C. elegans gen ifade seviyeleri sırasında ömrü modülasyon altında geniş menzilli diyet kısıtlama tarafından kodlanmış bilginin bir miktar

Bu çerçevenin genel amacı, geniş kapsamlı diyet kısıtlamasında yer alan genleri tanımlamak, ekspresyon seviyeleri tarafından kodlanan çevresel bilgileri ölçmek ve çevreyi yaşam süresine bağlayan temel kodlama stratejisini anlamaktır. Bu yöntem, yaşlanmanın nörobiyolojisi alanında, hangi genlerin yaşam süresini modüle etmek için çevreden bilgi ilettiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu çerçeve, C Elegan duyusal sistemi hakkında bilgi sağlayabilse de, çevresel bilgileri işlemek için bileşenleri işbirliği yapan herhangi bir biyolojik sisteme daha genel olarak uygulanabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, nöron grupları tarafından kodlanan çevresel bilgileri nicelleştirmesi ve bu bilgiyi aşağı akış hedeflerine iletmek için nöroselquites tarafından kullanılan kodlama stratejisini belirlemesidir. OP50'yi metin protokolüne göre MGM plakaları üzerinde kültürledikten sonra, iki litrelik erlenmeyer şişelerinin her birinde 500 mililitre LB ortamı hazırlayın ve bunları otoklavlayın. Her şişeyi tek bir OP50 kolonisi ile aşılayın ve kültürleri yaklaşık 14 saat boyunca 37 santigrat derece ve 200 RPM'de büyütün.

Daha sonra, kültürleri mililitre streptomisin başına 50 mikrogram ile destekleyin. Ardından, şişeleri 15 dakika boyunca buzun üzerine koymadan önce şişeleri 37 santigrat derecede 30 dakika daha çalkalayın. Her kültürün 450 mililitresini ayrı 500 mililitrelik steril santrifüj şişelerine aktarın, bakteri konsantrasyonunu belirlemek için kullanılacağı için kalan kültürü buz üzerinde tutun.

Şişeleri 4500 x G ve dört santigrat derecede 25 dakika döndürün, ardından süpernatanı atın ve şişeleri buz üzerinde saklayın. 900 mikrolitre steril LB ile, her şişeden 100 mikrolitre artık kültürü seyreltin. Spektrofotometreyi sıfırlamak için bir mililitre steril LB kullanın ve ardından her kültürün 10 kat seyreltmesinin OD600'ünü belirleyin.

Örneğin, gece boyunca kültürün 10 kat seyreltilmesinin OD600'ü 0.28 ise, o zaman kültürün gerçek OD600'ü 2.8'dir. Bu örnekten, mililitre başına 1.12 x 10 ila 10. OP50 hücresi arasında bir çalışma stok çözeltisine ulaşmak için, bu da 56'lık bir OD600'e eşittir, peleti 450 mililitre kültürden orijinal hacmin 20'de birinde yeniden süspanse edin veya mililitre streptomisin başına 50 mikrogram ile desteklenmiş 22.5 mililitre steril S bazal çözeltisi veya SB. SB ve strep deneylerinde kullanılan tüm sonraki konsantrasyonları, bu tabloda listelenen seyreltme faktörlerini kullanarak, çalışma stoğunun seri seyreltmelerinden yapın.

C Elegans muhabir suşlarını metin protokolüne göre kültürledikten ve senkronize ettikten sonra, solucanları üç plakadan seri olarak yıkamak için 15 mililitre SB kullanın ve sıvıyı steril 15 mililitrelik bir tüpte toplayın. L4 larvalarının doğal olarak çökelmesine izin verin ve ardından sıvının yaklaşık 0,5 mililitresi hariç hepsini aspire edin. Yabani tip muhabir suşlarında, bu tip L4.In mutant arka plandan daha genç larvaları uzaklaştırır, bu adım, bir OK3125'in ölümü durumunda, bizimki gibi tutuklanan larvaların uzaklaştırılmasına yardımcı olur.

Ardından, solucanları yeniden askıya almak için dokuz mililitre SB kullanın. Yine, L4 larvalarının sedimantasyon hızını izleyin ve ardından işlemi tekrarlamadan önce L4 larvalarının çoğu peletlendikten sonra süpernatantın yaklaşık 0,5 mililitresi hariç hepsini aspire edin. L4 larvalarını içeren sıvıya% 0.1 pluronik F127 ile desteklenmiş 10 mikrolitre steril S bazal ortamı ekleyin.

Bu, bir yüzey aktif madde görevi görür ve larvaların plastik pipet uçlarının iç yüzeyine yapışmasını önler. Bir P200 düşük tutma pipet ucu kullanarak, larvaları nazikçe yeniden askıya alın ve ardından 150 mikrolitreyi, 5 x 225 mikrolitre yumurta beş RNAi bakterisi ile tohumlanmış üç adet 10 santimetrelik RNAi plakasına ayırın. Solucanların beş bakteri çiminin tümüne eşit olarak dağıldığından emin olun.

Sıvı agarın içine emildikten sonra, yıkama prosedürü ile elimine edilmeyen plakalardan L4 olmayan larvaları manuel olarak toplayarak çıkarın. Daha sonra plakaları 24 saat boyunca 20 santigrat derecede saklayın. Geniş kapsamlı DR'yi başlatmak için, önceki manuel çıkarma adımından kaçan genç larvaları toplayın ve plakalarda yalnızca bir günlük yetişkinleri bırakın.

Her suş için, bir günlük yetişkinleri üç plakadan 15 mililitrelik bir tüpe yıkamak için 15 mililitre steril SB strep kullanın. Solucanların doğal olarak çökelmesine izin verin ve ardından süpernatanın 0,5 mililitresi hariç hepsini aspire edin. Solucanları 9.5 mililitre SB strep ile tekrar askıya alın ve çökeltme ve yıkama adımlarını tekrarlayın.

Süpernatantın 0,5 mililitresi hariç tümünün son yıkaması ve aspirasyonundan sonra, 10 mikrolitre SB Plu ekleyin ve larvaları nazikçe yeniden süspanse etmek için bir P200 pipet ucu kullanın. Larvaların 100 mikrolitresini, mililitre başına 2 x 10 ila dokuzuncu hücre konsantrasyonunda, 5 x 225 mikrolitre bakteri ile tohumlanmış bir NSC plakasına alikot edin. 100 mikrolitreyi beş bakteri çiminin tümüne eşit olarak dağıtın.

Mikroskop altında, plaka başına 100 ila 150 solucan hedefleyerek plaka üzerinde bulunan hayvan sayısını tahmin edin. Bu aralıkta bir solucan yoğunluğu elde etmek için gereken sıvı hacmini belirleyin ve ardından iki ek plakaya ayırın. İlk plakadaki solucan sayısını da bu aralığa girecek şekilde ayarlayın.

Ve sonra plakaları 24 saat boyunca 20 santigrat derecede saklayın. Ertesi gün, iki günlük yetişkinleri toplayın ve solucanları, deneysel yiyecek konsantrasyonu arzusuyla tohumlanan yeni NSC plakalarına dağıtın. Sıvı agarın içine emildikten sonra, plakaları 24 saat boyunca istenen deneysel sıcaklığa kaydırın.

Ertesi gün, üç günlük yetişkinleri toplayın ve onları aynı deneysel yiyecek konsantrasyonu ile tohumlanmış taze NSC plakalarına dağıtın. Sıvı agarın içine emildikten sonra, plakaları 48 saat boyunca deneysel sıcaklığa geri getirin. Son olarak, verileri metin protokolüne göre bir araya getirmeden ve nicelleştirmeden önce hayvanları görüntülemek için bir mikroakışkan cihaz kullanın.

Burada gösterildiği gibi, vahşi tip n2 suşunun ortalama ömrü, geniş DR aralığına karmaşık bir yanıt gösterir. Bu tepkinin büyüklüğü, daf-7 geninin tüm mutantında zayıflar, bu da bu genin solucanın gıda bolluğundaki değişikliklere doğru şekilde yanıt verme yeteneğini etkilediğini düşündürür. Daf-7 geni ve vahşi tip arka plan için bir transkripsiyonel raportörün ortalama ekspresyon seviyeleri, ayrıca daf-7'DR.In geniş bir aralığa karmaşık bir monotonik olmayan yanıt gösterir (genetik arka plan, bu transkripsiyonel raportörün ekspresyonu oldukça zayıflar ve gıda seviyesindeki değişikliklere çok az tepki gösterir. Bu şekil, belirli bir gıda seviyesi için ADF nöronlarında TPH1 ekspresyonunun ve ASI nöronlarında daf-7 ekspresyonunun ortak dağılımının tahminini göstermektedir.

Bu çubuk grafikler, TPH1 ve daf-7'nin gen ekspresyon seviyelerine dayalı olarak ADF, ASI ve NSM nöronları tarafından kombinatoryal veya bireysel olarak kodlanan gıda bilgilerini sunar. Kodlamanın yedekli ve sinerjik karakterleri, sağdaki yığılmış çubukların yükseklik farkı ile temsil edilen nöronlar tarafından kodlanan kombinatoryal ve bireysel bilgiler ile tam devre tarafından kodlanan bilgiler arasındaki karşılaştırmadan kaynaklanır. Bu prosedürü denerken, kodlama stratejisini nicelleştirmek için bilgi teorisinin çoğaltılmasının, gen ekspresyon dağılımlarının doğru bir tahminini gerektirdiğini hatırlamak önemlidir.

Bu nedenle, örneklem büyüklüğü bu çerçevenin genel uygulanabilirliği için kritik bir faktördür. Bu videoyu izledikten sonra, gıda bolluğunu yaşam süresine bağlayan yeni genleri tanımlamak ve karakterize etmek için geniş kapsamlı diyet kısıtlama deneylerinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamalısınız.