Maddedir asit Ester-bağlama DNA Aptamer seçimi, karakterizasyonu ve elektrokimyasal bir Aptasensor uygulamaya

Bu prosedürün genel amacı, yüksek derecede hidrofobik, küçük moleküllere gruba özgü DNA aptamerlerini seçmek ve seçilen aptameri hassas bir elektrokimyasal biyosensör geliştirmek için kullanmaktır. Bu yöntem, hedefler yüksek derecede hidrofobik moleküller olduğunda gruba özgü aptamerlerin nasıl seçileceği ve karakterize edileceği ile ilgili aptamer seçim alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu yöntemin en kullanışlı kısmı elektrokimyasal biyosensörlerin geliştirilmesi iken, başlıkların tespiti için

Bu biyosensörler, aptamer afinite ölçümlerimiz için de çalışmalıdır. Reaksiyona başlamak için, saflaştırılmış aptamer PCR ürününe 100 mikrolitre RNaz içermeyen su ekleyin. Çökelti eriyene kadar karışımı vorteksleyin.

Lambda eksonükleaz reaksiyonu, tuz konsantrasyonuna duyarlıdır ve etanol çökeltme ile çoğaltılması gereken bir üründür, ancak başka bir izopropanoldür. Beş mikro santrifüj tüpünün her birine, beş mikrolitre aptamer solüsyonu, 11 mikrolitre Rnase içermeyen su ve iki mikrolitre 10x reaksiyon tamponu yerleştirin. Her birine bir tüpe iki mikrolitre Rnase içermeyen su ve iki, beş, sekiz ve 10 birim lambda eksonükleaz çözeltileri ekleyin.

Nazik pipetleme ile iyice karıştırın. Tüpleri 37 santigrat derecede 35 dakika ve 80 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Ardından tüpleri dört santigrat derecede tutun ve %12'lik bir doğal sayfa jeli hazırlayın.

Her tüpe bir mikrolitre yükleme boyası ve dört mikrolitre Rnase içermeyen su ekleyin. Karışımları yerel sayfa jelinde 150 voltta 45 dakika çalıştırın. Tek sarmallı DNA'yı tamamen oluşturmak için gereken en düşük lambda eksonükleaz miktarını belirleyin.

Tek sarmallı DNA oluşturmak için büyük ölçekli bir reaksiyon gerçekleştirin. Test edilecek her bir bağlanma hedefi için, dönerken oda sıcaklığında bir saat boyunca 500 mikrolitre bir mikromolar DBP-1 çözeltisi ile 10 mikrolitre ortalama işlevselleştirilmiş DBP kodlu manyetik boncukları inkübe edin. Sonra süpernatanı atın.

Boncukları 200 mikrolitrelik PAE bağlama tamponu ile dört kez yıkayın ve boncukları 10 mikrolitre PAE bağlama tamponu içinde yeniden süspanse edin. PAE bağlama tamponunda 10 mikromolar bağlanma hedef test dispersiyonu elde edin. PAE bağlayıcı tamponda hidrofobik hedeflerin dağılması harika.

Bunu sağlamak için, kütüphanenin zenginleştirilmesi söz konusu olup, afinite testleri altında seçilmiştir. Her hedef test çözeltisinin 10 mikrolitresine 1 mikrolitre DBP-110 kodlu boncuk ekleyin. Karışımları bir saat inkübe edin ve süpernatanları manyetik ayırma ile toplayın.

Süpernatanları 100 kat seyreltin ve her kantitatif PCR için üç mikrolitre kullanın. Test numunesinin varlığında salınan DBP-1 sayısını, yalnızca PAE bağlama tamponunda salınan DBP-1 sayısına bölerek nispi afiniteleri hesaplayın. Ölçümleri gerçekleştirmeden önce, DBP-1 bazlı tiyollü çekirdek dizi probunu ve sinyal probunu sentezleyin ve saflaştırın.

Tiyollü probu ve sinyal probunu ve nükleaz içermeyen suda 100 mikromolar çözelti olarak sulandırın. Daha sonra, iki milimetre çapında bir altın elektrotu, bir, 0.3 ve 0.5 mikron alümina tozu ve her biri beş dakika boyunca mikrofiber bir bezle ayna benzeri bir yüzeye parlatın. Her parlatmadan sonra elektrodu ultra saf suda beş dakika boyunca sonikasyon

Cilalı elektrodu 0.5 molar sülfürik asit çözeltisine daldırın. Elektrodu, saniyede 100 milivoltta cıva kalomel yerine eksi 0,4 ila pozitif 1,2 volt arasında 35 ardışık döngüsel voltametri taraması ile temizleyin. Daha sonra, ince duvarlı bir santrifüj tüpünde 0.5 mikromolar tiyollü prob DBP-1 karışımını hazırlayın.

Ve 100 mikrolitre PBS'de 0.5 mikromolar FC modifiye DBP-1. Karışımı 10 dakika boyunca 95 santigrat dereceye ayarlanmış bir su banyosunda ısıtın. Daha sonra karışımın su banyosunda oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.

Soğutulmuş karışıma bir mikrolitre 10 milimolar TCEP stok çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat bekletin. Daha sonra temiz altın elektrodu oda sıcaklığında 12 saat boyunca karışıma daldırın. Elektrodu PBS ile durulayın ve ardından elektrodu bir saat boyunca PBS'de bir milimolar tiyollü PEG çözeltisine daldırın.

Elektrodu hedef serbest PAE bağlayıcı tampon ile iyice durulayın ve elektrodu tampona daldırın. Daha sonra, platin karşı elektrotun elektrolitik hücrelerini ve doymuş bir kalomel referans elektrotunu, her biri ultra saf suda iki dakika boyunca sonikat ve sırayla PAE bağlama tamponu. Voltametri enstrüman yazılımının kare dalgasını açın ve deney parametrelerini girin.

Temiz bir elektrolitik hücreyi hedef serbest PAE bağlama tamponu ile doldurun. Üç temiz elektrodu bir potansiyostata bağlayın ve elektrotları tampona daldırın. Bir arka plan SWV taraması edinin.

Daha sonra altın çalışma elektrodunu, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PAE bağlayıcı tamponda 10 pikamolar DEHP çözeltisine daldırın. Elektrodu PAE bağlayıcı tampon ile iyice durulayın. Her üç elektrodu da yeni PAE bağlama tamponuna daldırın ve daha önce olduğu gibi aynı parametreleri kullanarak başka bir SWV eğrisi toplayın.

Bir titrasyon eğrisi elde etmek için bu işlemi artan DEHP konsantrasyonlarıyla tekrarlayın. Sadece tek iplikli DNA elde etmek için gerekli olan minimum lambda eksonükleaz miktarının, küçük ölçekli reaksiyonlara dayalı olarak iki birim olduğu bulundu. Aptamer adayı DBP-1, SELEX ile tanımlandı ve ardından yüksek verimli dizileme yapıldı.

DBP-1, PAE türdeşlerine iyi grup özgüllüğü gösterdi. DBP-1 kullanan bir elektrokimyasal aptasensör, diğer yaygın çevresel kirleticilere göre DEHP'ye seçici olarak yanıt verdi. Aptasensör, 10 pikamolar kadar düşük konsantrasyonlarda yanıt ile DEHP'ye oldukça duyarlıydı.

Tehlike hidrofobik küçük moleküller için aptamerlerin seçimi ve karakterizasyonu olan lazer partikülü. PAE gibi hidrofobik küçük moleküllerin aptamerlerinin karakterizasyonu ve buharlaşması, PAE'lerin son derece sınırlı suda çözünürlüğü ve düşük molekül ağırlığı nedeniyle genellikle oldukça zordur. Bu videoyu izledikten sonra, bir elektrokimyasal aptasensörün nasıl yapıldığını ve başlıkları algılamak için nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.