Fenotipinin yüksek verim Deneyi Salmonella enterica Typhimurium Derneği, Invasion, ve Makrofagların Çoğaltma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, makrofaj hücrelerinin içinde invazyon ve/veya hayatta kalma için gerekli genleri in vitro, yüksek verimli bir şekilde taramak ve değerlendirmek ve salmonella patogenezinin mekanik genlerini tanımlamaktır. Bu, makrofaj hücre kültürlerine vahşi tip veya mutant salmonella suşları eklenerek elde edilir. 96 dakika boyunca kuyu plakaları 30 dakika boyunca in vitro enfeksiyon olarak 30 dakikalık inkübasyondan sonra ikinci adım olarak, makrofaj hücrelerine yapışmamış olan salmonella ile yıkanır ve tazelenir.

Yüksek konsantrasyonda Gentamisin antibiyotik içeren ortam bir saat boyunca eklenir, bu da içselleştirilmemiş tüm hücre dışı bakterileri öldürür. Daha sonra, makrofaj hücre kültürü tekrar yıkanır ve bakteri içermeyen hücre dışı bir ortamı korumak ve sadece hücre içi salmonella'nın hayatta kalmasına ve çoğalmasına izin vermek için 22.5 saatlik ek bir inkübasyon için düşük konsantrasyonda gentamisin içeren taze ortam eklenir. Sonuçlar, mutant salmonella'yı vahşi tip suşla karşılaştırarak, birleşme istilası ve replikasyonu için mutant suşların in vitro fenotipinin, her bir zaman noktası için seri seyreltme kaplama testi ile elde edilen makrofaj hücreleri başına koloni oluşum birimlerinin ölçümüne dayalı olarak belirlendiğini göstermektedir.

Tekniğimizin ana avantajı, salmonella ve fagositik hücrelerin birlikteliğini, istilasını ve replikasyonunu ölçmesi ve daha yüksek verim için aynı anda birden fazla suşu ölçebilmesidir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımda doktora sonrası araştırma görevlisi olan Dr.Jing Wu ve laboratuvarımda araştırma görevlisi olan Bayan Roberta Pugh olacak Makrofaj hücrelerini ham olarak yansıtan düşük pasaj numarası makrofaj hücrelerini yansıtmaya başlamak için ham 2 64 0.7 T 75 hücre kültürü şişesinde havalandırmalı bir filtre kapağı ile %10 fetal sığır serumu% 0.5 sodyum bikarbonat ve% 100 x esansiyel olmayan amino asitler NEAA ile desteklenmiş bir 37 santigrat derecede NEAA % 5 karbondioksit inkübatörü.

Hücreler% 60 ila 80 birleşmeye ulaştığında, DMEM'deki hücreleri bir hücre kazıyıcı ile toplayın, daha sonra hücreleri bir hemo sitometrede sayın ve hücre konsantrasyonunu hesaplayın, hücre süspansiyonunu mililitre başına 10 ila beşinci hücre başına 2.5 kat 10 ila beşinci hücre konsantrasyonuna seyreltin taze DMEM hücre kültürü. Orta plaka: 200 mikrolitre seyreltilmiş hücre süspansiyonu, çok kanallı bir pipet kullanılarak, 96 oyuklu bir hücre kültürü plakasının her bir oyuğuna, bir set fagositik hücre istilası tahlili için üç ayrı 96 oyuklu plakaya plaka hücresine yerleştirilir ve her plakayı ilişkilendirme istilası ve replikasyonu ile etiketler. Her salmonella suşu için plaka başına dört kuyucuk kullanılır.

Makrofaj hücrelerinin aynı gün kuyucukların dibine yapışmasını sağlamak için plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede% 5'lik bir karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. Makrofaj ham 2 6 4 0.7 hücreleri 96 oyuklu plakaya kaplanır. Yabani tip salmonella, entera serotipi, tyria 1 0 4 2 8 delta, INVA mutant, delta dört P mutant ve istenen test mutant suş kültürünün tek kolonilerini seçin.

Salmonella suşlarının her biri beş mililitre LB suyunda bulunur ve mutant suşlar için LB suyunu tamamlar: Mililitre başına 50 mikrogram ile misin, bakterileri 37 santigrat derecede 14 saat boyunca büyütebilir ve gevşek kapaklı 14 mililitrelik polipropilen yuvarlak tabanlı tüplerde 220 RPM'de çalkalayarak büyüyebilir. 37 santigrat derece alt kültürde gece boyunca inkübasyondan sonra, salmonella suşlarının her biri, ilgili lb suyunun beş mililitresine bir ila 50 oranında suşlar. Kültürleri 37 RPM'de çalkalama ile 220 santigrat derecede dört saat daha büyütün.

Bir spektrofotometrede her bakteri kültürünün OD 600 değerlerini okuyun. Salmonella patojenitesini, ada bir ila üç sekresyon sistemini, SPI bir tip üç sekresyon sistemini, invazyon için gen ekspresyonunu optimize etmek için her kültürün 0.6 ile 1.2 arasında bir OD 600 değerine sahip olması gerekir. Formülü kullanarak bakteri konsantrasyonunu hesaplayın: bir OD 600, mililitre başına 7.5 çarpı 10 ila sekizinci koloni oluşturan birimlere eşittir.

CFU daha sonra bakterileri beş kez 10 ila altı, mililitre başına FU ve üç mililitre taze DMEM hücre kültürü ortamı konsantrasyonuna seyreltin Makrofaj içeren 3 96 kuyulu hücre kültürü plakasını karbondioksit inkübatörden çıkarın ve her bir kuyuyu 200 mikrolitre bir XPBS ile bir kez yıkayın. PBS yıkama her birinden tamamen çıkarıldıktan sonra, her bir oyuğa DMEM ortamında 200 mikrolitre bakteri ekleyin. Bu, her bir oyukta bir kez 10 ila altı salmonella hücresi ve 20 ila bir enfeksiyon MOI'si ile sonuçlanır, plakaları kapalı bir kapta 10 dakika boyunca 1000 kez G'de santrifüjleyin.

Daha sonra plakaları 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede% 5'lik bir karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. 30 dakikalık inkübasyon tamamlandıktan sonra, plakaları inkübatörden çıkarın ve ilişkisiz bakterileri uzaklaştırmak için her bir kuyuyu 200 mikrolitre bir XPBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, hücre dışı salmonellayı öldürmek için invazyon ve replikasyon ile işaretlenmiş plakaların her bir oyuğuna mililitre başına 100 mikrogram gentamisin içeren 200 mikrolitre DMEM ortamında.

Ardından plakaları bir saat daha 37 santigrat derecede% 5'lik bir karbondioksit inkübatöre geri koyun. İlişkilendirme plakası için, makrofaj hücre sayımını kaydetmek için enfekte olmuş her suştan bir kuyucuk kaydedin ve kalan kuyucukları 10 dakika boyunca% 1 tritton X 100 içeren 200 mikrolitre bir XPBS ile tedavi edin. Hücreleri dilimlemek için, her bir oyuktan salmonella'yı hasat edin ve bunları 1.5 Mililitre eend orph tüplerine yerleştirin Her bir kuyucuktan hasat edilen numuneler üzerinde 900 mikrolitre bir XPBS ile üç on kat tahıl seyreltmesi yapın ve her seyreltme arasında girdap yapın, üçüncü seyreltme, her bakteri için 10 ila negatif üç ve numunenin 10 mikrolitresini vahşi tip için LB plakalarına veya LB plakalarına yerleştirin.

Mutant suşlar için can misin ile. Damlalar agarın içine batırıldıktan sonra plakalara eşit aralıklarla yerleştirilmiş toplam beş adet 10 mikrolitrelik damla için bu adımı dört kez tekrarlayın, plakaları ters çevirin ve gece boyunca inkübe edin 37 santigrat derecelik bir inkübatörde, makrofajları saymak için kaydedilen kalan kuyucukları 10 dakika boyunca% 0.25 TRIPSIN EDTA içeren 150 mikrolitre bir XPBS ile tedavi edin. Tripsin izasyonundan sonra, makrofajları 1.5 mililitrelik einor tüplerine aktarın ve tryin EDTA çözeltisini nötralize etmek için 50 mikrolitre FBS ile muamele edin.

Daha sonra 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu bir EOR tüpünden yeni bir tüpe çıkarın. Hücreleri boyamak için 10 mikrolitre% 0.4 trian mavisi ekleyin ve invazyon ve replikasyon plakaları karbondioksit inkübatöründe bir saatlik inkübasyonu tamamladığında bunları bir hemo sitometrede sayın. Plakaları inkübatörden çıkarın ve her bir kuyuyu 200 mikrolitre bir XPBS ile üç kez yıkayın.

Daha sonra, ortamdaki hücre dışı salmonella'nın temizlenmesini sağlamak için replikasyon plakasına mililitre Gentamisin başına 10 mikrogram içeren 200 mikrolitre DMEM ortamı ekleyin. Ardından plakayı 22,5 saat daha 37 santigrat derecede% 5'lik bir karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. Daha sonra salmonella'yı istila plakasından agar plakalarına hasat edin ve reflate edin ve ertesi gün ilişkilendirme plakası için açıklanan adımları izleyerek her enfekte suşun bir oyuğundan makrofajları sayın.

Çoğaltma plakasını inkübatörden çıkarın ve her bir kuyuyu 200 mikrolitre bir XPBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra salmonella'yı replikasyon plakasından agar plakalarına hasat edin ve yeniden dökün ve ilişkilendirme plakası için açıklanan adımları izleyerek her enfekte suşun bir oyuğundan makrofajları sayın. Agar plakaları gece boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatörde inkübe edildikten sonra, plakaları inkübatörden çıkarın ve plaka başına bakteri kolonisi sayısını puanlayın.

Her bir plakayı sayarken, koloni dağılımı 10 ila 100 koloni arasında olmalıdır. Sayım çok yüksek veya çok düşükse, numuneyi gerektiği gibi on kat daha yüksek veya daha düşük seyreltme ile yeniden düzenleyin. Fagositik hücre invazyonu testi, bilinen bir invazyon kusurlu mutantı olan delta INVA invazyon kontrol suşu ve delta dört P replikasyon kontrol suşu için gösterildiği gibi salmonella delesyon mutantlarının fenotipini uygun şekilde tanımlar.

Bilinen bir replikasyon kusurlu mutant mutant A ve mutant B, makrofajlarda replikasyon için değiştirilmiş fenotipler gösteren bu protokolü kullanan iki temsili suş testidir 20/38. Fagositik hücre istilası testinde şimdiye kadar test edilen Salmonella mutantları, ham 2, 6, 4, 0.7 makrofajlarda ilişki invazyonu ve/veya replikasyonunda değişken ancak önemli kusurlar gösterir. Bu protokol sadece bazı nala ve konak etkisi statik hücreleri için test edilmiştir.

Bu nedenle, diğer bakteri ve konakçı hücreler için modifikasyon ve optimizasyon gerekli olacaktır.