonükleotid probları yakalama fonksiyonuna sahip bir sensör dizisi içerir. Yakalama prob ve yaban turpu peroksidaz bağlı DNA oligonükleotid dedektör prob ile hedef rRNA Sandwich melezleme ölçülebilir bir amperometrik akım üretir.

Elektrokimyasal Sensörler kullanarak Bakteriyel Algılama ve Tanıma

Bu çalışmanın genel amacı, bir perakende deli bir ortamda gıda kaynaklı patojen Listeria monocytogenes potansiyel çapraz kontaminasyon mekanizmasını göstermekti. Bu metodoloji, patojen kirlenme izlemek için farklı ortamlarda çeşitli tatbik edilebilir.

Floresan Tozu Kullanımı Perakende Ortamlarda Mikrobiyal Bulaşma Takip - Bir Perakende Deniz Çevre Örneği

Büyük hacimli tarımsal sularda gıda kaynaklı patojenlerin entegre konsantrasyon, zenginleştirme ve son nokta kolorimetrik tespitini içeren bir protokol burada sunulmaktadır.  Su, seçici veya seçici olmayan ortamlarla zenginleştirilmiş Modifiye Moore Swablarından (MMS) süzülür ve algılama, bakteriyel-gösterge kolorimetrik substratlarla gömülü kağıt bazlı analitik cihazlar (μPAD) kullanılarak gerçekleştirilir.

Kolorimetrik Algılama Paper-based<em&gt; Escherichia coli</em&gt;<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. Ve<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Tarım Su geniş hacimli

Hızlı algılama özellikle patojenik bakterilerin manyetik gevşeme ve floresan emisyon modaliteleri kombinasyonu ile hedef ve bu protokol genel amacı, düşük maliyetli, taşınabilir için fonksiyonel nanosensors sentez etmektir.

Gıda kaynaklı patojen tarama kullanarak Manyeto-floresan Nanosensor: E. Coli O157: H7 hızlı tespiti

Vibrio parahaemolyticus algılamak için polylactic asit-sağlamlık, altın nano tanecikleri değiştirilme tarihi, Serigrafi karbon elektrot oluşan bir elektrokimyasal DNA biyoalgılayıcı geliştirilmesi için bir protokol sunulmuştur.

Gıda kaynaklı patojen tespit etmek için bir elektrokimyasal DNA biyoalgılayıcı gelişimi

Salmonella spp. /Shigella spp. ortak patojenler için ishal atfedilen. Burada, biz yüksek üretilen iş platformu Salmonella spp. testi ile taranması için tarif / gerçek zamanlı PCR kullanarakShigella spp. rehberli kültürü ile kombine.

Salmonella spp. testi ile taranması için yüksek üretilen iş platformu /Shigella spp.

Burada, gıda ve çevre microbiomes DNA örnekleri uyumlu algılama ve Salmonella quasimetagenomic sıralama yoluyla subtyping hazırlamak için bir iletişim kuralı mevcut. Kombine kullanım kültürü zenginleştirme, immunomagnetic ayrılık (IMS) ve birden çok deplasman amplifikasyon (MDA) Gıda ve çevre örnekleri Salmonella genomik DNA'ın etkili konsantrasyon sağlar.

Metagenomic yarı analiz Salmonella gıda ve çevre örnekleri

Döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP), patojen tespit alanında geniş ilgi gören bir izotermal nükleik asit amplifikasyon testidir (iNAAT). Burada, Salmonella'yı hayvansal gıdalarda taramak ve tahmin edilen Salmonella'yı kültür izolasyonundan doğrulamak için hızlı, güvenilir ve sağlam bir yöntem olarak çok laboratuvar onaylı bir Salmonella LAMP protokolü sunuyoruz.

Hayvansal Gıdalarda Salmonella Taramak ve Salmonella'yı Kültür İzolasyonundan Doğrulamak için Döngü Aracılı İzotermal Amplifikasyon

Keşfedin taze ürün yüzeylerinden Salmonella tespiti için yapışkan bant örnekleme ve floresan in situ hibridizasyon yöntemini. Bu hızlı moleküler teknik gıda güvenliği protokollerini geliştirir.

Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ Hibridizasyon Salmonella Taze üretin

Daha fazla video keşfet