Name: DNA değişiklikler için Immunostaining: Confocal görüntülerin sayısal analiz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Keşfedin DNA modifikasyonlarının immunostaining ile görselleştirilmesi ve konfokal mikroskopi görüntülerinin sayısal analizi. Bu yöntem epigenetik araştırmalarda sinyal yoğunluğu ve kollokalizasyon değerlendirmesi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

İş Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi [BB/N005759/1'e A.R.] tarafından desteklenmiştir. NRFH finanse Rosetrees güven ve Stoneygate güven [A1130 / M546]. Zeiss Elyra PS.1 mikroskop, işleme bilgisayar ve yazılım tarafından BBSRC BB L013827 1 / / (multidisipliner süper çözünürlük mikroskobu tesisinde Nottingham Üniversitesi grant) finanse edilmiştir

1. nesil Confocal görüntüleri <ol><li>Abakir vd tarafından açıklandığı gibi boyama immunohistokimyasal sitozin değiştirilmiş formları analizi için hazırlık olarak, gerçekleştirmek 34.</li> <li>bir mikroskop kullanarak slayt görüntüleme gerçekleştirmek ve dosyaları bir LSM biçiminde kaydettiğinizde. 
	Not: Otelde yoğunluğu karşılaştırma örnekleri arasında lazer güç ve her kanal için kazanç için kullanılan değerleri profilleri yordamı doğrudan karşılaştırma için görüntü analiz aşamasında izin alarak görüntü boyunca sürdürülmelidir.</li>
</ol> 2. Yoğunluk 2.5D Arsalar nesil <ol><li>yazılım (örneğin, Zen siyah) açın ve seçin &#39; görüntü işleme &#39;.</li>
	<li>Dosya menüsüne gidin ve Aç'ý seçin. İşlem gerektirdiği resmi seçin.</li>
	<li>Tıklayın &#39; tümünü göster &#39; tüm grafik denetimleri görünür hale getirmek için resmi aşağıda. Ekranın alt yarısında üç sekme vardır; &#39; Boyutları &#39;, &#39; ekran &#39; ve &#39; grafik &#39;, select &#39; grafik &#39; sekmesini
	<ol><li>Seç &#39; dikdörtgen &#39; çekirdeği/ilgi alanı seçmek için aracı.</li>
		<li>Select &#39; bölge kesmek &#39; Görüntüyü kırpmak için. Bu, ayrı sekme içinde kırpılmış bölge için yeni bir resim oluşturur</li>
		<li>Dosya menüsüne gidin ve Save As ver dosyayı bir ad seçin ve bir LSM veya CHİ dosyası kaydedin.</li>
	</ol></li> <li>Yazılım (örneğin, Zen mavi) açıp seçin &#39; Zen Resepsiyon &#39;.</li>
	<li>Zen siyah kırpılmış görüntü dosyayı seçerek ve Dosya menüsünde Zen mavi için göndermek ve Zen 2012-mavi baskı için Gönder seçeneðini belirleyin. Kırpılmış görüntü daha sonra ilgili programda açabilirsiniz. 
	Not: 2.5 D yoğunluk arsa özelliği Zen siyah 2012 yılında aynı anda birden fazla kanal görüntü görüntü yok çünkü görüntü dosya aktarılır.</li>
	<li>Görüntünün sol tarafta etiketli sekmesini seçin &#39; 2.5D &#39;, bu resim 2.5 d görselleştirme sağlar. ' I tıklatın &#39; tümünü göster &#39; tüm grafik denetimleri görünür kılmak için.</li>
	<li>Solunda ve görüntüsünün altında yer alan dört gri çubuk kullanarak Alter görselleştirme ayarlarını. 
	Not: sol el çubuğu, ekranın üst yakınlaştırma =. Sol el bar, ekranın alt kısmında ekseninde dönüş görüntü =. Sol el ekranın alt çubuk rotasyon görüntüsünün =. Ekranın sağ el bar = genişletin ve sözleşme ölçek çubukları alt.</li>
	<li>Bu render modu seçili olduğundan yüzey bu bireysel zirvesinin en iyi görselleştirme verir gibi olun.</li>
	<li>Alter kılavuz uzaklığı yüzde yüzde, alt değiştirerek daha fazla tanımlanan her bireysel zirve.</li>
	<li>2.5 D görüntü kaydetmek için ilk 2.5 D arsa altındaki gri oku tıklayarak sağ tarafta ve grafik araçları görüntü aşağıdaki dosya listesinde gizle (yanında &#39; göstermek tüm &#39;), bu dağ eteğindeki taş yığını doldurmak için görüntüyü genişletmek izin grafik sekmeleri gizler n. 2.5 D arsa kaydetmek için tuşuna basın &#39; PrtSc &#39; anahtar üstünde belgili tanımlık klavye. Bu bir ekran görüntüsünün yakalayacaktır. Microsoft Paint'te ekran yapıştırmak ve kaydetmeden önce görüntü kırpma.</li>
</ol> 3. Yoğunluk Profiling <ol><li>yazılım (örneğin, Zen siyah) açın ve görüntü işleme seçin.</li>
	<li>Dosya menüsüne gidin ve Aç'ý seçin. İşlem gerektirdiği resmi seçin.</li>
	<li>Görüntü ekranda göründüğü şekilde görüntünün sol tarafta etiketli sekmesini seçin &#39; profil &#39;.</li>
	<li>Alt ekranın yarısını seçme (tıkırtı) &#39; tümünü göster &#39; sekme. Bu tüm biçimlendirme seçeneklerine erişim sağlayacaktır.</li>
	<li>Ekranın alt yarısında üç sekme; vardır &#39; boyutları &#39;, &#39; ekran &#39; ve &#39; ProfileƆ seçin &#39; profil &#39; ve seçme (tıkırtı) &#39; tablo &#39; kutusu. Seçin &#39; ok &#39; düğmesini.</li>
	<li>Görüntü üzerinde bir başlangıç noktasını seçin ve hücreler sürekli bir sayı üzerinde fareyi sürükleyin için fareyi kullanın. Bir yoğunluk arsa hattı boyunca hücreler için üretmek için fare düğmesini bırakın; Ayrıca tablo yoğunluk ölçüm verileri için her dalga boyu için hattı boyunca piksel tarafından doldurulur. 
	Not: Tablo hangi piksel yoğunluğu okumak için kırmızı, yeşil ve mavi Floresans mesafe (µm) sağlayacaktır.</li>
	<li>Bu verileri dışa aktarmak için sağ tablo, select tıklayın &#39; Tablo Kaydet &#8230; &#39; ve uygun bir konuma bir .txt dosyası olarak kaydedin.</li>
	<li>Seçili yoğunluğu profil görüntü kaydetmek için Dosya menüsünden seçin ve seçin &#39; ihracat &#8230; &#39;. Açılan pencerede seçin &#39; etiketli görüntü dosyası (biçimi) &#39; ve &#39; içeriği görüntü penceresinde - tek bölme (veri) &#39; tıklatarak takip &#39; dosya adı seçin ve Kaydet &#8230; &#39; uygun bir konum seçin ve'ı tıklatın &#39; kurtarmak &#39;.</li>
	<li>Her bireysel şiddeti profil alanları görme ve analiz etmek için profil sayısı bağlı olarak için işlemi tekrarlayın.</li>
	<li>Alma yoğunluğu (bkz: 3.7) kaydedilen veriler profilleri ve istatistiksel analiz tarafından takip bir elektronik tablo içinde analiz.</li>
</ol> 4. Co yerelleştirme analizi <ol><li>yazılım açın ve seçin &#39; görüntü işleme &#39;.</li>
	<li>Dosya menüsüne gidin ve Aç'ý seçin. İşlem gerektirdiği resmi seçin.</li>
	<li>Görüntü ekranda göründüğü şekilde görüntünün sol tarafta etiketli sekmesini seçin &#39; Coloc &#39;.</li>
	<li>Alt ekranın yarısını seçme (tıkırtı) &#39; tümünü göster &#39; sekme. Bu tüm biçimlendirme seçeneklerine erişim sağlayacaktır.</li>
	<li>Ekranın alt yarısında dört sekme; vardır &#39; boyutları &#39;, &#39; ekran &#39;, &#39; grafik &#39; ve &#39; ColocalizationƆ seçin &#39; Colocalization &#39; ve tıkırtı belgili tanımlık kutu için &#39; tablo &#39; ve &#39; görüntü &#39;.
	<ol><li>Üst kısmında bu sekmeyi (yakın metin fare aracın üzerine geldiğinde görünecek Bezier) boyunca simgesi üçüncü sonra tek bir hücre çekirdeği sarmak için bu aracı kullanın değerleri bu çekirdeklerin will için sonra tabloda görünür seçin. 
		Not: kırmızı ekranın sol panelinde görüntülenir yeşil Floresans karşı bir dağılım çizim deklanşörü her çekirdek için üretilmektedir. Eksen sonra hücreleri eşik bağlı olarak dışarı kapı için taşınır. Faiz çekirdekleri görüntüleri el ile seçtiğinizde, sıfır yukarıda gating Eşikleri ayarlama gerekli değildir. Tüm piksel yoğunluğu değerleri nükleer parametreleri içinde gözlenen olumlu sinyal olarak kabul edilir.</li>
	</ol></li> <li>Üçüncü simgeyi seçme belgili tanımlık etiket ve veri kümesi tamamlanıncaya kadar sonraki çekirdeği çevreleyen bu işlemi yineleyin.</li>
	<li>Bu verileri vermek için tabloyu sağ tıklatın, tabloyu seçin ve uygun bir konuma kaydedin.</li>
	<li>Colocalization görüntü kaydetmek için Dosya menüsünden seçin ve seçin &#39; ihracat &#8230; &#39; sonra seçin; Etiketli görüntü dosyası (biçimi) ve &#39; Görüntü penceresinin içeriğini &#8211; tek uçak (veri) &#39; tıklayarak takip &#39; dosya adı seçin ve Kaydet &#8230; &#39;, uygun bir konum seçin ve'ı tıklatın &#39; kurtarmak &#39;.</li>
	<li>Arsa istatistiksel analiz tarafından takip bir elektronik tablodaki verilerde colocalization.</li>
</ol>

<ol><li>Bird, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+restriction+enzymes+to+study+eukaryotic+DNA+methylation%3A+II.+The+symmetry+of+methylated+sites+supports+semi-conservative+copying+of+the+methylation+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: II. The symmetry of methylated sites supports semi-conservative copying of the methylation pattern.</a> J Mol Biol. 118 (1), 49-60 (1978).</li>
<li>Youssoufian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+mutations+in+haemophilia+A+give+evidence+for+CpG+mutation+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recurrent mutations in haemophilia A give evidence for CpG mutation hotspots.</a> Nature. 324 (6095), 380-382 (1985).</li>
<li>Holliday, R., Pugh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+modification+mechanisms+and+gene+activity+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Monograph+Series%22%5BJournal%5D)">DNA modification mechanisms and gene activity during development.</a> Cold Spring Harbor Monograph Series. 32, 639-645 (1996).</li>
<li>Christman, J. K., Price, P., Pedrinan, L., Acs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+hypomethylation+of+DNA+and+expression+of+globin+genes+in+Friend+erythroleukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Correlation between hypomethylation of DNA and expression of globin genes in Friend erythroleukemia cells.</a> European J Biochem. 81 (1), 53-61 (1977).</li>
<li>Bird, A. P., Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+restriction+enzymes+to+study+eukaryotic+DNA+methylation%3A+I.+The+methylation+pattern+in+ribosomal+DNA+from+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: I. The methylation pattern in ribosomal DNA from Xenopus laevis.</a> J Mol Biol. 118 (1), 27-47 (1978).</li>
<li>Kim, G. D., Ni, J., Kelesoglu, N., Roberts, R. J., Pradhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-operation+and+communication+between+the+human+maintenance+and+de+novo+DNA+%28cytosine-5%29+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Co-operation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine-5) methyltransferases.</a> EMBO J. 21 (15), 4183-4195 (2002).</li>
<li>Reik, W., Kelsey, G., Walter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+de+novo+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Dissecting de novo methylation.</a> Nature genetics. 23 (4), 380-382 (1999).</li>
<li>Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methyltransferases+Dnmt3a+and+Dnmt3b+are+essential+for+de+novo+methylation+and+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development.</a> Cell. 99 (3), 247-257 (1999).</li>
<li>Eckhardt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+profiling+of+human+chromosomes+6%2C+20+and+22%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA methylation profiling of human chromosomes 6, 20 and 22.</a> Nat Genet. 38 (12), 1378-1385 (2006).</li>
<li>Lees-Murdock, D. J., Lau, H. -T., Castrillon, D. H., De Felici, M., Walsh, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methyltransferase+loading%2C+but+not+de+novo+methylation%2C+is+an+oocyte-autonomous+process+stimulated+by+SCF+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling.</a> Dev Biol. 321 (1), 238-250 (2008).</li>
<li>Leonhardt, H., Page, A. W., Weier, H. -U., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeting+sequence+directs+DNA+methyltransferase+to+sites+of+DNA+replication+in+mammalian+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei.</a> Cell. 71 (5), 865-873 (1992).</li>
<li>Jones, P. A., Taylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+differentiation%2C+cytidine+analogs+and+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation.</a> Cell. 20 (1), 85-93 (1980).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22DNA+methylation%3A+DNA+Methylation+in+Early+mammalian+Development%22">DNA methylation: DNA Methylation in Early mammalian Development</a>. Jähner, D., Jaenisch, R. , Springer. 189-219 (1984).</li>
<li>Chalitchagorn, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+pattern+of+LINE-1+methylation+level+in+normal+tissues+and+the+association+with+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Distinctive pattern of LINE-1 methylation level in normal tissues and the association with carcinogenesis.</a> Oncogene. 23 (54), 8841-8846 (2004).</li>
<li>Fatemi, M., Hermann, A., Gowher, H., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnmt3a+and+Dnmt1+functionally+cooperate+during+de+novo+methylation+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Dnmt3a and Dnmt1 functionally cooperate during de novo methylation of DNA.</a> Eur J Biochem. 269 (20), 4981-4984 (2002).</li>
<li>Gruenbaum, Y., Cedar, H., Razin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+and+sequence+specificity+of+a+eukaryotic+DNA+methylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Substrate and sequence specificity of a eukaryotic DNA methylase.</a> Nature. 295 (5850), 620-622 (1982).</li>
<li>Dean, W., Santos, F., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+in+early+mammalian+development+and+following+somatic+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology+%28Elsevier%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming in early mammalian development and following somatic nuclear transfer.</a> Seminars in cell & developmental biology (Elsevier). 14 (1), 93-100 (2003).</li>
<li>Wu, S. C., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+DNA+demethylation%3A+many+roads+lead+to+Rome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Active DNA demethylation: many roads lead to Rome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (9), 607-620 (2010).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+proteins+can+convert+5-methylcytosine+to+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine.</a> Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>Bachman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Formylcytosine+can+be+a+stable+DNA+modification+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">5-Formylcytosine can be a stable DNA modification in mammals.</a> Nat Chem Biol. 11 (8), 555-557 (2015).</li>
<li>Bachman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine+is+a+predominantly+stable+DNA+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine is a predominantly stable DNA modification.</a> Nat Chem. 6 (12), 1049-1055 (2014).</li>
<li>Lurlaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+profiling+reveals+a+tissue-specific+role+for+5-formylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide profiling reveals a tissue-specific role for 5-formylcytosine.</a> Genome Biol. 17 (1), 141(2016).</li>
<li>Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributive+Processing+by+the+Iron+%28II%29%2F%CE%B1-Ketoglutarate-Dependent+Catalytic+Domains+of+the+TET+Enzymes+Is+Consistent+with+Epigenetic+Roles+for+Oxidized+5-Methylcytosine+Bases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Distributive Processing by the Iron (II)/α-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases.</a> J Am Chem Soc. 138 (30), 9345-9348 (2016).</li>
<li>He, Y. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li>
<li>Herman, J. G., Graff, J. R., Myöhänen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation-specific+PCR%3A+a+novel+PCR+assay+for+methylation+status+of+CpG+islands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.</a> Proc Natl Acad Sci. 93 (18), 9821-9826 (1996).</li>
<li>Nagae, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+demethylation+in+CpG-poor+promoters+during+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific demethylation in CpG-poor promoters during cellular differentiation.</a> Hum Mol Genet. 20 (14), 2710-2721 (2011).</li>
<li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+5-hydroxymethylcytosine+in+mouse+ES+cells+and+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of 5-hydroxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation.</a> Nature. 473 (7347), 398-402 (2011).</li>
<li>Jin, S. -G., Wu, X., Li, A. X., Pfeifer, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genomic mapping of 5-hydroxymethylcytosine in the human brain.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 5015-5024 (2011).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundant+DNA+6mA+methylation+during+early+embryogenesis+of+zebrafish+and+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Abundant DNA 6mA methylation during early embryogenesis of zebrafish and pig.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li>
<li>Wu, T. P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27027282">DNA methylation on N6-adenine in embryonic stem cells.</a> Nature. 532 (7599), 329-333 (2016).</li>
<li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324 (5929), 929-930 (2009).</li>
<li>Globisch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine+and+search+for+active+demethylation+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates.</a> PloS one. 5 (12), e15367(2010).</li>
<li>Abakir, A., Wheldon, L. M., Ruzov, A. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/protocol/10.1007%2F978-1-4939-2754-8_8">Epigenetic Methods in Neuroscience Research: Immunohistochemical Detection of Oxidized Forms of 5-Methylcytosine in Embryonic and Adult Brain Tissue</a>. , Springer. 125-137 (2016).</li>
<li>Alioui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Carboxylcytosine+is+localized+to+euchromatic+regions+in+the+nuclei+of+follicular+cells+in+axolotl+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">5-Carboxylcytosine is localized to euchromatic regions in the nuclei of follicular cells in axolotl ovary.</a> Nucleus. 3 (6), 565-569 (2012).</li>
<li>Chen, Y., Damayanti, N., Irudayaraj, J., Dunn, K., Zhou, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+two+forms+of+DNA+methylation+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Diversity of two forms of DNA methylation in the brain.</a> Front Genet. 5, 46(2014).</li>
<li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).</li>
<li>Lachmanovich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-localization+analysis+of+complex+formation+among+membrane+proteins+by+computerized+fluorescence+microscopy%3A+application+to+immunofluorescence+co-patching+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Co-localization analysis of complex formation among membrane proteins by computerized fluorescence microscopy: application to immunofluorescence co-patching studies.</a> J Microsc. 212 (Pt 2), 122-131 (2003).</li>
</ol>

Hiçbir potansiyel çıkar çatışmaları açıklanması.

Bu iletişim kuralı DNA değişiklikler hücre çekirdeği içinde görsel gösterimleri üreten kademeli işlemini açıklar. Hassas ve etkili iken, bu tekniklerin sınırlamalar bir dizi sahip.
2.5 D oluşturulan verilerin grafiğini çizer, sinyal şiddeti profilleri ve colocalization analiz doğada yarı kantitatif vurgulamak gereklidir. Noktasına aydınlatma örnek sayesinde confocal mikroskobu tarama lazer üzerinde resim alma sırasında mutlak sinyal yoğunluklarda her kanal kaydedilir. Ancak, mutlak büyüklükleri 5hmC, bunlar değil ve 5caC olmanın algılanan ve tek varlığı, yokluğu veya ölçek bu epigenetik izlerini belirtileri temsil eder.
Sinyal Arttırımlar tekrarlayan yapısı nedeniyle, makine kaçınılmaz olarak sinyal artırmak için uygulanan sınırlamaları büyüklüğü ile tutarlı yaklaşımları bu işaretleri34gerçek fiziksel genomik İskan izni yıkmak. Bu işaretleri doğru genomik lokalizasyonu fiziksel olarak işgal alanlarda bile en iyi confocal çözünürlük limitlerde 200-300 nm34çözülemeyen bu hantal proteinler tarafından görünmeyebilir. Ayrıca, her işareti bireysel kanallarda sinyal yoğunluklarda birbirine antikor duyarlılık ve fluorophore konjugasyon34farklılıklar nedeniyle karşılaştırılamaz. Ancak elde edilen bilgiler ile görüntülemede genomik işaretleri zamansal ve mekansal organizasyonu ışık tutuyor.
İçin doğru Nefelometri 5hmC ve 5caC sinyallerin çekirdeği vurgulanmış ve açıkça çözümlenmesi için bölge tirelemeye DAPI counterstain karşı çevrili. Arka plan gürültü çekirdeği1seçerek el ile işleminde göz ardı sıra gating Eşikleri ayarlama için şartı ile bu yordamı dağıtır. Bir otomasyon, bu işlemin yapılması nükleer segmentasyon sağlayan en son yazılım elde edilebilir. FIJI gibi colocalization analizi, görüntüleri ikili 8 bit biçimlerine dönüştürmek için ihtiyaç gibi sakıncaları için kullanılabilir ücretsiz alternatif yazılım paketleri iken görüntü maskeleme ve boyutu dışlama veri bölgelerinde seçmek için giren sınırı faiz Bu programın kullanıcı erişilebilirlik. Ayrıca, genel düzeyde 5hmC ve 5caC genel olarak euchromatic bölgeler ve genomik CpG dizileri tükenmesi onların hakim konumda birleştiğinde genom içinde sınırlı göz önüne alındığında, el ile çekirdekleri çevreleyen kullanıcı-önyargı tanıtır. Bu nedenle, otomatik olarak çekirdekleri vurgulayarak pozitif olarak belirlenmis bölge içinde gerçekleşen tüm olayların varsayar ve mevcut olabilir herhangi bir artalan pikselleri yoksayar. Böylece, piksel yoğunluğu üzerinde göre görüntü analiz daha anlamlı olabilir. Bu faktörler dikkate alınarak Mander'ın colocalization katsayısı Pearson korelasyon katsayısı için varsayan oppose gibi onların sinyal yoğunluklarda bakılmaksızın iki sinyal arasında kayma örtüşme derecesine analiz kullanımı önemli bir sinyalleri arasında doğrusal ilişki.
Genel olarak, burada özetlenen teknikleri biyolojik veri görsel temsilini Tema sezgisel bir biçimde taşımak. Yarı kantitatif görüntü analizi açısından hassasiyeti veya tek temel çözünürlük genom kütle spektrometresi gibi güçlü teknikleri yerini değil iken geniş sıralama, bu çıkarımlar ve hipotezler olmak izin tamamlayıcı veri sağlamak analiz hassas görüntülerin gebe.

DNA metilasyonu, transkripsiyon yönetmelik ile ilişkili bir iyi belgelenmiş mekanizması gerektirir bir 5'-sitozin-fosfat-guanin-3 sitozin kalıntılarında modifikasyonu ' (KSY) dinükleotit bağlam metil grubu eklenmesi ile (-CH3) 5- 5-metilsitozin (5mC)1kurmaya sitozin pirimidin yüzük Karbon atomu. Memelilerde, CpGs yaklaşık % 70'i kendiliğinden deaminate 5mC mutajenik eğilimi timin2sayesinde bu palindromik sırası tükenmiş olarak sadece %1 onların genleri oluşturan metillenmiş. Gen organizatörü dizileri üzerinde metil gruplarının varlığı omurgalılar3,4,5' te transkripsiyon baskı ile güçlü korelasyon göster. Bu metil grubu eklenmesi katalize son derece korunmuş DNA Metiltransferaz (DNMT) enzim DNMT3a, 3b ve 3 L ve sırasıyla KSY cytosines de novo ve bakım metilasyonu içeriklerde değişiklik DNMT1 tarafından6. DNMT3A/B ifade embriyonik kök hücreler ve epiblast geliştirme sırasında yüksek; Ancak azalan ifadesini pluripotent hücre lineage taahhüt somatik kader farklılaşma8sırasında takip görülmektedir. Bir işlevsel artıklık paylaşmak Iken, düzgün fare embriyo tespit 3a ama ağırlıklı olarak neuroectoderm ve koryonik ektoderm doku8için yerelleştirilmiş 3b ile doku özgü ifade desenleri, DNMT3a ve 3b görüntüler.
Metilasyon imzalar mitoz ve mayoz10sırasında devralınabilir. Bakım metilasyonu hemi metillenmiş palindromları çift iplikçikli DNA11mevcut CpG sitozin kalıntılarının kolaylaştırdı DNMT1 değişiklik içerir. Sonuç olarak, genomik metilasyonu hücre döngüsü12S aşamasında en yüksek düzeyde ve DNMT1 bağlar DNA çoğaltma, Çatallar11 . DNMT1 böylece yeni sentezlenmiş DNA iplikçikleri ayırt etme, x kromozomu inactivation teşvik ve transkripsiyon baskı profilleri13sürdürmek değiştirilmediğinden cytosines methylates. Hemi metillenmiş DNA CpG dizileri tanıma programını DNMT1 kurulan desen de novo metilasyonu örneğin baskı uzun serpiştirilmiş nükleer öğesi 1 (Satır1) sinirlari metilasyon korur. retrotransposon rehberleri onun potansiyel kanserojen yayma14etkisizleştirmek için. DNA tercihli bağlama benzeşme Hemi metillenmiş sahip olsa da, DNMT1 bazlar CpG Adası (CGI) dizileri DNMT3a/b - / - mutant hücrelerdeki bir acil durum de novo metilasyonu rolünü15 uygun methylate . Böylece DNA çoğaltma16yarı muhafazakar doğası nedeniyle, bakım metilasyonu sadakatle kızı hücre17üst öğesinden metilasyonu imzalar özetlemek.
Ancak, gen için dinamik olarak ayarlanmış, baskıcı metilasyonu değişiklik olması ifade, hangi pasif ve aktif demethylation mekanizmaları18tarafından elde edilebilir silinmesi gerekir. Korunmuş dioxygenase proteinlerin ailesine ait on-Eleven translokaz (TET) proteinler CpG artıkları19metil gruplarının yinelemeli oksidasyon yeteneğine sahiptirler. Bu Tet proteinler, J-temel proteinler Trypanosome bruceiiiçinde keşfetti (JBP) için homolog tanımak ve değiştirilmiş DNA bind örneğin 5mC üsleri ve 5 arasında bakterilerde görülen (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) ve 5 - bu kalıntıları oksijen carboxylcytosine (5caC)20. Ancak 5 fC ve 5caC değişiklikleri doğrudan 5mC oksidasyon21, sentez Tet protein oksidasyon kademeli conformation değişikliğinden metil yapılandırmaları, hidroksil, karbonil ve karboksilat 5mC sonuçlarının kolaylaştırdı 22 , 23 , 24.
TET protein etkinliği onların yönetmelik anlamada bilgilendirici belirtisi dağıtım ve bereket oksi-metil-sitozin işaretlerinin okuyor. KSY zavallı rehberleri önemli 5mC varlığı aksine bazlar CpG zengin bölgeleri tespit, ikinci varlık CpG karakteristik25Adaları. Dokular arasında oral mukoza sergi iken en büyük hypomethylation, beyin, testis ve kan belirli metilasyonu görülmektedir en yüksek doku doku belirli rehberleri26, meydana gelen bir değişiklik metilasyonu desen gösteren.
Duyarlı anti-5mC ve anti-5hmC kullanarak aracılığıyla antikorlar seçici metil/hydroxymethyl DNA'sı immunoprecipitation (meDIP/hmeDIP) ve sonraki yüksek işlem hacmi sıralama, Ficz vd. , yüksek 5hmC doluluk rehberleri, gösterdi, kök hücreleri27ekzonlar ve düşük 5mC seviyeleri, bu yerlerdeki fare embriyonik ile ilişkili hat-1 retrotransposon dizileri. Ters, en büyük 5mC zenginleştirme 5hmC varlığı sınırlı28neredeydi tekrarlayan uydu dizileri görülmüştür. İnsan ön lobunda beyin dokusu üzerinde gerçekleştirilen çalışmalar son derece önemli 5hmC zenginleştirme, dört kat daha yüksek fare embriyonik kök hücre28ortaya koyuyor. Önceki gözlemleri ile uyum içinde yüksek işlem hacmi sıralama frontal lob resimli doku çoğunluğu 55-%59 5hmC sinyal CpG organizatörü bölgeler, gen organları ve yaklaşık % 6 doluluk intergenic, % 35-38'lik düşük yoğunluklu yerelleştirilmiş bölgeler. Buna ek olarak, 5mC intergenic bölgeler (% 25-26) ve daha yüksek gen organları (52-%55) içinde zenginleştirilmiş ama organizatörü, azaltılmış (22-%24)29dizileri. 5 fC ve 5caC dağıtımları üzerine araştırmalar sınırlıdır ancak bu çalışmalar embriyonik kök hücreler ve somatik doku, özellikle beyin, 5hmC zenginliği gösteriyor.
İlginçtir ki, son zamanlarda Ökaryotlar, metilasyon pozisyon 6 azot (N6), adenin kalıntılarının keşfetti (6mA) ekran genomik bereket profil ters 5mC30. Sıvı Kromatografi birleştiğinde tandem kütle spektrometresi gözlemler ortaya 6mA mutlak düzeyleri fazla zebra balığı ve domuz erken embriyolar sperm onun düzeyleri (% 0,003 genomik adenines) ile karşılaştırıldığında var döllenme giderek artan morula gelişimsel sahne (33 kat sperm yüksek) girmeyi başaran ve %0,004 genomik adenines31somatik düzeyde kararlı duruma ulaştı. Immunoprecipitation zenginleştirilmiş 6mA DNA dizilerinin baskın doluluk (yaklaşık % 80'i Zenginleştirme) bu işareti yinelenen öğe bölgeleri ve transkripsiyon başlangıç siteleri32olarak göstermiştir. Bu gözlemler contextualize ve 6mA demethylase boş e keşfi doğrulamakmbryonic kök hücre birikmiş 6mA sergilenmesi hat-1 retrotransposon susturmak wildtype hücrelerdeki transcriptionally etkin öğelere göre aracılık. Bu veriler bir transkripsiyon düzenleyici fonksiyonu 6mA33için öneririz.
Varlığı ya da yokluğu oksitlenmiş metilsitozin türevleri (oksi-mCs) sonraki DIP deneyleri için birleştiğinde konjuge biyokimyasal etiketleri gösterir iken onlar kayma dağıtım veya bu işaretleri34, ölçülebilir bilgi vermek olamaz 35. son zamanlarda gelişmiş365hmC ve 5caC hassas immunochemical tespiti için bir protokol yapıldı. Tarama lazer confocal mikroskobu kullanan ile birleştiğinde bu Birleşik fluorophore ikincil immunostaining antikor tabanlı yöntem böylece hücrelerin içindeki bu DNA değişiklikleri görsel yerelleştirme sağlayan benzersiz avantajı sahip olur, bireysel vurgulayan olumlu veya olumsuz yönde bu işaretleri türdeş olmayan varlığı ile karşılık gelen hücreler lekeli. 5hmC ve 5caC mutlak sinyal yoğunluklarını konjuge antikorlar tarafından güçlendirilmiş pozisyonları bu izlerini çekirdek içinde ve büyüklüğü hakkında örneğin heterochromatic ve euchromatic bölgelerinde önerilecek yarı kantitatif Yorumları etkinleştirmek 37 , 38. burada bir teknik confocal mikroskobu görüntüleri Hesaplamalı analizi için kod sayfası kullanılmıştır. Farklı 5hmC görüntülemek için 2.5D kayma dağıtım nesil çizer ve 5caC sinyal doruklarına başına piksel ve konumlarına çekirdekleri içinde gösterdi. Çubuk grafik 5hmC araziler ve 5caC sinyal şiddeti profilleri bu işaretleri bolca tepeler olarak eğilimleri göstermek ve tekneler ayrı üst üste kanal olarak çizilir. Son olarak, colocalization işlevini uygulayarak, bir sinyal yakınlık derecesi belirlenebilir ve bunun sonucu olarak, onların anılan sıraya göre genomik koordinatları tespit edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Zeiss Elyra PS1. LSM780 konfokal kafa ile donatılmış süper çözünürlüklü mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen Siyah 2012</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Zen Mavi 2012</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

dna değişiklikler için immunostaining: confocal görüntülerin sayısal analiz

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Birkaç on yıl için 5-metilsitozin (5mC) tek DNA değiştirmeyi metazoans fonksiyonel bir önemi olması düşünülmektedir. 5-arasında bakterilerde görülen (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) ve 5-carboxylcytosine (5caC) 5mC enzimatik oksidasyon yanı sıra N6-methyladenine (6mA) çok hücreli organizmalar DNA tespiti keşfi ek derecelerde sağlanan epigenetik araştırmaya karmaşıklığı. Deneysel kanıt büyüyen gövdesini göre bu roman DNA değişiklikleri farklı hücresel ve gelişimsel işlemlerinde belirli rol oynayabilir. Önemlisi, bu işaretleri (e. g. 5hmC, 5fC ve 5caC) sergi doku - ve gelişimsel sahne özel olay omurgalılarda, bazıları olarak değerlendirilmesi olarak DNA değişiklikleri kayma dağılımını sağlayan önemli bir araç İmmünokimya temsil eder farklı biyolojik bağlamlarda. Burada confocal mikroskobu tarafından takip immunostaining tarafından görüntülenmiştir DNA değişiklikleri Hesaplamalı analizi için yöntemler açıklanır. Özellikle yoğunluğu araziler 2.5 Boyut (2.5 D) nesil sinyal, sinyal şiddeti profilleri, birden çok hücre ve sinyal colocalization katsayıları belirlenmesi şiddeti boyama miktar gösterilir. Toplu olarak, bu tekniklerin düzeyleri ve biyolojik rollerine metazoans içinde elucidating için katkıda bulunan çekirdek olarak bu DNA değişiklikleri yerelleştirilmesini değerlendirilmesinde çalıştırılamaz durumda olabilir.

5hmC ve 5caC bu DNA değişiklikler hepatik ataları immunostained slaytlarını ayırt içinde kayma dağılımını belirlemek için bir mikroskop kullanarak görüntüsü.
Bu oksi-mCs mekansal dağılımının ilk analizi 2.5 D yoğunluk araziler (şekil 1A, 1B) üretimi gerçekleştirilmiştir. Kırmızı ve yeşil tepeler turuncu doruklarına 5caC ve 5hmC sinyalleri sadece küçük bir çakışma gösteren sınırlı varlığı ile iyi tanımlanmış olduğu ortaya çıktı. Bu sonuçlar ile anlaşma, 5hmC ve 5caC yoğunluklarını karşılık gelen hücre profilleri şiddetle birbirleri ile (şekil 1 c) örtüşüp. Bu sadece o Tet-bağımlı oksidasyon 5mC yol açar bu DNA değişiklik belirli Kromatin içinde farklı oksitlenmiş türevleri nesil düşündüren hepatik ataları nükleer dağıtım farklı desenler sergi 5caC ve 5hmC biri bölgeler.
Düzeyde 5caC ve 5hmC Daoy medulloblastoma ve BXD-1425EPN olduğunu gösteriyor hücreleri karşılaştırmak için immunostaining için bu oksi-mCs aynı deneysel koşullar altında her iki örnekleri gerçekleştirilmiştir. Yoğunluklarını 5caC ve 5hmC sinyallerin sonra 20 profilleri her hücre satırı için kaydedilen 3-5 hücreler boyunca oluşturulan karşılaştırıldığında (şekil 2A-2D). Bu sonuçlar miktar BXD-1425EPN hücreleri 5hmC ve 5caC immunostaining (şekil 2B) Daoy hücrelere kıyasla daha düşük düzeyde sergi saptandı.
İki kanal kırmızı (5hmC) ve yeşil (5caC) göz önüne alındığında hangi ile belirtilen R ve G sırasıyla, Pearson korelasyon katsayısı (PCC) açıklar kayma örtüşme ve R co ayrılığı derecesini &amp; her iki işaretleri varsayarak G mevcut bir doğrusal birbirleriyle ilişkileri, R Hayatinizda34tarafından gösterilir. R2 tarafından belirtilen PCC değer kare alma kırmızı sinyal şiddeti34tarafından etkilenir yeşil sinyal şiddeti varyasyon ölçüm sağlar. Bu bizim 5caC vs 5hmC co yerelleştirme analiz için yersiz olur.
Kayma dağıtım indüksiyon sonraki 24 saat (HE24) 5caC ve 5hmC farklılaşmamış (Undiff) hiPSCs ve hepatik endoderm incelemek için bu DNA değişiklikleri analizini colocalization R değerleri 20 ile aynı confocal görüntüleri gerçekleştirilmiştir çekirdeklerin her hücre satırı (şekil 3A-3 C) için analiz.
Bu sonuçlar miktar colocalization derecesi önemli ölçüde daha yüksek olduğunu göstermiştir (P &lt; 0,05) Undiff (şekil 3 c) göre HE24 içinde. Bu 5caC varlığı azaltılmış büyüklüğü ve bu nedenle düşük sinyal şiddeti Undiff hücrelerdeki atfedilebilecek olabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56318/56318fig1.jpg"> 
Şekil 1: 72 saat sonrası indüksiyon farklılaşma, hepatik endoderm ataları ve immunohistokimyasal boyama. (A)5hmC (kırmızı), 5caC (yeşil) ve DAPI nükleer sayaç leke (mavi) Co boyama. Beyaz Kesikli ok 'B' 1 Cresimli çekirdeği ile örneklenen profil oluşturma yönünde gösterir. Ölçek çubuğu temsil eder 5 µm. kırmızı kanalı: 800 kazanç, lazer % 1. Yeşil kanal: 750 kazanç, lazer % 2.4. DAPI kanal: 750 kazanç, lazer % 2.6. (B) 2.5 D yoğunluk arsa 5hmC, 5caC ve DAPI sinyalleri. Bireysel doruklarına mutlak sinyal yoğunluklarda her pikselin temsil eder. Birleştirilmiş gösterim ve ayrı kanallar gösterilir. (C) yoğunluğu profilleri, 5hmC, 5caC ve hepatik ataları 72 saat sonrası indüksiyon farklılaşma, DAPI sinyalleri. En yüksek yoğunluklarda beyaz Kesikli ok 'B' boyut üzerinde kaydedildi ve yoğunluk profil x-ekseni boyunca siyah bir kesik okla gösterilir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56318/56318fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56318/56318fig2.jpg"> 
Resim 2: 5hmC ve 5caC analizi sinyal yoğunluklarını Daoy medulloblastoma ve BXD-1425EPN olduğunu gösteriyor hücre satırlarını. (A)immünfloresan 5hmC (kırmızı) ve 5caC Daoy ve BXD-1425EPN hücrelerinde (yeşil) boyama. Görüntüleri 63 x yağı daldırma objektif lens, her ikisi de aynı ayarları ile ele geçirildi. Birleştirilmiş gösterim ve ayrı kanallar gösterilir. Ölçek çubukları temsil 10 µm. kırmızı kanalı: 746 kazanç, lazer % 1. Yeşil kanal: 750 kazanç, lazer % 2.4. (B) Daoy ve (C) BXD-1425EPN tek tek hücreler bitişik resimler genişletilir. Ölçek çubukları (B) ve (C) temsil 5 µm. (D) ortalama Floresans yoğunluğunu 5hmC vs 5caC sinyalleri Daoy ve BXD-1425EPN hücrelerdeki (n = 20, SD). Önemi değerlendirildi kullanarak bir F-test ve iki örnek t-test yıldız istatistiksel olarak anlamlı p değerleri belirtmek ** p olarak &lt; 0,01 ve *** p olarak &lt; 0,001. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56318/56318fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56318/56318fig3.jpg"> 
Şekil 3: farklılaşmamış hiPSCs (Undiff) 5hmC ve 5caC mutlak sinyalleri analizini Colocalization karşılaştırıldığında hepatik endoderm için 24 saat sonrası farklılaştırılmış progenitör hücre (HE24). Confocal mikroskobu görüntüler(a)hiPSCs ve (B) HE24 hücre 5hmC (kırmızı), 5caC (yeşil) ve DAPI (mavi) için lekeli farklılaşmamış. Hücreleri 63 X yağı daldırma lens aynı ayarları ile görüntüsü. 20 deklanşörü çekirdeği colocalization analiz için örnek hücreleri göstermek. Ölçek çubukları temsil 20 µm. kırmızı kanalı: 800 kazanç, lazer % 1. Yeşil kanal: 750 kazanç, lazer % 2.4. DAPI kanal: 750 kazanç, lazer % 2.6. (C) 5caC sinyal 5hmC yakınlık undiff ve HE24 aralığında varlığı Colocalization analizi (n = 20, SD). Önemi değerlendirildi kullanarak bir F-test ve iki örnek t-test yıldız istatistiksel olarak anlamlı p değerleri belirtmek * p &lt; 0,05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56318/56318fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Yeni 5-metilsitozin (oksi-mCs), 5-arasında bakterilerde görülen (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) oksitlenmiş formları bulunan ve 5-carboxylcytosine (5caC) farklı DNA değişiklikleri benzersiz işlevsel roller ile temsil edebilir. Yarı nicel bir iş akışı görselleştirme oksi-mCs kayma dağıtım, sinyal şiddeti profil oluşturma ve colocalization için burada kullanılmıştır.

DNA değişiklikler için Immunostaining: Confocal görüntülerin sayısal analiz

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Bu tekniğin genel amacı, çekirdekler içinde immün boyama ile görselleştirilen DNA modifikasyonlarının uzamsal dağılımını ve sinyal yoğunluğunu değerlendirmek için bir hesaplama aracı sağlamaktır. Bu yöntem, epigenetik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve farklı model sistemlerinde nükleer lokalizasyonun ve DNA modifikasyonlarının nispi seviyelerinin incelenmesine olanak tanır. Bu tekniğin ana avantajı, DNA modifikasyonlarının bot sinyal büyüklüğü ve ardından dağılımı ile ölçülmesidir.Bu tekniğin sonuçlarından biri, çeşitli biyolojik sistemlerdeki DNA modifikasyonlarının potansiyel fonksiyonel sıralarını anlamamızı kolaylaştırmasıdır. Bu teknik aynı zamanda immünohistokimya ile tespit edilebilen diğer epitopların hesaplamalı analizinin ek uygulamasına da sahiptir. Başlamak için, konfokal mikroskopi görüntüsünün LSM formatlı dosyalarını açın.Görüntü işlemeyi seçin ve ardından analiz için istediğiniz görüntüyü seçin. Numuneler arasındaki yoğunluk profillerini karşılaştırırken, doğrudan karşılaştırmalar yapmak için lazer gücü ve kazancının tutarlı olması gerektiğini unutmayın. Ardından, tüm grafik kontrolleri görünür hale getirmek için tümünü göster'e tıklayın, ardından grafikler sekmesini seçin ve ilgilenilen çekirdekleri içeren bir bölge seçmek için dikdörtgen aracını seçin.Ardından, ilgilenilen bölgeyi izole etmek için kesim bölgesi komutunu kullanın. Şimdi görüntüyü yeni bir adla ve LSM veya CZI formatında kaydedin ve dosyayı Zen Blue yazılımında yeniden açın. ZEN masasını Zen Mavisi olarak açın, ardından dosyayı Zen Mavisi olarak açmak için Zen Siyahı'ndaki ZEN'e gönder komutunu kullanın.Ardından, görüntünün 2.5d olarak görselleştirilmesini sağlamak için 2.5d etiketli sekmeyi etkinleştirin. Tüm grafik kontrollerini görünür hale getirmek ve dört gri çubuğu kullanarak ayarları değiştirmek için tümünü göster'e tıklayın. Çubuklar, ölçek çubuklarının yakınlaştırmasını, dönüşünü, eksen eğimini ve genişlemesini ve daralmasını kontrol eder.Tek tek tepe noktalarını en iyi şekilde görselleştirmek için oluşturma modunu seçin, ardından yüzdeyi değiştirerek büyük mesafeyi değiştirin. Yüzde ne kadar düşükse, her bir tepe o kadar tanımlı olur. Şimdi 2.5d görüntüyü kaydetmeden önce, 2.5d grafiğin altındaki gri oka tıklayarak dosya listesini ve grafik araçlarını gizleyin.Ardından, klavyedeki print screen tuşunu kullanarak grafiği ekran görüntüsü olarak kaydedin. Yazılımda görüntü işleme seçeneğini açın ve ilgilendiğiniz dosyayı açın. Ardından, profil sekmesini seçin ve tüm biçimlendirme seçeneklerine erişmek için tümünü göster sekmesini seçin.Profil sekmesinden tablo seçeneğini ve ok düğmesini seçin. Şimdi, bir başlangıç noktası seçmek için fareyi kullanın ve sürekli sayıda hücre üzerine bir çizgi çizin, bu çizgi boyunca hücreler için bir yoğunluk grafiği oluşturulur, daha sonra yoğunluk ölçümleri tablosu ile birlikte oluşturulur. Tablonun ayrıca kırmızı, yeşil ve mavi floresan için piksel yoğunluğunun kırmızı olduğu mesafeyi de sağladığını unutmayın.Birimi mikrondur. Bu verileri dışa aktarmak için tabloya sağ tıklayın, tabloyu kaydet'i seçin ve bir metin dosyası olarak kaydedin. Yoğunluk profilini kaydetmek için, dışa aktarma seçeneğini seçin, açılır pencerede, etiketli görüntü dosyası, görüntü penceresinin formatı ve içeriği, tek bölme, veri olmak üzere iki seçenek arasında geçiş yapın.Ardından dosyayı kaydetmek için istemleri izleyin. Şimdi gereken her yoğunluk profili için bu işlemi tekrarlayın. Yazılımda, görüntü işlemeyi seçin ve ilgilendiğiniz görüntü dosyasını seçin.Ardından, ortak yerelleştirme analizi için coloc etiketli sekmeyi seçin ve tüm biçimlendirme seçeneklerine erişmek için tümünü göster'i seçin. Ekranın alt yarısındaki dört sekmeden ortak yerelleştirmeyi seçin ve tablo ve görüntü seçeneklerini belirleyin. Ardından, sekmenin üst kısmında, açılır metin, kapalı besier ile tanımlanan üçüncü simgeyi seçin.Tek bir çekirdeği çevrelemek için bu aracı kullanın. Değerler daha sonra tabloda görünecek ve kırmızı ve yeşil floresan için bir dağılım grafiği üretilecektir. Bu grafiğin ekseni hareketlidir ve bu, algılama kapısını kontrol eder.Çekirdek içindeki tüm piksel yoğunlukları pozitif sinyaller olarak kabul edilmelidir. DNA modifikasyonlarının seviyeleri çekirdek boyunca değiştiğinden, zayıf sinyalleri hesaba katmak için verileri kapatmıyoruz. Burada vurgulamalıyız ki, arka plan değerlerinin analize dahil edilip edilmemesi tartışmalıdır.Daha da önemlisi, örtüşme katsayısı, iki kanal arasındaki sinyal yoğunluklarındaki farklılıklardan bağımsızdır. Kişi korelasyon katsayısı, sinyaller arasında doğrusal bir ilişki olduğunu varsayar. Şimdi veri setini tamamlamak için bu çekirdek çevreleme işlemini tekrarlayın.Ardından verileri dışa aktarmak için tabloya sağ tıklayın ve verileri kaydetmek için seçenekleri izleyin. Bir ortak yerelleştirme görüntüsünü kaydetmek için, etiketli görüntü dosyası, görüntü penceresinin biçimi ve içeriği tek bölmesi, veri olmak üzere iki seçenekle dışa aktar komutunu kullanın, ardından dosyayı kaydetmek için seçenekleri izleyin. Beş metil sitozinin iki oksitlenmiş türevinin mekansal dağılımı, tarif edilen protokol kullanılarak hafadik progenitörlerin ayırt edilmesinde incelendi.Kırmızı ve yeşil sinyaller, iki farklı DNA modifikasyonunu temsil eder. Sinyaller, sınırlı örtüşme ile iyi tanımlanmıştır. Beklentilerle tutarlı olarak, iki sinyal yoğunluğunun ve karşılık gelen hücrenin profilleri birbiriyle güçlü bir şekilde örtüşmez.Farklı model, beş metil sitozinin musluğa bağlı oksidasyonunun, belirli kromatin bölgelerinde farklı oksitlenmiş türevler üretebileceğini düşündürmektedir. İki DNA modifikasyonunun benzer bir karşılaştırması Daoy medulloblastoma hücrelerinde ve BXD ependimoma hücrelerinde yapıldı. Her iki hücre soyu da pediatrik beyin tümörlerindendir.Miktar tayini, BXD hücrelerinin, Daoy hücrelerine kıyasla her iki sinyalin önemli ölçüde daha düşük seviyelerini sergilediğini ortaya koymaktadır. 5MC'nin oksitlenmiş türevlerinin bir sonraki kolokalizasyonu, farklılaşmamış hiPSC'lerde incelendi. Hepatik endoderm farklılaşması ve hiPSC'lerin indüksiyonundan 24 saat sonra.Bu analizde, sinyal ko-lokalizasyonu, farklılaşmamış hücrelerde beş CAC'nin azalmış bir büyüklüğüne atfedilebilecek olan farklılaşmanın indüksiyonu ile önemli ölçüde değişti. Bu videoyu izledikten sonra, 2.5d yoğunluk grafiklerinin ve profillerinin nasıl oluşturulacağını ve ortak yerelleştirme verilerinin nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız. Burada açıklanan görüntü analizi ve görselleştirme araçları, farklı deney gruplarındaki farklı DNA modifikasyonlarının sinyallerini karşılaştırmak için nispeten hızlı bir yol sağlayarak epigenetik araştırmalara katkıda bulunur.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa yaklaşık bir saat içinde yapılabilir. Mikroskopi sırasında aşırı maruz kalmaktan kaçınmak ve farklı deney grupları için aynı ayarları kullanmak önemlidir. Montajdaki hava kabarcıkları ve yetersiz daldırma, yerel floresan kaybına neden olabilir, bu nedenle, tarama alanının görsel olarak incelenmesi kritik öneme sahiptir.Prosedür, çekirdekleri bölümlere ayırarak ve Zen Blue kullanarak ilgi alanları oluşturarak daha da otomatikleştirilebilir. Bu bölgeler, birden fazla çekirdek üzerinde ortak yerelleştirme analizi yapmak için Zen Black'e aktarılabilir.

immunostaining-for-dna-modifications-computational-analysis-confocal

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Burada 3D mikroskopi ve analizler (3D immuno-DNA FISH) izledi DNA FISH immünofloresan ve DNA dizileri tarafından histon modifikasyonları eşzamanlı tespiti için bir protokol açıklar.

3D Nükleer teşkilatında değişiklikler Eğitim için 3D-korunmuş Tane Çekirdekle ilgili Kombine İmmünofloresan ve DNA FISH

Elektron spektroskopik görüntüleme, nükleik asidi proteinden nanometre çözünürlükte görüntüleyebilir ve ayırt edebilir. Transmisyon elektron mikroskobu örneklerinde etiketli proteinleri özel olarak etiketleyebilen miniSOG sistemi ile birleştirilebilir. Örnek olarak çift iplikli kopma onarım odaklarını kullanarak bu teknolojilerin kullanımını gösteriyoruz.

Elektron Spektroskopik Görüntüleme Kombinasyonunun miniSOG Etiketli DNA Onarım Proteinler Görselleştirme (ESI)

Lazer microirradiation yaşayan hücrelerde DNA onarım çalışmaları için yararlı bir araçtır. Çeşitli DNA lezyonlar ikna etmek için UVA lazerler kullanımı için bir metodolojik yaklaşım gösterilir. Normal hücre döngüsü tutar yerel microirradiation için bir yöntemi optimize; Böylece, ışınlanmış hücre mitoz devam edin.

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

Çift iplikli kırılmalara DNA tamiri lezyon ele sonra sadece onarım kompleksleri, tatili, aynı zamanda onların çözünürlük oluşumu gerektiren dinamik bir süreçtir. Burada, ayirt mikroskobu geçici ve uzun ömürlü çift iplikçikli tatili için bir araç olarak bu genom bakım mekanizma incelemek için kullanırız.

DNA onarım işlemleri, Darbe Gerilimlerinden ve uzun süreli iki iplikçikli DNA sonları ayirt mikroskobu ile karakterize

Bor nötron yakalama terapisinde (BNCT) kullanılan nötron karışık ışınıile aktive edilen radyasyona bağlı DNA hasar tepkisi tam olarak belirlenmemiştir. Bu protokol, nötron-karışık ışın ile ışınlama sonra insan kolon kanseri hücre hatlarında immünofloresan boyama tarafından onarım proteinlerinin radyasyonkaynaklı foci (RIF) tespit etmek için adım adım bir prosedür sağlar.

İnsan Kolon Kanseri Hücrelerinde DNA Hasarı ve Onarım Foci İmmünofloresan Görüntüleme

DNA hasarının ardından, insan hücreleri genomlarının bütünlüğünü geri yüklemek için gerekli onarım yollarını aktive ederler. Burada, dolaylı immünoffloresan yöntemini DNA onarım proteinlerini tespit etmek, mekansal ve zamansal işe alımlarını analiz etmek ve DNA hasarı nın olduğu yerlerde protein-protein etkileşimini sorgulamaya yardımcı olmak için bir araç olarak tanımlıyoruz.

DNA Onarım Proteinlerinin İmmünfluoresan Etkileşiminin Görselleştirilmesi

Mevcut protokolde, immünofluoresans bazlı bir yöntem kullanarak hücre döngüsünün S/G2 aşamasında DNA çift iplik ucu rezeksiyonunun nasıl görselleştirilerek görselleştirilmeyi gösteriyoruz.

BrdU-DNA Etiketlemesi Kullanılarak Küresel DNA Çift Telli Uç Rezeksiyonunun Değerlendirilmesi Hücre Döngüsü Ayrımcılığı Görüntüleme ile birleştiğinde

Bu protokol, hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidlerinde DNA hasarı onarım proteinlerini değerlendirme yöntemlerini açıklamaktadır. Burada kapsamlı kaplama ve boyama yöntemlerinin yanı sıra ayrıntılı, objektif niceleme prosedürleri de bulunmaktadır.

İmmünofloresan Tahlilleri ile Hasta Kaynaklı Yumurtalık Kanseri Organoidlerinde DNA Hasar Onarım Proteinlerinin Görselleştirilmesi

Mevcut protokol, topoizomeraz inhibitörleri ve formaldehit tarafından indüklenen ubikitilasyon, SUMOylation ve ADP-ribozilasyon dahil olmak üzere DNA-protein çapraz bağlarını (DPC'ler) ve bunların translasyon sonrası modifikasyonlarını (PTM'ler) tespit etmek ve ölçmek için değiştirilmiş bir yöntemi vurgulamaktadır, böylece DPC'lerin ve PTM'lerinin oluşumu ve onarımının incelenmesine izin verir.

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

Oosit genom bütünlüğünün korunması, elde edilen embriyoda genetik sadakati sağlamak için gereklidir. Burada, memeli dişi üreme hücrelerinde DNA çift sarmallı kırılmaları tespit etmek için doğru bir protokol sunuyoruz.

Fare Oositlerinde DNA Çift Sarmallı Kırılmaların Tespiti

Bu yöntem, insan T lenfositlerinde çeşitli nükleer organizasyon paternleri ile protein dağılımını değerlendirmek için bir immünofloresan protokolünü ve miktar tayini boru hattını tanımlar. Bu protokol, numune hazırlamadan başlayarak Fiji'de yarı otomatik analizin yürütülmesine kadar devam eden ve bir Google Colab not defteri tarafından veri işleme ile sonuçlanan adım adım rehberlik sağlar.

Çeşitli hücre tiplerinde nükleer cisimlerdeki dinamik değişiklikleri analiz etmek için çok yönlü bir boru hattı

Keşfedin DNA modifikasyonlarının immunostaining ile görselleştirilmesi ve konfokal mikroskopi görüntülerinin sayısal analizi. Bu yöntem epigenetik araştırmalarda sinyal yoğunluğu ve kollokalizasyon değerlendirmesi sağlar.

DNA değişiklikler için Immunostaining: Confocal görüntülerin sayısal analiz

Daha fazla video keşfet