Ölçme Caenorhabditis elegans Katı Medya Ömrü

Bu yazıda, UV öldürüldü bakteriyel gıda ile sağlam bir medya üzerinde muhafaza nematod ömrü ölçmek için genel bir protokol mevcut.

C Elgan'da yaşam süresini ölçmek için, üreme amaçlı zamanlanmış bir yumurta lang kullanılarak yaş senkronize bir popülasyon oluşturulur. Aktif yetişkin hermafrodit solucanları, UV ile öldürülmüş e coli ile tohumlanmış nematod büyüme ortamı plakalarına aktarılır, altı ila sekiz saat boyunca yumurta bırakmasına izin verilir ve daha sonra sonraki iki gün içinde çıkarılır, solucanlar bu yumurtalardan çıkar ve L dört larva aşamasına kadar büyür. L four solucanları, canlı bakteriyel kontaminasyonu önlemek için ampisilin ve üremeyi önlemek için FUDR içeren yeni NGM plakalarına aktarılır ve yetişkinlere dönüşmesine izin verilir.

Bu noktadan itibaren, yetişkin solucanlar, tüm solucanlar ölene kadar her iki ila üç günde bir gözlemlenir. Her zaman noktasında, ölü solucanlar plakadan çıkarılır ve canlı ve ölü solucanların sayısı kaydedilir. Ben Washington Üniversitesi Patoloji Bölümü'nde Matt Capline'ın laboratuvarından George Seton.

Bugün size yaşam süresini nasıl ölçeceğinizi ve hepatit zarafetimizi nasıl göreceğinizi göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda yaşlanmanın genetiğini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Temel bir kullanım ömrü deneyi, hiçbir katkı maddesi içermeyen standart NGM plakaları ve NGM'ye hem ampisilin hem de floro deoksi üridin eklenmiş AMP FUDR plakaları olmak üzere iki tip plaka gerektirir. Her iki plaka türü de e coli OP 50 bakterisi ile oturtulur ve bu bakteri daha sonra uv'ye maruz kalarak öldürülür. 10 mililitre NGM çözeltisi hazırlayarak başlayın.

60 milimetre başına Petri kabı, 32. darbelerde yüksek mikrodalgada mikrodalgada pişirerek katı NGM'yi tamamen eritir. Basınçlı gaz kabarcıklarının oluşmasını önlemek için ortamı darbeler arasında döndürün, ortamın soğumasını sağlamak için sıvı NGM'yi 55 santigrat derecelik bir su banyosuna veya bankın üzerine yerleştirin. Medya 55 santigrat dereceye kadar soğuduktan sonra, bu noktada cam kabı çıplak elle rahatça tutabilmeniz gerekir, ilaç eklenmeye hazırdır.

Ve ilaçlı plakalar için plakaları dökmek için, mililitre başına 33 mikrolitre 150 milimolar FUDR ve 100 mikrolitre 100 miligram ekleyin. 100 mililitre NGM'de ampisilin ve karıştırmak için girdap, yabancı bakteriyel kontaminasyonu önlemek için ampisilin ve yumurtaların çatlamasını önlemek için FUDR kullanılır. Bu nedenle, solucanların büyüyen larvalardan ayrılması için birkaç günde bir transfer edilmesine gerek kalmayacaktır.

Şimdi ortamı dökün ve plakaların kurumasını bitirmeden önceki gün iki gün boyunca tezgahta kurumasını bekleyin, taze bir e coli çizgisinden tek bir koloni ile tohum sıvı LB kültürünü kurutun. LB burgu üzerinde OP 50 bakteri. 60 milimetre plaka başına en az 0,5 mililitre kültür hazırlayın.

OP 50 kültürünü 37 derecelik bir çalkalayıcıya yerleştirin ve bakterilerin gece boyunca büyümesine izin verin. Ertesi gün OP 50 bakterisini 3.500 g merkezkaç kuvveti ile 10 dakika boyunca peletleyin. Bakterileri 10 x konsantrasyonda yeniden süspanse etmek için süpernatanı yeterince boşaltın.

Şimdi her plakayı 100 mikrolitre konsantre kültürle aşılayın. Pipet ucunu NGM'nin yüzeyine dokunmaktan kaçının, çünkü ortamın yüzeyindeki kusurlar, solucanların, bakteriler plaka duvarlarına yaklaşmadan NGM'nin merkezi bölgesini kaplayana kadar girdap plakalarını oymasına ve plakaları 24 saat boyunca tezgahta kurumaya bırakmasına izin verecektir. Kuruduktan sonra, plakaların yüzeyini bakteri üremesini durduracak kadar güçlü bir UV dozuna maruz bırakın, bir tabaka geni UV straddle bağlayıcı 2, 400 kullanıyoruz.

Plakaları, kapakları açık olmadan istifli bağlayıcıya yükleyerek başlayın. Şimdi enerjiye basın. Tuş takımına 9 9 9 9 girin ve başlat tuşuna basın.

Plakalar yaklaşık beş dakika boyunca UV'ye maruz bırakılacaktır. UV ile öldürülmüş bakteri içeren plakalar, bir aya kadar dört santigrat derecede baş aşağı saklanabilir. Bu bölümde, ortak bir kuluçka tarihine sahip bir solucan popülasyonunun nasıl oluşturulacağı açıklanmaktadır.

Yaklaşık 20 genç yetişkin solucanı ilaçsız taze bir NGM plakasına aktararak başlayın. Solucanların bir hafta içinde tüm bakteriyel yiyecekleri yaymasına ve yemesine izin vermek için plakayı yaklaşık bir hafta boyunca 25 santigrat derecede bırakın. Büyüme durdurulmuş çeyiz aşamasında yeni yumurtadan çıkan solucanlar görünmeli, 20 ila 30 çeyiz larvasını ilaçsız taze bir NGM plakasına aktarmalı ve yiyecek varlığında 25 santigrat derecede kuluçkaya yatırılmalıdır.

Çeyiz larvaları iki gün içinde üreme açısından aktif yetişkinler haline gelecek ve daha sonra birkaç gün üreme açısından aktif kalacaktır. Şimdi üreme açısından aktif yetişkinlerin 10 ila 15'ini ilaçsız yeni bir NGM plakasına aktarın. Bu plaka, zamanlanmış yumurtlama veya TEL plakası olarak adlandırılır.

Solucanların yumurtlayabilmesi için TEL plakasını 25 santigrat derecede bırakın. Bu yumurtalardan çıkan hayvanlar deney hayvanları olacak ve altı saat sonra ömürleri puanlanacak. TEL plakasında yumurta olup olmadığını kontrol edin.

Henüz yeterli yumurta yoksa, TEL plakasını toplam 24 saate kadar 25 santigrat derecede bırakın. Yumurtaları periyodik olarak kontrol edin. Yeterli sayıda yumurta bırakıldığında, yetişkinleri TEL plakasından çıkarın.

Tipik bir yaşam süresi deneyi, deney grubu başına 30 ila 90 yumurta gerektirecektir, ancak tek bir TEL plakasında birkaç yüz yumurta üretilebilir. Üreme açısından aktif 10 ila 15 yetişkin tarafından altı ila sekiz saat içinde yaklaşık 150 yumurta bırakılacaktır. Deney gruplarını karşılaştırırken, en az 30 hayvanla büyük yaşam süresi farklılıkları için istatistiksel anlamlılık elde edilebilir.

Daha mütevazı farklılıkları ayırt etmek için daha fazla hayvan kullanılmalıdır. Şimdi TEL plakasını yetişkinler olmadan 20 santigrat dereceye yerleştirin, ta ki yumurtalar yumurtadan çıkana ve solucanlar L dört larva aşamasına gelene kadar. Bu genellikle vahşi C tipi zarafet için iki gün sürer, ancak yavaş gelişen fenotiplere sahip suşlar için daha uzun sürebilir.

Bu bölümde, yaşla senkronize edilmiş bir popülasyonun yaşamının nasıl takip edileceği açıklanmaktadır. İlk olarak, L dört larvasını TEL plakasından oturmuş AMP FUDR plakalarına aktarın. Test edilen her suş veya koşul için, plaka başına 25 ila 30 sonsuz solucan içeren iki ila üç plaka ayarlamak tipiktir.

AMP FUDR plakalarını 24 saat boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra solucanları, ortamları ve bakterileri görsel olarak değerlendirin, solucanları taze AMP FUDR plakalarına aktarın. Solucanlar bakteriyel gıdaların çoğunu yemişse, bu genellikle haftada bir veya iki kez meydana gelir.

Deneyin başlarında, önemli sayıda larva mevcutsa, bu genellikle solucanların AMP FUDR plakalarına L dörtlü yerine genç yetişkinler olarak aktarıldığını gösterir. Genç yetişkinler, FUDR yürürlüğe girmeden önce yumurta bırakabilir ve bazen larvalar FUDR'nin etkilerinden kaçar ve yetişkinlere dönüşür. Bu larvalar bu durumda deneyi karıştıracak, yetişkin solucanları taze plakalara aktaracak ve larvaları içeren eski plakaları atacaktır.

Canlı büyüyen bakteriler gözlenirse solucanlar da taze plakalara aktarılmalıdır. Genel olarak, AMP ve UV öldürmenin kombinasyonu, hiçbir canlı bakterinin deneyi kirletmemesini sağlar, ancak bazen meydana gelir. Ayrıca, solucanları aktarın.

Ortamda mantar büyümesi gözlenirse. Yeterince erken yakalanırsa, mantar bir pipet ucu veya spatula kullanılarak kesilebilir. Çapı birkaç milimetreden daha büyük olacak şekilde büyüdüğünde, solucanları yeni bir plakaya aktarmak genellikle daha kolaydır.

Tüm solucanları her iki ila üç günde bir kullanım ömrü boyunca puanlayın. Bir diseksiyon kapsamı kullanma. Her solucanın canlı mı yoksa ölü mü olduğunu belirleyin.

Plakaya hafifçe vurun. Solucan, dokunmaya tepki olarak hareket ederse canlıdır. Solucan plakaya dokunmaya yanıt vermezse, baş bölgesini yakınlaştırın, solucanın kafasına platin transfer penası ile hafifçe vurun.

Solucanı ölü olarak puanlayın. Başını hareket ettirerek yanıt vermezse, ölü solucanı plakadan çıkarın. Tüm solucanları kontrol ettikten sonra, canlı ve ölü olan solucanların tarihini ve sayısını kaydedin.

Katı ortamlarda tutulan solucanlar bazen duvarı oyarak veya sürünerek plaka yüzeyinden kaçacaktır. Kaçan solucanlar çalışmadan tamamen çıkarılmıştır. Bittiğinde, plakaları 20 santigrat derece inkübatöre geri koyun.

İki ila üç gün daha bekleyin ve ardından plakaları tekrar kontrol edin. Her solucan ölene kadar bu rejime devam edin. Her gün ölen solucanların sayısı, her gün canlı olan solucanların oranını hesaplamak için tipik olarak tersine çevrilir, bu veriler, zamanlanmış yumurtlama günü dikkate alınarak bir hayatta kalma eğrisi olarak grafiksel olarak çizilir.

Sıfırıncı gün. N iki için tipik medyan ömür. UV üzerinde 20 santigrat derecede bakteri öldürmeye devam eden Sea elgan vahşi tip suşu, yumurtadan ölçüldüğü gibi yaklaşık 25 gündür.

Size az önce kullanım ömrünü nasıl ölçeceğinizi ve zarafeti nasıl göreceğinizi gösterdik. Destekleyici metinde tartışılan diyet kısıtlaması ve RNA girişimi dahil olmak üzere çeşitli çevresel koşulları test etmek için bu temel prosedürü değiştirebilirsiniz. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve denemenizde iyi şanslar.