Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Bu prosedürün genel amacı, Fagozom içeren sağlam ve zenginleştirilmiş bakterileri izole etmektir. Bu yöntem, patojenik mikroorganizmalar konakçı hücreleri istila ettiğinde Fagozom olgunlaşmasındaki değişiklikler ve antijen işlemesi gibi İmmünoloji alanındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Tekniğin temel avantajı, basit adımlar kullanarak ve özel ekipman gerektirmeden Fagozom içeren yüksek kaliteli bakteriler üretmesidir.

Yönteme yeni olan kişiler, metodoloji olmayanlara kıyasla teknik olarak ulaşılabilir bulacaktır. Bu yöntemi geliştirme fikri ilk olarak, hücre içi patojenlerin Fagozomları kendi avantajlarına göre ele geçirme mekanizmalarını incelerken aklımıza geldi. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir doktora sonrası olan Saray Gutierrez olacak.

Salmonella Typhimurium kültürünü başlatmak için, tek bir bakteri kolonisini 5 mililitre beyin kalp infüzyon suyuna aşılamak için bir bakteri halkası kullanın. Daha sonra süspansiyonu çalkalarken gece boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatörde inkübe edin. Bu bakteri süspansiyonunun bir mililitresini ertesi gün konik bir şişede 19 mililitre BHI suyuna aktarın.

Çalkalarken 37 santigrat derece inkübatörde tekrar inkübe edin. OD600 bire ulaştığında, şişeyi inkübatörden çıkarın ve kültürü 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra tüpü 5400 x G'de 4 santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkardıktan sonra, bakteri peletini 10 mililitre steril PBS'de tekrar askıya alın. Santrifüjlemeyi bir kez tekrarladıktan sonra, peleti 4.9 mililitre PBS'de tekrar askıya alın. Daha sonra, bakteri süspansiyonuna 100 mikrolitre taze hazırlanmış Biotin bağlama solüsyonu ekleyin.

Bu süspansiyonu beş adet 1.5 mililitrelik tüpe böldükten sonra, iki saat boyunca 350 rpm'de sürekli çalkalayarak oda sıcaklığında bir termal blok içinde inkübe edin. Tüpleri oda sıcaklığında 15.000 x G'de on dakika santrifüjledikten sonra, süpernatanı atın. İki santrifüj adımından ve Biotin bağlama çözeltisinin tamamen çıkarılmasından sonra, bu Biotin kodlu bakteriyi tek bir 1.5 mililitrelik tüpte bir mililitre steril PBS'de yeniden süspanse edin.

100 mikrolitre streptavidin konjuge manyetik boncuk çözeltisini 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Çözücüyü tüpten çıkardıktan sonra, tüpü manyetik raftan çıkarın. Daha sonra tüpte kalan boncukları bir mililitre Biotin kodlu bakteri süspansiyonu ile tekrar süspanse edin.

Tüpü 350 rpm'de çalkalarken oda sıcaklığında bir termo blok üzerinde bir saat inkübe edin. Ardından, tüpü beş dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin. Duvara yapışmayan bakterileri çıkarmak için bir pipet kullanın ve kodlanmamış bakteri etiketli yeni bir tüpe aktarın.

Duvara yapışan manyetik boncuklu tüp Biotin Streptavidin kodlu bakteri içermektedir. Biotin Streptavidin kodlu bakteri içeren tüpü manyetik raftan çıkarın ve bir mililitre steril PBS'de yeniden süspanse edin. Tüp beş dakika boyunca manyetik rafta kaldıktan sonra PBS'yi çıkarın.

Son olarak, yıkanmış Biotin Streptavidin kodlu bakterileri 500 mikrolitre steril PBS'de tekrar süspanse edin ve tüpü kodlanmış bakteri olarak etiketleyin. Enfeksiyondan bir gün önce, plaka, yüzde on FBS ile desteklenmiş RPM'lerde altı santimetrelik bir tabakta BMDM'leri tamamen farklılaştırdı. Ertesi gün, kodlanmış bakteri süspansiyonunu beş dakika boyunca dört santigrat derecede 15.000 x G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkardıktan sonra, bakteri peletini yüzde on FBS ile desteklenmiş RPMI ortamında yeniden askıya alın. Ortamı BMDM'lerden çıkarın ve hücreleri enfekte etmek için RPMI ortamına beş mililitre kodlanmış bakteri süspansiyonu ekleyin. Fagositozu senkronize etmek için, oda sıcaklığında on dakika inkübe edin.

Daha sonra Fagositozu başlatmak için, yüzde beş Karbondioksit inkübatörde 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ortamı bulaşıklardan çıkarın ve içselleştirilmemiş bakterileri uzaklaştırmak için hücreleri RPMI'de üç kez yıkayın. Mililitre Gentamisin başına 50 mikrogramda yüzde on FBS içeren on mililitre RPM'de fagositize edilmemiş bakterileri öldürmek.

Son olarak, enfekte BMDM'leri istenen zaman noktasına kadar yüzde beş Karbondioksit inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. İlk olarak, kullanımdan hemen önce DTT ve Sitokalasin B ve üretici tarafından önerilen Proteaz ve Fosfataz İnhibitörlerini ekleyerek gerekli Fagozom İzolasyon Tamponu A'nın hacmini hazırlayın. Ortamı enfekte olmuş hücrelerden istenen zaman noktasında çıkarın ve hücreleri oda sıcaklığına önceden ısıtılmış steril PBS ile yıkayın.

Daha sonra tabağa 750 mikrolitre Fagozom İzolasyon Tamponu A ekleyin ve 20 dakika buz üzerinde inkübe edin. Ara sıra tabağı sallamayı unutmayın. Ardından, 250 mikrolitre Fagozom İzolasyon Tamponu B ekleyin ve ardından tamponun yüzeyi tamamen kapladığından emin olmak için plakaları sallayın.

Hücreleri tabaktan çıkarmak için lastik bir polis memuru kullanarak hücreleri nazikçe kazıyın ve önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Ardından, hücre süspansiyonunu 26 gauge bir iğneden en az 15 kez geçirmek için bir mililitrelik bir şırınga kullanın. Ardından, hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin.

Manyetik boncuklara bağlı parçacıklar, kodlanmış S.Tyhimurium içeren Fagozomlardır. Daha sonra, hücresel bileşenlerin geri kalanını içeren süspansiyonu, Sitozol olarak etiketlenmiş yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. İzole edilmiş Fagozomları içeren tüpü raftan çıkarın ve bir mililitre steril PBS'de yeniden askıya alın.

Tüpü beş dakika boyunca manyetik rafa geri yerleştirin ve ardından PBS'yi çıkarın. Bu yıkamayı PBS ile bir kez tekrarladıktan sonra, PBS'yi çıkarın ve son olarak, S.Typhimurium içeren Fagozomları gerekli tamponda tekrar süspanse edin. Konfokal mikroskopi ile S.Typhimurium Biotinilasyonunun etkinliğini değerlendirmek için, BMDM'ler Biotin ile etiketlenmiş mCherry S.Typhimurium ile enfekte edildi.

Cy5-Streptavidin ile fiksasyon ve inkübasyondan sonra, başarılı Biyotinilasyon Cy5-Streptavidin floresan sinyali ile doğrulandı. Bu sinyal sadece Biyotinile mCherry S.Typhimurium'da gözlenirken, Biyotinile edilmemiş mCherry S.Typhimurium'da sinyal yoktu. İzole edilmiş fagozomların immünoblok analizi, fagozomlarda S.Typhimurium eksprese eden mCherry'nin sitozolik fraksiyona kıyasla önemli ölçüde zenginleştiğini gösterdi.

İzole fagozomlarda endozom ve lizozom belirteçleri kullanılarak yapılan immünoblok analizi, enfeksiyondan dört saat sonra izole edilen fagozomlarda test edilen belirteçlerin, enfeksiyondan 30 dakika sonrasına kıyasla zenginleştiğini gösterdi. Bu protokol Staphylococcus aureus'a uygulandığında, S.aureus'u eksprese eden GFP'nin başarılı biyotinilasyonu gösterilmiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, araştırmacı tarafından enfeksiyon için seçilen kuluçka süresine bağlı olarak yaklaşık bir buçuk saat içinde yapılabilir.

Fagozom içeren bakterilerin izolasyonunun başarısını sağlamak için, lütfen tamponların belirtilen konsantrasyonları içerdiğinden ve hücrelerin homojen bir şekilde kaplanmasını sağlamak için plakaların sallandığından emin olun. Ayrıca, hücreleri sıyırırken ve hücre süspansiyonunu iğneden geçirirken nazik olun. Bu prosedürü takiben, proteomik veya metabolomik gibi diğer teknikler, ilgili patojenik faktörler altında patojenlerin neden olduğu değişikliği incelemek için izole Fagozomlarla gerçekleştirilebilir.