Bağdaşık süper çözünürlük ve elektron mikroskobu Zebra balığı Retina Protein yerelleşme gidermek için

Bu mikroskopi yönteminin genel amacı, süper çözünürlüklü ve taramalı elektron mikroskobu görüntülerini ilişkilendirerek larva zebra balığı retinasındaki farklı hücre altı organellerle ilişkili olarak protein ekspresyonunu hassas bir şekilde lokalize etmektir. Bu yöntem, mutantlarda protein yanlış lokalizasyonunun incelenmesi gibi retina gelişimi ve hücresel yol alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, numunenin yapısal bağlamında son derece hassas protein lokalizasyon verileri elde etmek için süper çözünürlüğü taramalı elektron mikroskobu ile birleştirmesidir.

Silikon gofretler üzerindeki Tokuyasu bölümlerinin toplanması, kullanımı önemli ölçüde kolaylaştırır ve kontrast için platin gölgelemenin kullanılması, numunenin iyi bir topografyasını sağlar. Bu nedenle, bu yöntem larva zebra balığı retina çalışmaları hakkında fikir verebilir. En büyük avantajlarından biri, fare dokusundaki protein ekspresyonunun tanımlanması gibi diğer birçok biyolojik sisteme de uygulanabilmesidir.

Metin protokolüne göre sabit zebra balığı larvalarından gözleri inceledikten sonra, PBS'de 15 mililitre% 12 yerel gıda markası jelatini 40 santigrat derecede ısıtın. Daha sonra PBS'yi göz tüplerinden aspire edin ve jelatin çözeltisini ekleyin. Jelatinin numuneye sızdığından emin olmak için tüpe hafifçe vurun ve 40 santigrat derecede 10 ila 30 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak bir termoblokta veya bir su banyosunda inkübe edin.

40 santigrat derecelik bir su banyosunda, 12'ye beşe üç milimetre silikon veya polietilen düz gömme kalıplarını ılık jelatin ile doldurun. Daha sonra bir pipet kullanarak kalıp başına iki göz ekleyin ve bir dürbün altında bunları düzgün bir şekilde hizalamak için bir diseksiyon iğnesi kullanın. Jelatinin oda sıcaklığında bir dakika soğumasına izin verdikten sonra, sertleşmesi için 20 dakika boyunca dört santigrat dereceye koyun.

Dürbünün altında, jelatin bloğu blok başına bir göze sığacak şekilde yeniden kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Jelatin gömülü gözleri buz üzerinde PBS'de 2.3 molar sükroza aktarın. Numuneleri gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra numuneleri taze 2.3 molar sükroz çözeltisi ile değiştirin. Ve dokuyu birkaç aya kadar saklamak için dört santigrat derecede veya eksi 20 santigrat derecede saklayın. Jelatin bloğu bir kriyo pimine aktarmadan önce neredeyse göz boyutuna kadar yeniden kesin.

Daha sonra bloğu sıvı nitrojen içinde dondurun ve bir kriyo-ultramikrotom içine aktarın. Kriyo-ultramikrotomda bir elmas bıçak kullanarak eksi 120 santigrat derecede 110 nanometre kalınlığında bölümler kesin. % 2 metilselüloz ve 2.3 molar sükroz çözeltisi içeren bir damla içeren kablolu bir halka ile bölümleri seçin.

Ardından bölümleri yediye yedi milimetrelik bir silikon gofrete aktarın. Gofretleri yıkamak için dört damla pipetleyin ve gofretleri damlaların üzerine baş aşağı yerleştirin. Gofretleri damlalar üzerinde sıfır santigrat derecede 20 dakika inkübe edin.

Daha sonra gofretleri PBS'de oda sıcaklığında iki kez iki dakika yıkayın. Numuneleri PBS'de% 0.15 glisin içinde her biri bir dakika boyunca üç kez inkübe edin. Ardından, numuneleri yıkama başına bir dakika boyunca üç kez yıkamak için PBS'yi kullanın.

Dokuyu PBG ile beş dakika önceden inkübe edin. Ardından, bölümlere PBG'de tavşan anti-Tom20 ekleyin. Ve gofretleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

PBG ile, mendili her yıkamada bir dakika boyunca altı kez yıkayın. Daha sonra numuneleri PBG ile oda sıcaklığında beş dakika önceden inkübe edin. PBG'yi PBG'deki Alexa 647 anti-tavşan iki değerlikli Fab parçalarıyla değiştirin ve 30 dakika inkübe edin.

Numuneleri PBG'de yıkama başına bir dakika boyunca altı kez yıkayın. Ardından gofretleri iki dakika boyunca üç kez yıkamak için PBS kullanın. Gofretlere DAPI ve PBS ekleyin ve 10 saniye inkübe edin.

Ardından, numuneleri her biri iki dakika boyunca iki kez yıkamak için PBS kullanın. Gofret'i bire bir %80 gliserol çözeltisi ve bir oksijen süpürme sistemi içeren görüntüleme tamponundan oluşan bir damlacık üzerine yerleştirin ve kısa bir süre inkübe edin. Gofretleri, doku tarafı aşağı bakacak şekilde, cam tabanlı bir Petri kabı üzerinde bire bir %80 gliserol ve görüntüleme tamponu karışımından taze bir damla üzerine aktarın.

Gofretin altındaki sıvının çoğunu çıkarmak için her taraftan bir pipet kullanın. Ardından gofreti Petri kabının dibine sabitlemek için silikon şeritler kullanın. Monte edilmiş bölümleri, yüksek sayısal açıklıklı yağa daldırma objektifine sahip ters çevrilmiş bir mikroskop üzerine yerleştirin.

Görüntülemeden önce, yanal ve eksenel kaymayı en aza indirmek veya azaltmak için numunenin mikroskop sıcaklığına dengelenmesini bekleyin. İlgi alanını ortalayın ve geniş alan epifloresan referans görüntüleri elde edin. Süper çözünürlüklü çalışma moduna geçin.

Kameranın pozlama süresini 15 milisaniyeye ayarlayın ve elektron çarpma kazancını maksimum 300'e ayarlayın. Ardından, numuneyi maksimum lazer gücünde 642 nanometre lazerle epifloresan modunda aydınlatın. Tek molekül yanıp söner sönmez her çerçevede iyi bir şekilde ayrılır, böylece tek tek sinyallerin örtüşme olasılığı düşüktür, lazer gücünü neredeyse 1/3'e düşürün.

En az 30.000 kare elde ederek ham görüntüyü epifloresan olarak kaydedin. Ham verilerden, Araçlar altında, t-Serisi Analizi 30 fotonluk bir algılama eşiği kullanır. Bir yerelleştirme etkinlik listesi oluşturmak için Değerlendir'e tıklayın.

Araçlar altında, Etkinlik Listesi İşleme panelinde, dört nanometrelik bir görüntü oluşturma pikseli boyutu uygulayarak Gauss sığdırma ile süper çözünürlüklü görüntüyü görselleştirmek için Görüntü Oluştur'u tıklatın. Silikon şeritleri çıkarın ve Petri kabından kaldırmak için gofretin kenarlarına yakın bir damla PBS ekleyin. Gofret'i her biri iki dakika boyunca iki kez yıkamak için PBS'yi kullandıktan sonra, beş dakika boyunca sabitlemek için PBS'de% 0.1 glutaraldehit kullanın.

Daha sonra numuneyi PBS'de yıkama başına iki dakika boyunca iki kez tekrar yıkayın. Gofret'i bir damla %2 metilselüloz içinde su içinde inkübasyon başına beş dakika boyunca iki kez buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra gofreti bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve 90 saniye boyunca 14, 100 kez g'de santrifüjleyin.

Döndürme işleminden sonra, gofreti bir SEM alüminyum saplama üzerine monte etmek için iletken karbon çimentosu kullanın. Bir elektron ışını buharlaştırma cihazı kullanarak, aşağıdaki ayarlarla döner gölgeleme yaparak numune üzerine iki ila 10 nanometre platin karbon tabakası ekleyin. 1,5 kilovoltta, iki milimetre çalışma mesafesinde taramalı elektron mikroskobu ve lens içi ikincil elektron dedektörü ile görüntü kesitleri.

Dosya, Aç'a tıklayarak hem ışık hem de elektron mikroskobu görüntülerini açmak için Fiji'yi kullanın. Görüntü, Ayarla, Tuval Boyutu'na tıklayarak tuval boyutunu ayarlayın. Ardından, Görüntü, Yığınlar, Yığınlanacak Görüntüler'e tıklayarak her iki görüntüyü de bir yığına getirin.

Fiji'de, Dosya, Yeni, EM2 yeni parça'ya tıklayarak yeni bir parça EM2 arayüzü açın. Siyah pencereye sağ tıklayıp Yığını İçe Aktar'ı seçerek her iki görüntüyle birlikte yığını içe aktarın. Işık mikroskobu görüntüsünü, görüntüye sağ fare tıklamasını kullanarak ve Hizala, Katmanı yer işaretleriyle manuel olarak hizala'yı seçerek elektron mikroskobu görüntüsüne yer işaretleriyle manuel olarak hizalayın.

Yer işaretleri eklemek için Seçim aracını seçin. Her iki görüntüde de aynı kenarları seçmek ve birkaç nokta eklemek için çekirdeğin şeklini referans olarak kullanın. Sağ tıklayarak bir afin modelle hizalama uygulayın ve Dönüştürme uygula, Afine Model'i seçin.

Son olarak, hizalamanın kalitesini değerlendirmek için katman şeffaflığını değiştirin. Bu panel, döllenmeden beş günlük sonra zebra balığı retina bölümünün düşük büyütmeli geniş alan görüntüsünü gösterir. Aynı alan burada taramalı elektron mikroskobu ile gösterilmiştir.

Bu daha yüksek büyütme oranlı görüntüler, mitokondride kümelerle kırmızı renkte Tom20 lekelenmesini göstermektedir. Tom20'nin ifadesi burada GSDIM mikroskobu tarafından tespit edildiği gibi gösterilmiştir. Bu görüntüde, aynı bölüm bağıntılı süper çözünürlük ve taramalı elektron mikroskobunu birleştiriyor.

Tom20 boyama, mitokondrinin dış zarlarındaki mitokondriyal küme içinde görülür. Çekirdeklerdeki floresan DAPI sinyali, SEM görüntüsünün topografyasına karşılık gelir. Bu SEM görüntüsü, GSDIM görüntüsündeki Tom20 boyamaya bağlam sağlar.

Mitokondriyal kristalar açıkça görülebilir ve Tom20 boyaması mitokondrinin dış zarlarına lokalizedir. Foto reseptörlerin dış segmentinin zarları açıkça çözülür. Bu prosedürü denerken, etiketleme ve görüntüleme parametrelerinizi mümkün olan en iyi şekilde optimize etmeyi unutmamak önemlidir.

Süper çözünürlük için yalnızca en uygun şekilde etiketlenmiş numuneler uygundur. Numuneler, etiketleme prosedürü sırasında hiçbir zaman kurumamalıdır. Bu prosedür, çift etiketli immünofloresan için genişletilebilir ve böylece belirli bir yapı içinde iki farklı proteinin lokalizasyonuna izin verebilir.

Daha karmaşık numuneler söz konusu olduğunda, görüntülerin hassas bir şekilde hizalanmasını sağlamak için referans işaretleyicilerin kullanılması önerilir. Bu videoyu izledikten sonra, karmaşık bir doku örneğinde hücrenin farklı organelleri ile ilişkili olarak proteinleri lokalize etmek için süper çözünürlüklü hassasiyetle korelasyon çalışmalarının nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.