Name: Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Öğrenin, makrofajlardan Salmonella typhimurium içeren fagosomları izole etme yöntemini. Biyotin ve streptavidin kullanarak basit adımlarla yüksek kaliteli fagosom elde edilir. Bu teknik, immünoloji araştırmalarında yeni olanlar için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Robinson'ın laboratuarında araştırma hücresel stres yanıt Aging-Associated hastalıkları, Köln Üniversitesi, Almanya Köln mükemmellik kümede fon tarafından desteklenmektedir (CECAD; DFG içinde mükemmellik girişimi Alman Federal tarafından finanse edilen ve hükümetlerin devlet) ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Köln servet ve Maria-Pesch Vakfı Üniversitesi Köln, Almanya dan gelen hibe.

patojen S. kullanımıyla ilgili tüm adımları Typhimurium BSL-2 veya daha yüksek biyolojik güvenlik seviye yapılmalıdır. Kültür ve S. kaplama Typhimurium gibi kemik iliği türevi makrofajlar (BMDMs) enfeksiyonu önlemek amacıyla laminar akış başlık altında gerçekleştirilmelidir. S. yalıtım Typhimurium-phagosomes içeren herhangi bir BSL-2 laboratuvar tezgah üzerinde gerçekleştirilebilir.
 kemik iliği çıkarma fareler makrofajlar içine onun farklılaşma için hayvan refah kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilen ve doğa, Kuzey Ren-Vestfalya Eyalet ajansı tarafından onaylanmış Çevre ve tüketici koruma [Landesamt für Natur, Umwelt ve Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen; Dosya no: 84-02.05.40.14.082 ve 84-02.04.2015.A443] ve Köln Üniversitesi.
 1. Culturing S. typhimurium <ol><li>Inoculate S. Typhimurium (SL1344 zorlanma) üzerinden 5 mL bakteriyel bir döngü kullanarak beyin kalp infüzyon (BHI) suyu içine bakteriyel bir koloni.</li>
	<li>Bakteriyel süspansiyon bir kuluçka 37 ° C'de gecede sallayarak ile kuluçkaya.</li>
	<li>19 mL konik bir şişesi BHI suyu içine 1 mL bakteriyel süspansiyon, ertesi gün, transfer ve sallayarak ile bir kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	S. <li>izlemek 600 optik yoğunluk (OD) ölçme tarafından typhimurium büyüme nm (OD 600) bir Spektrofotometre ile. Ölçümler yaklaşık her 30 dk. alınmalıdır</li>
	<li>Ne zaman OD 600 1.0 ulaşır, inkübatör ve transfer 50 mL tüp içine bakteriyel süspansiyon kaldırın. Santrifüj kapasitesi bakteri 5400 x g 15dk için de 4'te ° C.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve 10 mL steril fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) resuspend.</li>
	<li>Vasıl 5400 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve 4.9 mL steril PBS bakterilerde resuspend.</li>
</ol> 2. S. typhimurium NHS-Biotin/Streptavidin-Birleşik manyetik boncuklar ile kaplanması <ol><li>10 mg/ml eklemek 100 µL biotin (NHS-Biotin çözünmüş Dimetil sülfoksit, DMSO) çözüm taze hazırlanmış, bakteriyel süspansiyon bağlama önceki adımda hazırlanan. Örneğin, NHS-Biotin 5 mg 0.5 mL steril DMSO içine oranında seyreltin. Mix düzgün tarafından yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting.</li>
	<li>Karışımı beş 1,5 mL tüpler içine split.</li>
	<li>Incubate 2 h üzerinde bir termo (RT) oda sıcaklığında sabit 350 rpm'de sallayarak ile için.</li>
	<li>RT, 10 dak için 15.000 x g, tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
	<li>1 ml steril PBS, RT, 10 min için 15.000 x g, santrifüj resuspend ve süpernatant atın.</li>
	<li>Tekrar adım 2.5 iki kez daha çözüm bağlama fazlalığı biyotin tamamen çıkarmak.</li>
	<li>Sonra son yıkama, pelet 1 mL steril PBS resuspend.</li>
	<li>10 mg/mL manyetik boncuklar streptavidin Birleşik çözüm 1.5 mL tüp içine 100 µL transfer ve 5 dakika süreyle manyetik rafta bırakın</li>
	<li>Solvent bir pipet ile kaldırmak, streptavidin-Birleşik manyetik boncuklar çözüm manyetik raf almak ve 1 mL 2.7 adımda hazırlanan biotin kaplı-bakteriyel süspansiyon ile resuspend.</li>
	<li>Sürekli 350 rpm'de sallayarak ile 1s için RT, bir termo üzerinde Incubate.</li>
	<li>Çözüm manyetik raf yerleştirin; için 5 dakika bekleyin ve sonra bir pipet ile duvara uygun değil bakteri kaldırın (olarak etiketlenmiş bir tüp devam &#34; sigara kaplı bakteri &#34;). Tüp mıknatıs ile temas duvarına kalarak kesir biotin/streptavidin-kaplı bakteri olduğunu.</li>
	<li>Manyetik raf etiketli bakteri içeren tüpü çıkarması ve 1 mL steril PBS resuspend.</li>
	<li>Tekrar manyetik rafına yerleştirmek için 5 dakika bekleyin ve PBS kaldırmak için bir pipet kullanın.</li>
	<li>Adımları yineleyin 2,13 ve 2.14 iki kez daha streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile kaplı değil tüm bakteriler kaldırmak için.</li>
	<li>Son yıkama sonra kaplı bakteri steril PBS 500 µL içinde resuspend ve tüp olarak etiket &#34; kaplı bakteri &#34;.</li>
	<li>Saymak birimleri (cfu) her iki oluşturan colony &#34; sigara kaplı bakteri &#34; ve &#34; kaplı bakteri &#34; tarafından BHI agar plakalar üzerinde seri dilutions kaplama çözümleri. Yaklaşık 2 x 10 8 cfu/mL kaplı-bakteri gelen ilk bakteriyel süspansiyon 20 mL OD 600 1.0 ile elde edilir. Ertesi gün makrofajlar bulaştırmak için kullanılmak üzere 4 ° C kaplı-bakteriyel süspansiyon devam.</li>
</ol> 3. Enfeksiyon BDMDs <ol><li>ne zaman bakteri kaplı biotin ve streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile aynı günde tam 6 cm yemekler yemek başına 5 x 10 6 hücre yoğunluğu, farklılaşmış BMDMs 22 plaka.</li>
	<li>Bir sonraki günü kaplı-bakteriyel süspansiyon 5 dak için 15.000 x g, saat 4'te santrifüj kapasitesi ° C.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve % 10 fetal sığır serum ile (FBS) takıma Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) orta 10 x 10 6 cfu/mL konsantrasyonu resuspend.</li>
	Makrofajlar enfeksiyon (MOI) 10, çokluğu, bulaştırmak için <li>Orta BMDMs kaldırın ve hazırlanan kaplı-bakteriyel süspansiyon 5 mL ekleyin. En iyi MOI her hücre türü ya da izole phagosomes deneysel amacı için değerlendirildi.</li>
	<li>RT 10 dk fagositoz eşitlemek için Incubate.</li>
	<li>Incubate % 5 CO 2 kuluçka fagositoz başlatmak 30 dk 37 ° C'de. Diğer hücre tipleri farklı kuluçka kez bakteri içselleştirilmesi sağlamak için gerektirebilir.</li>
	<li>Bakteri içeren orta gelen yemekler kaldırmak ve sigara içselleştirilmiş bakteri kaldırmak için üç kez RPMI hücrelerle yıkayın.</li>
	<li>Sonunda sigara phagocytized bakterileri öldürmek için RPMI %10 FBS ve 50 µg/mL viomisin içeren 10 mL ekleyin.</li>
	İstenen saat noktayı kadar <li>37 ° c % 5 CO 2 ile enfekte BMDMs kuluçkaya. İstenen saat noktası deneysel olarak bakteri ve hücre türü kullanılan ve analiz amacı göre belirlenmelidir. S. phagosome-endosome füzyon olaylarda erken çalışma için BMDMs, Typhimurium enfekte bir 30 dk kuluçka önerilir. Daha sonra olayları analiz için phagosomes 2 saat veya 4 h, kuluçka sonra elde edilebilir. Makrofajlar S. ile uzun süreli inkübasyon Typhimurium 24 h ötesinde makrofajlar ölümle sonuçlanır. Phagosome ayıklama muhtemelen biotin molekülleri düşmesine neden olabilir önce hücre içi enfeksiyon genişletilmiş. Ancak, biz kaybı biotin kaplı-bakteri kadar 24 h gözlemleme</li>
</ol> 4. S. yalıtım Typhimurium-Phagosomes içeren <ol><li>hazırla gerekli phagosome hacmi yalıtım arabellek (1 mM, Cytochalasin B bir final için son bir konsantrasyon dithiothreitol (DTT) ekleyerek bir 50 mM borular, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA) üretici tarafından önerilen gibi 10 µM ve proteaz ve fosfataz inhibitörleri konsantrasyon. 
	Not: DTT ve Cytochalasin B phagosome yalıtım arabellek A eklenmesi gerekir her zaman hemen önce kullanmak. Cytochalasin B hücre membran rüptürü kolaylaştırmak sitoiskeleti bozan.</li>
	<li>İstediğiniz zaman gelin, enfekte hücreleri ortamından çıkarmak ve steril PBS için RT. ısındı yıkayın</li>
	<li>Phagosom ekleyin 750 µLe yalıtım çanak A tampon ve buz üzerinde 20 dk kuluçkaya. Farklı hücre sayıları kullanırken, yalıtım arabellek A hacmi orantılı olarak ayarlanması.</li>
	<li>Ekleyin 250 µL phagosome yalıtım arabelleği B (50 mM borular, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA, 220 mM Mannitol ve 68 mM Sükroz). Rock arabellek yemeğin tam yüzey ulaştığından emin olmak için plaka. Farklı hücre sayıları kullanırken, yalıtım arabellek B hacmi orantılı olarak ayarlanması.</li>
	<li>Hücreleri nazikçe bir lastik polis kullanarak kazıma yemek kaldırmak ve önceden soğutulmuş 1,5 mL tüp transfer.</li>
	<li>26 G iğne (bir aspirasyon artı hücre süspansiyon sayısı bir fırlatma bir kez olarak) en az 15 kere 1 mL şırınga kullanarak hücre süspansiyon geçer. Bu BMDMs sitozolik içeriğini serbest bırakmak için yeterli. İğne geçer sayısı her hücre türü için optimize edilmiş olması gerekir.</li>
	<li>Hücre süspansiyon manyetik raf yerleştirin ve 5 dakika bekleyin. Parçacıklardır mıknatıs için bağlı kaplı - S. içeren phagosomes Typhimurium. Süspansiyon hücresel bileşenleri geri kalanı içerir.</li>
	<li>Süspansiyon olarak etiketlenmiş bir 1,5 mL tüp içine transfer &#34; sitozol &#34;.</li>
	<li>İzole phagosomes ile tüp manyetik raf çıkarmak ve onları 1 mL steril PBS resuspend.</li>
	<li>Phagosome süspansiyon manyetik rafına yerleştirmek için 5 dakika bekleyin ve PBS kaldırın.</li>
	<li>Tekrarlama adım 4,9 ve izole S. yıkamayı 4.10 Typhimurium-phagosomes içeren.</li>
	<li>Son olarak PBS kaldırmak ve phagosomes resuspend gerekli arabellek; Örneğin, bir radioimmunoprecipitation tahlil (RIPA) arabellek protein analizi için. Yaklaşık 50-200 µg protein hücrelerinin başlangıç tutarı ve enfeksiyon MOI bağlı olarak bu protokol sonrası örnek başına elde edilir.</li>
</ol>

<ol><li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+receptors%2C+signal+integration%2C+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+going+through+the+acid+test%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).</li>
<li>Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+V-ATPase+along+the+Endocytic+Pathway+Occurs+through+Reversible+Subunit+Association+and+Membrane+Localization%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization.</a> Plos One. 3 (7), e2758(2008).</li>
<li>Forgac, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vacuolar+ATPases%3A+rotary+proton+pumps+in+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).</li>
<li>Marshansky, V., Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V-type+H%2B-ATPase+in+vesicular+trafficking%3A+targeting%2C+regulation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).</li>
<li>Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+delivery+of+procathepsin+D+to+phagosomes%3A+Implications+for+phagosome+biogenesis+and+parasitism+by+Mycobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium.</a> Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).</li>
<li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases%3A+Physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology.</a> Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).</li>
<li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagosome%3A+Compartment+with+a+license+to+kill%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The phagosome: Compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).</li>
<li>Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+A+few+bugs+in+the+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membrane+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: A few bugs in the system.</a> J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).</li>
<li>Turk, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+cathepsins%3A+From+structure%2C+function+and+regulation+to+new+frontiers%5BTitle%5D)+AND+%22Bba-Proteins+Proteom%22%5BJournal%5D)">Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers.</a> Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).</li>
<li>Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. <a target="_blank" href="http://serials.unibo.it/cgi-ser/start/en/spogli/df-s.tcl?prog_art=5883500">Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing.</a> Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).</li>
<li>Robinson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+Phenolic+Glycolipid+Inhibits+Phagosome+Maturation+and+Subverts+the+Pro-inflammatory+Cytokine+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response.</a> Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).</li>
<li>Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+and+Legionella+pneumophila+phagosomes+exhibit+arrested+maturation+despite+acquisition+of+Rab7%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7.</a> Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).</li>
<li>Smith, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+distinct+phospholipases+C+of+Listeria+monocytogenes+have+overlapping+roles+in+escape+from+a+vacuole+and+cell-to-cell+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread.</a> Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).</li>
<li>Woolard, M. D., Frelinger, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outsmarting+the+host%3A+bacteria+modulating+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response.</a> Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).</li>
<li>Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+pathogenicity+island+2-encoded+type+III+secretion+system+mediates+exclusion+of+NADPH+oxidase+assembly+from+the+phagosomal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane.</a> J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).</li>
<li>Ohl, M. E., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella%3A+A+model+for+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Salmonella: A model for bacterial pathogenesis.</a> Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).</li>
<li>Mills, S. D., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+Salmonella+typhimurium+and+Yersinia+pseudotuberculosis-containing+phagosomes+from+infected+mouse+macrophages%3A+Y-pseudotuberculosis+traffics+to+terminal+lysosomes+where+they+are+degraded%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded.</a> Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).</li>
<li>Buchmeier, N. A., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Macrophage+Phagosome-Lysosome+Fusion+by+Salmonella-Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium.</a> Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).</li>
<li>Luhrmann, A., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+purify+bacteria-containing+phagosomes+from+infected+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages.</a> Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).</li>
<li>Steinhauser, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-labeling+facilitates+a+novel+magnetic+isolation+procedure+to+characterize+pathogen-containing+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes.</a> Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow-Derived+Macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+and+intracellular+localization+of+Brucella+spp.+in+Vero+cells%3A+fluorescence+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy.</a> Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).</li>
<li>Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+trafficking+of+Brucella+abortus+in+J774+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages.</a> Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).</li>
<li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).</li>
<li>Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+phagosomal+proteomes%3A+from+latex-bead+to+bacterial+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes.</a> Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).</li>
<li>Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systems+biology+approach+to+study+the+phagosomal+proteome+modulated+by+mycobacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Clin+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections.</a> Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).</li>
<li>Rogers, L. D., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+phagosomal+proteome+and+the+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum.</a> P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

S. yalıtım için yeni bir yöntem Typhimurium-phagosomes bakterileri biotin ve streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile kaplama tarafından içeren burada anlatılan. Hücre zarının nazik bozulma sonra bakteri içeren phagosomes kolayca bir manyetik raf kullanarak elde edilebilir. Gösterdiğimiz bakteri etiketleme iltihap ikna etmek için kapasite patojenin koruyan ve ana hücrenin fagositik özelliğini değiştirmez. Bakteri ve endosome/lysosome bu yöntemle elde edilen phagosomes önemlisi, zenginleştirilmiş işa...

Makrofajlar algılayan, yutmak ve herhangi bir yabancı parçacık mikroorganizmalar bakteri gibi işgal için apoptotik hücreler arasında değişen periferik dokularda mevcut aşağılamak özel fagositik hücreler dolaşmaktadır. Reseptör aracılı yüzey tanıma patojen belirli işaretleri (patojen ilişkili moleküler desen veya PAMPs da bilinir) mikroorganizmalar yüzeyinde yaygın olarak mevcut makrofajlar içinde hücresel membran karmaşık bir yeniden yapılanma başlatmak. sipariş surround ve patojen1işbirliği için.
Yutulmak patojen sonra phagosome bilinen bir hücre içi vezikül makrofaj tarafından yer alıyor. Diğer veziküller endosomes ve organellerin gibi olaylarla fisyon ve füzyon dizi sayesinde patojen içeren phagosome phagosomal içerik ortadan kaldırılması için gerekli proteinleri bir dizi satın aldı. Bu nedenle, phagosome enzimatik kompozisyon phagosome olgunlaşma2olarak bilinen bu işlem süresince son derece değişkendir.
Fagositoz kısa bir süre sonra karmaşık katmaninin ATPaz (v-ATPaz) Fusion endosomes3phagosome membran dahil multimeric. Bu karmaşık ATP sitozol phagosome4Lümen için gelen pompa proton için kullanır. Phagosome asitleştirme diğer veziküller5 füzyon olaylarla ve pH bağımlı degradative enzimler6çok sayıda aktivasyonu için gereklidir. Phagosome membran üzerinde hızlı bir şekilde monte başka bir multimeric enzimatik karmaşık NADPH-oksidaz (NOX) karmaşık değil. NOX karmaşık NADPH bu phagosome Lümen salgılanan ve bu önemli ölçüde katkı7yutulmak mikroorganizmaların öldürülmesi için Reaktif oksijen türleri (ROS) üretmek için oksitlenir.
Olgunlaşma ilk adımları uyguladığınızda, phagosomes işaretleri genellikle Rab5 ve erken ve geç endosomes v-ATPaz8V0 alt birim ile birlikte sırasıyla Rab7 gibi mevcut. Organellerin ve geç endosomes phagosomes füzyonu phagocytized patojen maruz hydrolytic enzimler cathepsin proteaz, lipaz ve β-galaktozidaz9gibi çok çeşitli sonuçlanır. Lümen asitleştirme da bu enzimlerin aktivasyonu için gereklidir. Örneğin, etkin kısa form üretmek için cathepsin D bölünme pH bağımlı10' dur. Bu enzimler patojen bozulmasına yol açar ve makrofaj MHC kompleksi (MHC) Sınıf II molekülleri bir adaptif immün yanıt11tetiklemek için T hücrelere tarafından sunulan kısa peptidler patojen kaynaklı üretim aracılık.
Bu nedenle, phagosome olgunlaşma doğuştan gelen bağışıklık yanıtı için çok önemlidir ve bağışıklık sisteminin doğuştan gelen ve edinilmiş silah bağlar. Patojenler ortadan kaldırılması phagosome olgunlaşma yukarıda açıklanan sürecinde makrofajlar tarafından üstesinden gelmek için stratejiler geliştirmişlerdir hiç de şaşırtıcı değil. Örneğin, hücre içi bakterilerin Mycobacterium tüberküloz ve Legionella pneumophila inhibe v-ATPaz derleme ve bunun sonucunda Lümen asitleştirme12,13 phagosome olgunlaşma önlemek . Listeria Monositogenez veya Shigella flexneri gibi diğer bakteri sitozol14,15kaçmak için phagosome membran gözenek oluşumu teşvik. Öte yandan Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) phagosome içinde onun çoğaltma16için uygun bir yer haline dönüştürmek için çarpıtma özelliklerini değiştirmek yapabiliyor. Bu yeteneği S. yapar typhimurium patojen-aracılı girişim phagosome olgunlaşma eğitim için çok ilginç bir model.
S. typhimurium insanlarda mide iltihabı neden olur fakültatif intraselüler bir bakteridir. Lamina propria, S. işgalinden sonra Typhimurium bakteriler hızla tespit ve makrofajlar tarafından phagocytized ve phagosomes17içinde bulunan. Bazı raporlar daha önce o S. tarif var Typhimurium-içeren phagosomes vericiler için hem endosomes hem de organellerin18sunmak ve diğer çalışmalar phagosome-lysosome füzyon S. engelledi bulduk Typhimurium enfeksiyonu19.
Başlangıçta, phagosome olgunlaşma üzerine S. Typhimurium enfeksiyonu ayirt mikroskobu tarafından araştırmış. Bakteri içeren izolasyonu için yöntemlerin geliştirilmesi sayesinde phagosomes etkin phagosome içerik endosome ve lysosome açısından daha doğru bir çalışma. Bugüne kadar bakteri içeren yalıtımı için kullanılan ana yöntem phagosomes hücre altı ayırma Sükroz adım degradeler18,20olduğunu. Ancak, bu yöntem phagosomes mekanik zarar verebilir, phagosomal bileşenleri (protein ve yağlar) kararlılığını etkileyebilir ve zaman alıcı birden fazla Santrifüjü adımları gerektirir. Ayrıca, bir ultracentrifuge kullanımını gerektirir: her laboratuvar için erişilebilir değil özel ekipman parçası.
Son zamanlarda, yeni bir yaklaşım bakteriyel içeren izolasyonu için uygulanmış olan bakteriyel patojenler biotinylated lipopetide (Lipobiotin) ile etiketlenir phagosomes, çıkarılan manyetik boncuklar21 streptavidin Birleşik kullanarak . Önerdiğimiz alternatif tamamlayıcı bir yöntem bakteriyel yüzey Amin içeren oluştururlar NHS-Biotin ile etiketleme tarafından streptavidin Birleşik manyetik boncuklar tarafından takip. Bu yöntemle elde edilen phagosomes son derece endosome ve lysosome işaretleyicilerini zenginleştirilmiş ve deneyleri, protein analizi omics analiz için geniş bir yelpazesi için kullanılır. Ayrıca, ultracentrifuges gibi özel ekipman gerektirmez. Ayrıca, Santrifüjü adımları ortadan kaldırarak, phagosomes mekanik hasar ve istihdam süreyi önemli ölçüde azalır. Bu yöntem gibi gram-pozitif Staphylococcus aureusda bu el yazması dahil, diğer bakteriler içeren phagosomes yalıtım için kolayca adapte edilebilir. Özet olarak, bu yöntem S. yalıtım için Typhimurium-phagosomes içeren bu basit, düşük maliyetli, ve daha az zaman klasik yalıtım Sükroz tarafından alıcı degrade-ultrasantrifüj son derece oluşturma, bakteri içeren phagosomes zenginleştirilmiş.

<table><tbody><tr><td>EZ-Link NHS Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20217</td><td></td></tr><tr><td>FluidMag Streptavidin</td><td>Chemicell</td><td>4205</td><td></td></tr><tr><td>BORULAR</td><td>Carl Roth</td><td>9156.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>A537.4</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Carl Roth</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Carl Roth</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>Halt Proteaz ve Fosfataz inhibitör kokteyli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>DYNAL veya DynaMag Mıknatıs</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000 Spektrofotometre</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>Bakteri döngüsü (10 & mikro; l)</td> <td>Sarstedt</td><td>86.1562.010</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344</td><td>Leibniz Enstitüsü DSMZ-Alman Mikroorganizmalar</td><td></td><td></td>ve Hücre Kültürleri koleksiyonu</tr><tr><td>RPMI</td><td>Biochrom</td><td>FG1415</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>SA1011</td><td></td></tr><tr><td>anti-beta-aktin antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-47778</td><td></td></tr><tr><td>anti-mCherry antikoru</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-34974</td><td></td></tr><tr><td>anti-Rab5 antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-46692</td><td></td></tr><tr><td>anti-Rab7 antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-10764</td><td></td></tr><tr><td>anti-v-ATPaz (V0) antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-28801</td><td></td></tr><tr><td>anti-v-ATPaz (V1) antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-20943</td><td></td></tr><tr><td>anti-katepsin D antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-6486</td><td></td></tr><tr><td>anti-Tomm20 antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-17764</td><td></td></tr><tr><td>anti-kalneksin antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-46669</td><td></td></tr><tr><td>anti-GAPDH antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-20357</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden phagosomes içeren

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium insanlarda mide iltihabı neden olur fakültatif intraselüler bir bakteridir. Lamina propria, S. işgalinden sonra Typhimurium bakteriler hızla tespit ve makrofajlar tarafından phagocytized ve bozulmuş için phagosomes bilinen veziküller içinde bulunan. S. yalıtım Typhimurium-içeren phagosomes yaygın olarak kullanılan çalışma nasıl S. Typhimurium enfeksiyonu bakteriyel bozulma önlemek için phagosome olgunlaşma sürecinin değiştirir. Klasik, yalıtım bakteri içeren phagosomes Sükroz degrade Santrifüjü tarafından gerçekleştirilen. Ancak, bu işlem zaman alır ve özel ekipman ve belirli bir ölçüde beceri gerektirir. Burada açıklanan S. yalıtım için basit ve hızlı bir yöntem olduğunu Typhimurium-makrofajlar üzerinden phagosomes bakterileri biotin streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile kaplama tarafından içeren. Bu yöntemle elde edilen phagosomes deneyleri, protein, metaboliti ve lipid çözümlemesi gibi geniş bir yelpazesi için izole phagosomes kullanımını sağlayan seçtikleri herhangi bir arabellekte askıya alınabilir. Özet olarak, bu yöntem S. yalıtım için Typhimurium-phagosomes içeren belirli, verimli, hızlı, en az ekipman için ve yalıtım Sükroz degrade-ultrasantrifüj tarafından klasik yöntem'den daha çok yönlüdür.

Yalıtım bakteri içeren phagosomes bu iletişim kuralı tarafından bakteri biotinylation bir ilk adım olarak gerektirir. Biz bu nedenle S. etkinliği değerlendirilir Typhimurium biotinylation biotinylated ile enfekte BMDMs confocal mikroskobu analizi tarafından mCherry -S. typhimurium Cy5-Streptavidin ile Etiketlenmiş. Kısaca, BMDMs mCherry -Sbu iletişim kuralıyla açıklandığı gibi bulaşmış. Typhimurium daha önce biotinylated ama streptavid...

Biz burada Salmonella typhimuriumyalıtım için basit ve hızlı bir yöntem tarif-biotin ve streptavidin bakterilerle kaplama tarafından phagosomes üzerinden makrofajlar içeren.

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Bu prosedürün genel amacı, Fagozom içeren sağlam ve zenginleştirilmiş bakterileri izole etmektir. Bu yöntem, patojenik mikroorganizmalar konakçı hücreleri istila ettiğinde Fagozom olgunlaşmasındaki değişiklikler ve antijen işlemesi gibi İmmünoloji alanındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Tekniğin temel avantajı, basit adımlar kullanarak ve özel ekipman gerektirmeden Fagozom içeren yüksek kaliteli bakteriler üretmesidir.Yönteme yeni olan kişiler, metodoloji olmayanlara kıyasla teknik olarak ulaşılabilir bulacaktır. Bu yöntemi geliştirme fikri ilk olarak, hücre içi patojenlerin Fagozomları kendi avantajlarına göre ele geçirme mekanizmalarını incelerken aklımıza geldi. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir doktora sonrası olan Saray Gutierrez olacak.Salmonella Typhimurium kültürünü başlatmak için, tek bir bakteri kolonisini 5 mililitre beyin kalp infüzyon suyuna aşılamak için bir bakteri halkası kullanın. Daha sonra süspansiyonu çalkalarken gece boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatörde inkübe edin. Bu bakteri süspansiyonunun bir mililitresini ertesi gün konik bir şişede 19 mililitre BHI suyuna aktarın.Çalkalarken 37 santigrat derece inkübatörde tekrar ink

isolation-salmonella-typhimurium-containing-phagosomes-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Gutiérrez, S., vd. al.,  Makrofajlardan Salmonella typhimurium içeren Fagozomların İzolasyonu. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, deneysel kullanıma uygun temiz, metabolik olarak aktif bir bakteri süspansiyonu elde etmek için Salmonella typhimurium'un kültürlenmesini ve hazırlanmasını göstermektedir.

Salmonella typhimurium Kültürünün Hazırlanması

Kaynak: Sigal, N. ve diğerleri. Makrofaj Hücrelerinde Hücre İçinde Yetiştirilen Listeria monositogenlerinden RNA Arındırma.  J. Vis. Exp. (2016).Bu video, enfekte kemik iliği kaynaklı makrofajlardan (BMDM) içselleştirilmiş patojenik bakterilerin izole edilmesini gösteriyor. Bakterilerin konak hücrelere bağlanmasına izin verilir ve bağlanmamış bakteriler yıkanır. İçselleştirmeden sonra, içselleştirilmeyen bakterileri yok etmek için bir antibiyotik eklenir. Konak hücreler lizediliyor,...

Enfekte Konak Hücrelerden Hücre İçi Patojenik Bakterilerin İzolasyonu

Source: Gutiérrez, S., et al., Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the magnetic isolation of phagosomes containing biotin–streptavidin bead–coated bacteria from infected macrophages. The protocol includes buffer treatments, cell disruption, magnetic separation, and washing to yield purified phagosomes for analysis.

Isolation of Phagosomes Containing Magnetic Bead-Tagged Bacteria from Infected Macrophages

Source: Fernández-Fernández, R., et. al. Bacteriophage Removal from Infected Salmonella Cultures. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the use of exogenous LPS (Lipopolysaccharide) as a receptor mimic to inactivate lytic bacteriophages in Salmonella cultures. Through sequential incubation, centrifugation, and washing, phages are eliminated, resulting in a viable, phage-free bacterial suspension for downstream applications.

Inactivation of Bacteriophages Using Exogenous Lipopolysaccharide to Generate Phage-Free Salmonella Cultures

Bu videoda, diferansiyel geçirgenlik kullanılarak kemik iliği türevli makrofajlar içindeki sitozolik ve vakuolar Salmonella typhimurium miktarını belirlemek için bir test gösterilmektedir. Makrofajlar, Salmonella içeren vakuol veya SCV adı verilen özel bir vakuolar yapı içinde içselleştirilen floresan proteini eksprese eden bir Salmonella ile enfekte edilir. Bir bakteri alt kümesi SCV'den kaçar ve sitozole girer. Makrofajların kolesterol açısından zengin plazma zarı, dijital onin kullanılarak...

Enfekte Primer Makrofajlarda Sitozolik ve Vakuolar Salmonella'yı Ölçmek İçin Bir Test

Bu video, bir cam tabanlı çanağın yüzeyine tutturulmuş IgG-opsonize kırmızı kan hücrelerinin (RBC'ler) makrofaj aracılı fagositozu sırasında fagozom oluşumunun ve kapanmasının gerçek zamanlı görselleştirilmesi için yüksek çözünürlüklü bir toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu tekniğini göstermektedir. Makrofajlar, RBC'lerin etrafına psödopodia uzatır ve onları fagozomların içine sokar ve onları cam yüzeyden ayırır.

Fagozom Oluşumu ve Kapanışının TIRF Mikroskobu Tabanlı Görselleştirilmesi

In vitro olarak fenotip Salmonella veya diğer bakteri federasyonu, invazyon ve yüksek verimlilik kapasitesine sahip fagositik hücreler içerisinde replikasyon için yüksek verimli bir deney geliştirildi. Yöntem konak-patojen etkileşimleri onların tutulumlarla için Salmonella gen nakavt mutant suşlar değerlendirmek için kullanılmıştır.

Fenotipinin yüksek verim Deneyi Salmonella enterica Typhimurium Derneği, Invasion, ve Makrofagların Çoğaltma

Burada murin peritoneal makrofajları izole etmek için basit bir protokolü açıklıyoruz. Bu prosedürü, Toll benzeri reseptörlerin uyarılması üzerine gen ekspresyon analizi yapmak için RNA ekstraksiyonu takip eder.

Fare Periton Makrofagların izolasyonu Toll-benzeri reseptörler Uyarım üzerine Gen İfadesi Analizi Yapacak

Diferansiyel digitonin permeabilizasyonu kullanarak kemik iliği kaynaklı makrofajlarda sitozolik ve vakuolar Salmonella typhimurium miktar tayinini açıklıyoruz.

Koful genel Sitosolik kantifikasyonu<em&gt; Salmonella</em&gt; Diferansiyel permeabilizasyon tarafından İlköğretim Makrofagların içinde

Burada, fare peritoneal makrofaj fagositoz gelişmiş yeşil floresans Escherichia coliprotein ifade kullanarak değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Yeşil floresans Protein-ifade gelişmiş kullanma fare Peritoneal makrofaj fagositoz değerlendirmek için Escherichia Coli

Yeryüzünde her yerde bulunan ve çeşitli olan bakteriyofajlar, bakteri konakçıları içinde enfekte eder ve çoğalır, mikrobiyal ekosistemlerde çok önemli bir rol oynar. Önemlerine rağmen, varlıkları endüstriyel süreçleri bozabilir. Salmonella kültürlerinden bakteriyofajları ortadan kaldırmak için bakteriyel lipopolisakkaritleri kullanan bir yöntem geliştirdik.

Enfekte Salmonella Kültürlerinden Bakteriyofaj Giderimi

Öğrenin, makrofajlardan Salmonella typhimurium içeren fagosomları izole etme yöntemini. Biyotin ve streptavidin kullanarak basit adımlarla yüksek kaliteli fagosom elde edilir. Bu teknik, immünoloji araştırmalarında yeni olanlar için uygundur.

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Daha fazla video keşfet