Ölçme Caenorhabditis elegans Katı Medya Ömrü

C Elgan'da yaşam süresini ölçmek için, zamanlanmış yumurta langı ile yaş senkronizasyonu oluşturulur. Aktif yetişkin hermafrodit solucanları, UV etkisiyle öldürülmüş Ecoli tohumlanmış nematod büyüme ortam plakalarına aktarılır, altı ila sekiz saat boyunca yumurta bırakır ve sonraki iki gün içinde çıkarılır; solucanlar bu yumurtalardan çıkar ve L dört larva evresine ulaşır. L dört solucanlar, canlı bakteriyel kontaminasyonu önlemek için ampisilin içeren yeni NGM plakalarına ve üremeyi önlemek için FUDR içeren yeni NGM plakalarına aktarılır ve yetişkinlere dönüşmelerine izin verilir.

Bu noktadan itibaren, yetişkin solucanlar her iki-üç günde bir tüm solucanlar ölene kadar gözlemlenir. Her zaman noktasında, plakadan ölü solucanlar çıkarılır ve canlı ile ölü solucan sayısı kaydedilir. Ben George Seton, Washington Üniversitesi Patoloji Bölümü'nde Matt Capline laboratuvarından.

Bugün size yaşam süresini nasıl ölçeceğinizi ve hepatit zarafetimizi nasıl göreceğinizi göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda yaşlanmanın genetiğini incelemek için kullanıyoruz. O zaman başlayalım.

Temel bir yaşam süresi deneyi iki tür plaka gerektirir: standart NGM plakaları, katkı maddeleri içermeyen ve AMP FUDR plakaları, NGM'ye hem ampisilin hem de floro deoksi uridin eklenmiştir. Her iki plaka türü de e. coli OP 50 bakterileriyle oturur ve bu bakteri daha sonra UV'ye maruz kalarak öldürülür. Öncelikle 10 mililitre NGM çözeltisi hazırlayın.

60 milimetrelik Petri kabı başına katı NGM'yi yüksek dalgada mikrodalgada 32. darbelerde tamamen eritir. Basınçlı gaz kabarcıklarının birikmesini önlemek için darbeler arasında medya döndürün; sıvı NGM'yi 55 derece Santi-C su banyosuna veya medyanın soğuması için tezgaha yerleştirin. Medya 55 derece Celsius'a soğuduktan sonra, yani cam kabı çıplak ellerimle rahatça tutabilmelisiniz, ilaç eklenmeye hazır hale gelir.

Ve ilaç içeren plakaların plakalarını dökmek için, 33 mikrolitre 150 milimolar FUDR ve 100 mikrolitre 100 miligram/mililitre ekleyin. Yabancı bakteriyel kontaminasyonu önlemek için 100 mililitre NGM başına ampisilin ve karıştırmak için ampisilin karıştırma ile kullanılır, yumurtaların çatlamasını önlemek için ise FUDR kullanılır. Bu yüzden solucanların büyüyen larvalardan ayrılması için birkaç günde bir taşınmasına gerek kalmaz.

Şimdi ortamı dökün ve tabakların kurutmadan önceki gün boyunca iki gün boyunca laboratuvarda kurumasına izin verin; taze bir e. coli çizgisinden tek bir koloni ile tohum sıvısı LB kültürü alın. Uzun çaplı burgu üzerinde OP 50 bakteri. 60 milimetrelik plaka başına en az 0,5 mililitre kültür hazırlayın.

OP 50 kültürünü 37 derece Celsius çalkalayıcıya koyun ve bakterilerin gece boyunca büyümesine izin verin. Ertesi gün OP 50 bakterisini 3.500 g santrifüj kuvvetiyle 10 dakika boyunca pellet et. Bakteriyi 10 kat konsantrasyonda yeniden süspansiyona almak için süpernatantı yeterince dekant verin.

Şimdi her plakaya 100 mikrolitre konsantre kültür aşılayın. Pipet ucunu NGM yüzeyine değdirmekten kaçının; çünkü ortamın yüzeyindeki kusurlar solucanların girdap plakalarını kazmasına ve bakterilerin NGM'nin merkezi alanını kaplamasına kadar plaka duvarlarına yaklaşmadan kazmasına ve plakaların 24 saat boyunca tezgahta kurumasına izin vermesine olanak tanır. Kuruduktan sonra, plakaların yüzeyini bakteri büyümesini durduracak kadar güçlü bir UV dozuna maruz bırakın, bir strata geni UV straddle linker 2, 400 kullanıyoruz.

Plakaları kapakları olmadan straddle linker'a yükleyerek başlayın. Şimdi enerji basın. Tuş takımından 9 9 9 9 yaz ve başlat tuşuna bas.

Plakalar yaklaşık beş dakika boyunca UV ışığına maruz kalacak. UV tarafından öldürülmüş bakteri içeren plakalar, dört derece Celsius'ta ters bir ay boyunca saklanabilir. Bu bölüm, ortak bir yumurta çıkma tarihine sahip bir solucan popülasyonu nasıl oluşturulacağını açıklar.

Yaklaşık 20 genç yetişkin solucanı ilaç kullanmadan yeni bir NGM plakasına aktararak başlayın. Solucanların bir hafta içinde tüm bakteriyel yiyecekleri yayıp yemesini sağlamak için tabakı yaklaşık bir hafta boyunca 25 derece Celsius sıcaklığında bırakın. Büyüme duraklı dower aşamasında yeni çıkmış solucanlar, 20 ila 30 dower larvasını ilaçlar olmadan taze bir NGM tabakasına aktarmalı ve 25 derece Celsius'ta yem varlığında kuluçkaya salınmalıdır.

Dower larvaları iki gün içinde üreme açıdan aktif yetişkinlere dönüşür ve birkaç gün daha üreme aktif kalır. Şimdi üreme açısından aktif yetişkinlerden 10 ila 15'ini ilaç kullanmadan yeni bir NGM plakasına aktarın. Bu plakaya zamanlı yumurta bırakma veya TEL plakası denir.

TEL plakasını 25 derece Celsius olarak bırakın ki solucanlar yumurta bırakabilsin. Bu yumurtalardan çıkan hayvanlar deneysel hayvanlar olacak ve altı saat sonra ömürleri puanlanacak. TEL plakasını yumurta için kontrol et.

Henüz yeterli yumurta yoksa, TEL plakasını 25 derece Celsius'ta toplam 24 saate kadar bırakın. Periyodik olarak yumurta olup olmadığını kontrol ediyorum. Yeterli sayıda yumurta bırakıldığında, yetişkinleri TEL plakasından çıkarın.

Tipik bir yaşam süresi deneyi, deneysel grup başına 30 ila 90 yumurta gerektirir, ancak tek bir TEL plakasında birkaç yüz yumurta üretilebilir. Yaklaşık 10 ila 15 üreme aktif yetişkin tarafından altı ila sekiz saat içinde yaklaşık 150 yumurta bırakılır. Deneysel gruplar karşılaştırıldığında, 30 hayvana kadar büyük yaşam farkları için istatistiksel anlamlılık elde edilebilir.

Daha mütevazı farkları ayırt etmek için daha fazla hayvan kullanılmalıdır. Şimdi TEL plakasını yetişkinler olmadan 20 derece Celsius sıcaklığında yerleştirin, yumurtalar çatlayana ve solucanlar L dört larva evresine geçene kadar. Vahşi tip C zarafeti için bu genellikle iki gün sürer, ancak yavaş gelişimli fenotiplere sahip suşlar için daha uzun sürebilir.

Bu bölüm, yaş senkronize bir nüfusun yaşamını nasıl takip edeceğinizi açıklar. Öncelikle, L dört larvayı TEL plakasından oturmuş AMP FUDR plakalarına aktarın. Test edilen her suş veya durum için, her plaka için 25 ila 30 solucan içeren iki ila üç plaka kurmak normaldir.

AMP FUDR plakalarını 20 derece Celsius sıcaklıkta 24 saat boyunca kuluçka edin. Ve ardından solucanların, ortamların ve bakterilerin solucanları taze AMP FUDR plakalarına aktarmasını görsel olarak değerlendirin. Solucanlar bakteriyel yiyeceklerin çoğunu yemişse, bu genellikle haftada bir veya iki kez gerçekleşir.

Deneyin başında, önemli sayıda larva varsa, bu genellikle solucanların genç yetişkin olarak AMP FUDR plakalarına L four olarak değil de transfer edildiğini gösterir. Genç yetişkinler, FUDR etkisi olmadan önce yumurta bırakabilir ve bazen larvalar FUDR etkisinden kaçarak yetişkinlere dönüşür. Bu larvalar, bu durumda deneyi karıştırır, yetişkin solucanları taze plakalara aktarır ve larvaları içeren eski plakaları atarlar.

Yaşayan büyüyen bakteriler gözlemlenirse solucanlar da taze tabaklara aktarılmalıdır. Genel olarak AMP ve UV öldürme kombinasyonu, deneyi canlı bakterilerin kontamine etmemesini sağlar, ancak bazen bu durum ortaya çıkar. Ayrıca solucanları transfer edin.

Eğer ortamda mantar büyümesi gözlemlenirse. Yeterince erken yakalanırsa, mantar pipet ucu veya spatula kullanılarak kesilebilir. Birkaç milimetreden büyük bir çapa ulaştığında, solucanları yeni bir plakaya aktarmak genellikle daha kolay olur.

Tüm solucanların yaşam süresini her iki-üç günde bir puanlayın. Bir diseksiyon dürbününü kullanmak. Her solucanın canlı mı ölü olduğunu belirleyin.

Tabağa nazikçe dokun. Solucan, tıklamaya karşılık hareket ederse canlıdır. Eğer solucan plakaya dokunmaya tepki vermezse, kafa bölgesine yakınlaştırın, solucanın kafasına platin transfer penjiyle nazikçe dokunun.

Solucanı ölü olarak değerlendir. Eğer başını hareket ettirmezse, ölü solucanı plakadan çıkarın. Tüm solucanları kontrol ettikten sonra, tarihi ve yaşayan ve ölü solucan sayısını kaydedin.

Katı ortamda tutulan solucanlar, zaman zaman duvara kazarak veya tırmanarak levha yüzeyinden kaçırlar. Kaçan solucanlar çalışmadan tamamen çıkarılmıştır. Bitirdikten sonra, plakaları 20 derece Celsius kuluçka makinesine geri götürün.

İki ila üç gün daha bekleyip sonra plakaları tekrar kontrol et. Tüm solucanlar ölene kadar bu rejimi sürdür. Her gün ölen solucan sayısı genellikle tersine çevrilerek her gün yaşayan solucanların oranı hesaplanır; bu veriler, zamanlanmış yumurta bırakma günü dikkate alınarak hayatta kalma eğrisi olarak grafik olarak çizilir.

Sıfır gün. N iki için tipik medyan ömrü. UV öldürme bakterilerinde 20 derece Celsius sıcaklıkta tutulan Sea elgan wild tipi suş, yumurtadan ölçüldüğünde yaklaşık 25 gündür.

Size ömür süresini nasıl ölçeceğinizi ve zarafeti nasıl göreceğinizi gösterdik. Bu temel prosedürü, destekleyici metinde tartışılan diyet kısıtlaması ve RNA girişimi gibi çeşitli çevresel koşulları test etmek üzere değiştirebilirsiniz. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneyinizde bol şans.