DNA değişiklikler için Immunostaining: Confocal görüntülerin sayısal analiz

Bu tekniğin genel amacı, çekirdekler içinde immün boyama ile görselleştirilen DNA modifikasyonlarının uzamsal dağılımını ve sinyal yoğunluğunu değerlendirmek için bir hesaplama aracı sağlamaktır. Bu yöntem, epigenetik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve farklı model sistemlerinde nükleer lokalizasyonun ve DNA modifikasyonlarının nispi seviyelerinin incelenmesine olanak tanır. Bu tekniğin ana avantajı, DNA modifikasyonlarının bot sinyal büyüklüğü ve ardından dağılımı ile ölçülmesidir.

Bu tekniğin sonuçlarından biri, çeşitli biyolojik sistemlerdeki DNA modifikasyonlarının potansiyel fonksiyonel sıralarını anlamamızı kolaylaştırmasıdır. Bu teknik aynı zamanda immünohistokimya ile tespit edilebilen diğer epitopların hesaplamalı analizinin ek uygulamasına da sahiptir. Başlamak için, konfokal mikroskopi görüntüsünün LSM formatlı dosyalarını açın.

Görüntü işlemeyi seçin ve ardından analiz için istediğiniz görüntüyü seçin. Numuneler arasındaki yoğunluk profillerini karşılaştırırken, doğrudan karşılaştırmalar yapmak için lazer gücü ve kazancının tutarlı olması gerektiğini unutmayın. Ardından, tüm grafik kontrolleri görünür hale getirmek için tümünü göster'e tıklayın, ardından grafikler sekmesini seçin ve ilgilenilen çekirdekleri içeren bir bölge seçmek için dikdörtgen aracını seçin.

Ardından, ilgilenilen bölgeyi izole etmek için kesim bölgesi komutunu kullanın. Şimdi görüntüyü yeni bir adla ve LSM veya CZI formatında kaydedin ve dosyayı Zen Blue yazılımında yeniden açın. ZEN masasını Zen Mavisi olarak açın, ardından dosyayı Zen Mavisi olarak açmak için Zen Siyahı'ndaki ZEN'e gönder komutunu kullanın.

Ardından, görüntünün 2.5d olarak görselleştirilmesini sağlamak için 2.5d etiketli sekmeyi etkinleştirin. Tüm grafik kontrollerini görünür hale getirmek ve dört gri çubuğu kullanarak ayarları değiştirmek için tümünü göster'e tıklayın. Çubuklar, ölçek çubuklarının yakınlaştırmasını, dönüşünü, eksen eğimini ve genişlemesini ve daralmasını kontrol eder.

Tek tek tepe noktalarını en iyi şekilde görselleştirmek için oluşturma modunu seçin, ardından yüzdeyi değiştirerek büyük mesafeyi değiştirin. Yüzde ne kadar düşükse, her bir tepe o kadar tanımlı olur. Şimdi 2.5d görüntüyü kaydetmeden önce, 2.5d grafiğin altındaki gri oka tıklayarak dosya listesini ve grafik araçlarını gizleyin.

Ardından, klavyedeki print screen tuşunu kullanarak grafiği ekran görüntüsü olarak kaydedin. Yazılımda görüntü işleme seçeneğini açın ve ilgilendiğiniz dosyayı açın. Ardından, profil sekmesini seçin ve tüm biçimlendirme seçeneklerine erişmek için tümünü göster sekmesini seçin.

Profil sekmesinden tablo seçeneğini ve ok düğmesini seçin. Şimdi, bir başlangıç noktası seçmek için fareyi kullanın ve sürekli sayıda hücre üzerine bir çizgi çizin, bu çizgi boyunca hücreler için bir yoğunluk grafiği oluşturulur, daha sonra yoğunluk ölçümleri tablosu ile birlikte oluşturulur. Tablonun ayrıca kırmızı, yeşil ve mavi floresan için piksel yoğunluğunun kırmızı olduğu mesafeyi de sağladığını unutmayın.

Birimi mikrondur. Bu verileri dışa aktarmak için tabloya sağ tıklayın, tabloyu kaydet'i seçin ve bir metin dosyası olarak kaydedin. Yoğunluk profilini kaydetmek için, dışa aktarma seçeneğini seçin, açılır pencerede, etiketli görüntü dosyası, görüntü penceresinin formatı ve içeriği, tek bölme, veri olmak üzere iki seçenek arasında geçiş yapın.

Ardından dosyayı kaydetmek için istemleri izleyin. Şimdi gereken her yoğunluk profili için bu işlemi tekrarlayın. Yazılımda, görüntü işlemeyi seçin ve ilgilendiğiniz görüntü dosyasını seçin.

Ardından, ortak yerelleştirme analizi için coloc etiketli sekmeyi seçin ve tüm biçimlendirme seçeneklerine erişmek için tümünü göster'i seçin. Ekranın alt yarısındaki dört sekmeden ortak yerelleştirmeyi seçin ve tablo ve görüntü seçeneklerini belirleyin. Ardından, sekmenin üst kısmında, açılır metin, kapalı besier ile tanımlanan üçüncü simgeyi seçin.

Tek bir çekirdeği çevrelemek için bu aracı kullanın. Değerler daha sonra tabloda görünecek ve kırmızı ve yeşil floresan için bir dağılım grafiği üretilecektir. Bu grafiğin ekseni hareketlidir ve bu, algılama kapısını kontrol eder.

Çekirdek içindeki tüm piksel yoğunlukları pozitif sinyaller olarak kabul edilmelidir. DNA modifikasyonlarının seviyeleri çekirdek boyunca değiştiğinden, zayıf sinyalleri hesaba katmak için verileri kapatmıyoruz. Burada vurgulamalıyız ki, arka plan değerlerinin analize dahil edilip edilmemesi tartışmalıdır.

Daha da önemlisi, örtüşme katsayısı, iki kanal arasındaki sinyal yoğunluklarındaki farklılıklardan bağımsızdır. Kişi korelasyon katsayısı, sinyaller arasında doğrusal bir ilişki olduğunu varsayar. Şimdi veri setini tamamlamak için bu çekirdek çevreleme işlemini tekrarlayın.

Ardından verileri dışa aktarmak için tabloya sağ tıklayın ve verileri kaydetmek için seçenekleri izleyin. Bir ortak yerelleştirme görüntüsünü kaydetmek için, etiketli görüntü dosyası, görüntü penceresinin biçimi ve içeriği tek bölmesi, veri olmak üzere iki seçenekle dışa aktar komutunu kullanın, ardından dosyayı kaydetmek için seçenekleri izleyin. Beş metil sitozinin iki oksitlenmiş türevinin mekansal dağılımı, tarif edilen protokol kullanılarak hafadik progenitörlerin ayırt edilmesinde incelendi.

Kırmızı ve yeşil sinyaller, iki farklı DNA modifikasyonunu temsil eder. Sinyaller, sınırlı örtüşme ile iyi tanımlanmıştır. Beklentilerle tutarlı olarak, iki sinyal yoğunluğunun ve karşılık gelen hücrenin profilleri birbiriyle güçlü bir şekilde örtüşmez.

Farklı model, beş metil sitozinin musluğa bağlı oksidasyonunun, belirli kromatin bölgelerinde farklı oksitlenmiş türevler üretebileceğini düşündürmektedir. İki DNA modifikasyonunun benzer bir karşılaştırması Daoy medulloblastoma hücrelerinde ve BXD ependimoma hücrelerinde yapıldı. Her iki hücre soyu da pediatrik beyin tümörlerindendir.

Miktar tayini, BXD hücrelerinin, Daoy hücrelerine kıyasla her iki sinyalin önemli ölçüde daha düşük seviyelerini sergilediğini ortaya koymaktadır. 5MC'nin oksitlenmiş türevlerinin bir sonraki kolokalizasyonu, farklılaşmamış hiPSC'lerde incelendi. Hepatik endoderm farklılaşması ve hiPSC'lerin indüksiyonundan 24 saat sonra.

Bu analizde, sinyal ko-lokalizasyonu, farklılaşmamış hücrelerde beş CAC'nin azalmış bir büyüklüğüne atfedilebilecek olan farklılaşmanın indüksiyonu ile önemli ölçüde değişti. Bu videoyu izledikten sonra, 2.5d yoğunluk grafiklerinin ve profillerinin nasıl oluşturulacağını ve ortak yerelleştirme verilerinin nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız. Burada açıklanan görüntü analizi ve görselleştirme araçları, farklı deney gruplarındaki farklı DNA modifikasyonlarının sinyallerini karşılaştırmak için nispeten hızlı bir yol sağlayarak epigenetik araştırmalara katkıda bulunur.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa yaklaşık bir saat içinde yapılabilir. Mikroskopi sırasında aşırı maruz kalmaktan kaçınmak ve farklı deney grupları için aynı ayarları kullanmak önemlidir. Montajdaki hava kabarcıkları ve yetersiz daldırma, yerel floresan kaybına neden olabilir, bu nedenle, tarama alanının görsel olarak incelenmesi kritik öneme sahiptir.

Prosedür, çekirdekleri bölümlere ayırarak ve Zen Blue kullanarak ilgi alanları oluşturarak daha da otomatikleştirilebilir. Bu bölgeler, birden fazla çekirdek üzerinde ortak yerelleştirme analizi yapmak için Zen Black'e aktarılabilir.