Name: Doğal bileşikler varlığında olduğu gibi Beta hücrelerinin mitokondriyal işlev ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Öğrenin, yüksek çözünürlüklü respirometri ile pankreatik beta hücrelerinin mitokondriyal solunum fonksiyonunu doğrudan ölçmeyi. Bu yöntem, INS-1 türevli 832/13 hücrelerinde doğal bileşiklerin etkilerini değerlendirmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Yardımcısı ve bilimsel tartışma Tessem ve Hancock Labs'in üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar Andrew Neilson, doktora (Virginia Tech) kakao türetilmiş epikateşin monomer kesir verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu çalışmada JST için bir hibe-diyabet eylem araştırma ve Eğitim Vakfı tarafından desteklenmiştir.

1. hücre kültürü
<ol><li>Kültür INS-1 832/13 beta hücrelerinde RPMI % 10 fetal sığır serum (FBS), % 1 penisilin-streptomisin, 10 mM HEPES, 2 mM glutamin, 1 mM sodyum Pyruvate ve 0.05 mM 2-mercaptoethanol9,10,11 ile desteklenmiş 1640 türetilmiş ,12,13.</li>
	<li>832/13 hücreleri bir T75 şişesi 2 mL % 0.25 Tripsin, 8 mL tam RPMI 1640 medya ekleyerek 10 dk. Nötrleştir tripsin için 37 ° C'de kuluçka kullanarak kaldırın.</li>
	<li>Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve adım 1.2 içinde 900 µL PBS, hücre birimden 100 µL oranında seyreltin.</li>
	<li>2 x 106 hücre/mL 6 yoğunluğu plaka 832/13 hücreleri de çanağı.</li>
	<li>Kültür hücreleri oksijen kuluçka solunum deney başlamadan önce 37 ° C ve % 5 CO2 48 h için.</li>
</ol>2. yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri için hücreleri hazırlanması
<ol><li>
Kakao türetilmiş epikateşin monomer 832/13 hücrelerle tedavi.
	<ol>
<li>832/13 hücreler için 24 saat sonra kaplama 37 ° C ve % 5 CO2oksijen bir kuluçka kültür.</li>
		<li>Medya 24 saat sonra kaplama değiştirmek ve araç kontrolü (3 Kuyu) veya kültür için bir ek 24 h (48 h toplam) oksijen kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2ardından 100 nM kakao monomer (3 Kuyu), 832/13 hücrelerle tedavi.</li>
		<li>1 x düşük glukoz salgılanmasını tahlil arabellek (SAB) 5 dk. aspiratı arabelleği için hücrelerde 832/13 yıkama ve 3 h, 1 x düşük glikoz SAB her saat değiştirme için düşük glikoz SAB x 1 832/13 hücrelerde kuluçkaya.<ol>
<li>Yapmak 10 x SAB ile 33.32 gram NaCl, KCl, 1.73 gr KH2PO4, MgSO4 0.7 g 0,82 g ve H2O 500 mL son bir hacim için ekleyin. Steril filtre nihai çözüm.</li>
			<li>Yapmak 1 düşük glikoz SAB ile 10 SAB, 100 µL % 45 glikoz, 1 m HEPES, 1 mL 2 mL x 10 mL x 0,25 M CaCl2, 0,57 mL % 35 BSA çözeltisi, NaHCO3 0,21 g ve H2O son hacmi 100 mL için ekleyin. Steril filtre nihai çözüm.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Curcumin 832/13 hücrelerle tedavi.
	<ol>
<li>832/13 hücreler için 48 saat sonra kaplama 37 ° C ve % 5 CO2oksijen bir kuluçka kültür.</li>
		<li>1 düşük glikoz SAB x 5 dk. aspiratı arabelleği için hücrelerde 832/13 yıkama ve 3 h, 1 x düşük glikoz SAB her saat değiştirme için düşük glikoz SAB x 1 832/13 hücrelerde kuluçkaya.</li>
		<li>2,5 h, 1 düşük glikoz SAB x 3 h kuluçka sonra arabellek Aspire edin ve 1 x düşük glikoz SAB araç kontrolü ile ya da 30 dk 40 µM curcumin hücrelerde kuluçkaya. Kuluçka, arabellek Aspire edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tripsin yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri için hücrelerle hasat
	<ol>
<li>1 düşük glikoz SAB x 3 h kuluçka sonra hücrelerin % 0.25 tripsin iyi başına 250 µL plakalı kaldırın.</li>
		<li>Tripsin araç kontrolü ile veya bileşik faiz SAB 4 mL 15 mL konik tüp ile tedavi 3 kuyulardan hücrelerde birleştirir.</li>
		<li>Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve adım 2.3.2 900 µL PBS, hücre birimden 100 µL oranında seyreltin.</li>
		<li>1 x düşük glikoz her odası için uygun toplama at 3 mL yapmak SAB hücrelerde uygun sayıda sulandırmak. Veri 1 x 106 hücre/mL konsantrasyonu en etkili olduğunu gösterir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri için mekanik ayrışma hücrelerle hasat
	<ol>
<li>Düşük glikoz SAB, 1 x 3 h kuluçka sonra 1 mL 1 x düşük glikoz SAB her şey ve yavaşça havaya hücreleri mekanik ayrışma ile plaka dışına 1000 µL pipet ucu ile pipetting tarafından ekleyin.</li>
		<li>Araç kontrolü ile veya bileşik ilgi 3 mL SAB solunum için 15 mL konik tüp içinde toplam tedavi 3 kuyulardan hücreleri birleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri
<ol><li>Yüksek çözünürlüklü respirometer hazırlanması.
	<ol>
<li>Yüksek çözünürlüklü respirometer açın ve respirometer analiz programı başlatarak masaüstüne bağlayın.</li>
		<li>Her iki odalarından % 70 etanol Aspire edin. Bu odaları 45 dk en az % 70 etanol içinde bekletin.</li>
		<li>Odalar her adımdan sonra alıyorum iki kez % 70 etanol ile yıkayın.</li>
		<li>Chambers GKD2her adımdan sonra alıyorum O, üç kez ile yıkayın.</li>
		<li>GKD2' O. odası itici durulama Bu kalıntı etanol itici ve titanyum bağlantı noktası kapalı temizler.</li>
	</ol></li>
	<li>Polarographic oksijen sensör kalibrasyonu.
	<ol>
<li>Sürekli manyetik heyecan çubukları kullanarak veri kayıt aralığı ile 750 rpm ve 37 ° C odasında 2.0 arabellek karıştırarak her oxygraph Odası'na, 1 düşük glikoz SAB arabellek x 2.4 mL ekleyin F7 butona da sekmesini açarak s "Sistemler" etiketli. İtici itmek ta ve İngiliz anahtarı havalandırma ayarına geri çek. En az 1 saat kadar istikrarlı oksijen akı elde edilir için equilibrate makine izin.</li>
		<li>Makine 37 ° C'de deneme süresini belirleyin. Polarizasyon gerilimi 800 için ayarla bir kazancı F7 butona da "Oksijen, O2"etiketli sekmesini açarak 2 mV. Oksijen konsantrasyonu da değişimdir kararlı iken en az 30 dk, SAB arabellek oksijen konsantrasyonu equilibrate (az 2 pmol/(s*mL)).</li>
		<li>Oksijen konsantrasyonu sabitleme oksijen konsantrasyonu üstü arka plan ölçü değişim oksijen konsantrasyonu kurmaya kararlı nerede bir bölge seçin.<ol>
<li>Üst karakter tuşunu, sol üzerinde fareyi tıklatmak itip seçili bölgede fareyi sürükleyerek bir bölge seçin. Her iki odaları ile karşılık gelen her iz için seçilen bölge ve "R1" değişiklik ile ilişkili adını tıklatın.</li>
			<li>Sol altta "O2 kalibrasyon" kutusuna çift tıklayın ve köşeleri ekranın sağ, R1 olarak "hava kalibrasyon" "işaretini seçin" düğmesini tıklatın ve sonra "kalibre ve panoya kopyala" her iki salonları için seçin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Solunum 832/13 beta hücre 2.1.5 veya 2.2.5 adımda hazırlanan değerlendirme.
	<ol>
<li>Her odası (kontrol tedavi araç hücreleri, bileşik işlem görmüş hücreleri ile bir odası ile bir odası) örnekte 2.4 mL 1 x düşük glikoz SAB. yük Hücre örneği protein Nefelometri için 0.5 mL BCA (Bicinchoninic asit) tahlil tarafından Eğer mekanik ayrışma yaklaşım (daha sonra ölçüm için donma-20 ° C'de) kullanarak korur.<ol>
<li>Dalgıç sonuna kadar itin ve rezidüel hacim Aspire edin. Hücreleri 750 devir/dakika ve 37 ° C tüm sonraki adımlar için denemeyi boyunca sürekli karıştırın. F4'e tıklayarak ve örnekleri yüklendiğinde "hücreler olarak" etiketleme bir işareti yapmak.</li>
			<li>30 dk için ölçü örnekleri. Sinyal sabitleme sonra oksijen konsantrasyonu düşük glikoz koşulları (2.5 mM glikoz) 3.2.3 içinde açıklandığı gibi karşılık gelen değişim bir bölge seçin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sinyal sabitleme ulaşıldıktan sonra 12.5 µL % 45 steril glikoz çözüm (16,7 mM son konsantrasyonu) kullanarak bağlantı noktası yükleme titanyum ile her odaya içine ekleyin. Bir işareti "tedavi eklendiğinde 3.3.1 içinde açıklanan glikoz" olarak ölçülen olun. Let sinyal stabilize etmek ve kayıt hücresel solunum kadar istikrarlı oksijen akı elde edilir. Bu bölge değişikliği oksijen konsantrasyonu 3.2.3 içinde açıklandığı gibi seçin. Bu 16,7 mM glikoz okuma ve uyarıcı koşullar7ile karşılık gelir.</li>
		<li>Sinyal sabitleme ulaşıldıktan sonra 5 mM oligomycin bir (2.5 µM son konsantrasyonu) her odasına yükleme limanı üzerinden 1 µL ekleyin. Bir işareti "tedavi eklendiğinde 3.3.1 içinde açıklanan OligoA" olarak ölçülen olun. Let sinyal stabilize etmek ve kayıt hücresel solunum kadar istikrarlı oksijen akı elde edilir. Bu alan eğrinin 3.2.3 içinde açıklandığı gibi seçin. Oligomycin A ATP sentaz engeller ve böylece akı tek oksijen meydana gelen yolu ile elektron ve oksidatif fosforilasyon7sızıntı.</li>
		<li>Sinyal sabitleme ulaşıldıktan sonra en fazla solunum oranı kurulana kadar 1 mM FCCP 1 µL artışlarla ekleyin. Bu maksimal edilişi solunum temsil eder. 3-4 µL arasında FCCP (maksimal edilişi solunum INS-1 832/13 hücre ikna etmek için yeterli 1.5-2.0 µM son konsantrasyonu) olduğunu. Tedavi eklendiğinde 3.3.1 içinde açıklandığı gibi "FCCP" etiketli bir işareti yapmak. Let sinyal stabilize etmek ve kayıt hücresel solunum kadar istikrarlı oksijen akı elde edilir. Bu alan eğrinin 3.2.3 içinde açıklandığı gibi seçin. FCCP uncoupling bir ajandır. Bu bize edilişi solunum7ölçmek sağlar.</li>
		<li>Sinyal sabitleme ulaşıldıktan sonra yükleme limanı ile her odaya içine 1 µL 5 mm Antimycin A (2.5 µM son konsantrasyonu) ekleyin. Tedavi eklendiğinde 3.3.1 içinde açıklandığı gibi "AntiA" etiketli bir işareti yapmak. Let sinyal stabilize etmek ve kayıt hücresel solunum kadar istikrarlı oksijen akı elde edilir. Bu alan eğrinin 3.2.3 içinde açıklandığı gibi seçin. Not: Antimycin A sitokrom C redüktaz bağlar, ubiquinone oksidasyonu engeller ve tüm solunum engeller. Bu tamamen solunum7durdurmak için bize izin verir.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 beta hücreleri protein konsantrasyonu ve solunum normalleştirme için ölçme.
	<ol>
<li>Örnek yükleme BCA yöntemi13kullanarak ölçü protein örnek muhafaza 0.5 mL kullanarak.</li>
		<li>Her örnek nüsha, seyreltme, üreticinin yönergelerini takip olmadan çalışır.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 beta hücre solunum hesaplamaları trypsinized hücrelerden.<ol>
<li>ML kullanım başına hücre sayısı tahlil F3 respirometer analiz programı düğmeye basarak girin. Hücre/mL birimlerini değiştirin, hücresel konsantrasyon girin ve orta SAB. için değiştirin</li>
		<li>Arka plan okuma seçerek ve O2 3.2.3 içinde açıklandığı gibi kalibrasyon formu içine girerek verileri normalleştirmek için seçin.</li>
		<li>Okumalar 2.5 mm glikoz, 16,7 mM glikoz, Oligomycin A, FCCP ve Antimycin 3.3.1 içinde açıklandığı gibi bir seçim yapın.</li>
		<li>Respirometer analiz programında, her odası için okuma protein konsantrasyonu girerek ve her tedavi sırasında solunum ölçümü için uygun ortalama değerleri seçerek sonra dışa aktarın. Bu tıklayarak F2 ve "kopya" Pano çalışması için bastırıyor tarafından yapılır. Bu diğer analiz programlarda kullanmak için veri verir. "O2 eğim negatif" değerler hesaplamalar için kullanın.</li>
		<li>Veri denetimleri araç 3-5 bağımsız ishal tedavi ve doğal olduğu gibi hücresel solunum INS-1 832/13 beta hücre üzerindeki etkisini belirlemek için işlem görmüş hücreleri bileşikler derleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 beta hücre solunum hesaplamalar mekanik hücre ayrışmış.<ol>
<li>Protein hesaplamalar BCA tahlil F3 respirometer analiz programı düğmeye basarak girin. Mg birimlerini değiştirin, BCA konsantrasyon girin ve orta SAB. için değiştirin</li>
		<li>Arka plan okuma seçerek ve O2 3.2.3 içinde açıklandığı gibi kalibrasyon formu içine girerek verileri normalleştirmek için seçin.</li>
		<li>Okumalar 2.5 mm glikoz, 16,7 mM glikoz, Oligomycin A, FCCP ve Antimycin 3.3.1 içinde açıklandığı gibi bir seçim yapın.</li>
		<li>Respirometer analiz programında, her odası için okuma protein konsantrasyonu girerek ve her tedavi sırasında solunum ölçümü için uygun ortalama değerleri seçerek sonra dışa aktarın. Bu tıklayarak F2 ve "kopya" Pano çalışması için bastırıyor tarafından yapılır. Bu diğer analiz programlarda kullanmak için veri verir. "O2 eğim negatif" değerler hesaplamalar için kullanın.</li>
		<li>Veri denetimleri araç 3-5 bağımsız ishal tedavi ve doğal olduğu gibi hücresel solunum INS-1 832/13 beta hücre üzerindeki etkisini belirlemek için işlem görmüş hücreleri bileşikler derleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Mueckler, M., Thorens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SLC2+%28GLUT%29+family+of+membrane+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">The SLC2 (GLUT) family of membrane transporters.</a> Mol Aspects Med. 34 (2-3), 121-138 (2013).</li>
<li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).</li>
<li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53 Suppl 3, S16-S21 (2004).</li>
<li>Strat, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+by+which+cocoa+flavanols+improve+metabolic+syndrome+and+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms by which cocoa flavanols improve metabolic syndrome and related disorders.</a> J Nutr Biochem. 35, 1-21 (2016).</li>
<li>Rowley, T. J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+cocoa+catechins+enhance+%CE%B2-cell+function+by+increasing+mitochondrial+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr+Biochem%22%5BJournal%5D)">Monomeric cocoa catechins enhance β-cell function by increasing mitochondrial respiration.</a> J Nutr Biochem. 49, 30-41 (2017).</li>
<li>Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+Respirometry+to+Assess+Mitochondrial+Function+in+Permeabilized+and+Intact+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells.</a> J Vis Exp. (120), (2017).</li>
<li>Reynolds, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Cell+deletion+of+Nr4a1+and+Nr4a3+nuclear+receptors+impedes+mitochondrial+respiration+and+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">beta-Cell deletion of Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors impedes mitochondrial respiration and insulin secretion.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 311 (1), E186-E201 (2016).</li>
<li>Hals, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Respiration+in+Insulin-Producing+beta-Cells%3A+General+Characteristics+and+Adaptive+Effects+of+Hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Respiration in Insulin-Producing beta-Cells: General Characteristics and Adaptive Effects of Hypoxia.</a> PLoS One. 10 (9), e0138558(2015).</li>
<li>Ray, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nkx6.1-mediated+insulin+secretion+and+beta-cell+proliferation+is+dependent+on+upregulation+of+c-Fos%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Nkx6.1-mediated insulin secretion and beta-cell proliferation is dependent on upregulation of c-Fos.</a> FEBS Lett. 590 (12), 1791-1803 (2016).</li>
<li>Schisler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+human+and+rat+islet+beta-cell+proliferation+with+retention+of+function+by+the+homeodomain+transcription+factor+Nkx6.1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1.</a> Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).</li>
<li>Tessem, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nkx6.1+regulates+islet+beta-cell+proliferation+via+Nr4a1+and+Nr4a3+nuclear+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nkx6.1 regulates islet beta-cell proliferation via Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (14), 5242-5247 (2014).</li>
<li>Hobson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+Kinase+A+is+critical+for+the+Nkx6.1+mediated+beta-cell+proliferation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Aurora Kinase A is critical for the Nkx6.1 mediated beta-cell proliferation pathway.</a> Islets. 7 (1), e1027854(2015).</li>
<li>Draney, C., Hobson, A. E., Grover, S. G., Jack, B. O., Tessem, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdk5r1+Overexpression+Induces+Primary+beta-Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Cdk5r1 Overexpression Induces Primary beta-Cell Proliferation.</a> J Diabetes Res. 2016, 6375804(2016).</li>
<li>Rouse, M., Younes, A., Egan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+and+curcumin+enhance+pancreatic+beta-cell+function+by+inhibiting+phosphodiesterase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Resveratrol and curcumin enhance pancreatic beta-cell function by inhibiting phosphodiesterase activity.</a> J Endocrinol. 223 (2), 107-117 (2014).</li>
<li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+reduces+beta-cell+mitochondria+and+induces+distinct+morphological+abnormalities%2C+which+are+reproducible+by+high+glucose+in+vitro+with+attendant+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Diabetes reduces beta-cell mitochondria and induces distinct morphological abnormalities, which are reproducible by high glucose in vitro with attendant dysfunction.</a> Islets. 4 (3), 233-242 (2012).</li>
<li>Chavanelle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high-intensity+interval+training+and+moderate-intensity+continuous+training+on+glycaemic+control+and+skeletal+muscle+mitochondrial+function+in+db%2Fdb+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Effects of high-intensity interval training and moderate-intensity continuous training on glycaemic control and skeletal muscle mitochondrial function in db/db mice.</a> Sci Rep. 7 (1), 204(2017).</li>
<li>Jelenik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Insulin+Resistance+in+Primary+and+Secondary+Nonalcoholic+Fatty+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Insulin Resistance in Primary and Secondary Nonalcoholic Fatty Liver.</a> Diabetes. 66 (8), 2241-2253 (2017).</li>
<li>Spacek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-stimulated+insulin+secretion+of+insulinoma+INS-1E+cells+is+associated+with+elevation+of+both+respiration+and+mitochondrial+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glucose-stimulated insulin secretion of insulinoma INS-1E cells is associated with elevation of both respiration and mitochondrial membrane potential.</a> Int J Biochem Cell Biol. 40 (8), 1522-1535 (2008).</li>
<li>Jezek, J., Dlaskova, A., Zelenka, J., Jaburek, M., Jezek, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4623989/">H2O2-Activated Mitochondrial Phospholipase iPLAgamma Prevents Lipotoxic Oxidative Stress in Synergy with UCP2, Amplifies Signaling via G-Protein-Coupled Receptor GPR40, and Regulates Insulin Secretion in Pancreatic beta-Cells.</a> Antioxid Redox Signal. 23 (12), 958-972 (2015).</li>
<li>Johnson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressed+insulin+signaling+and+increased+apoptosis+in+CD38-null+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Suppressed insulin signaling and increased apoptosis in CD38-null islets.</a> Diabetes. 55 (10), 2737-2746 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralının amacı olduğu gibi pankreas beta hücrelerinde solunum oranları ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri kullanmaktır. Bu yöntem beta hücre yanıt olarak artan şekeri ölçüm sağlar. Protokol için de Önarıtma ile çeşitli bileşenleri, bu doğal olarak meydana gelen monomeric epikateşin veya curcumin4,5iletişim kuralıyla gösterildiği gibi sağlar. Bu iletişim kuralı ' (burada görüldüğü gibi) ön veya minima...

Pankreas beta hücre birincil amacı sistem normoglycemia glikoz uyarılmış insülin salgılanması ile muhafaza etmektir. Beta hücreleri glikoz büyük ölçüde nedeniyle düşük benzeşme, yüksek kapasiteli glikoz taşıyıcı GLUT2 dolaşan fizyolojik değişiklikler hissediyorum (glikoz taşıyıcı 2, Km 16,7 mM)1. Dolaşım Glikoz seviyesi yükseldikçe, bu yüksek kapasiteli düşük-benzeşme ışınlama beta hücre içinde hücre içi glikoz orantılı bir artış kolaylaştırır. Glikoz Glikoliz, TCA döngüsü (tricarboxylic asit döngüsü) ve mitokondrial solunum yükseltilmiş hücresel ATP (adenozin trifosfat) seviyelerinde kaynaklanan metabolize edilir. Yükseltilmiş ATP konsantrasyon membran depolarizasyon sonucu ATP hassas K+ kanalları, engeller. Membran depolarizasyon voltaj Kapılı Ca2 + kanal açılması neden olur ve sonraki sürümü vezikül insülin granülleri2bağlı. Beta hücre fonksiyon bozukluğu tip 2 diyabet (T2D) özelliğidir ve azalmış ve kötü kontrollü insülin salgılanması ve sonuçta beta hücre ölüm3ile sonuçlanır. Korumak veya beta hücre fonksiyonu geliştirmek mekanizmaları T2D için bir tedavi olarak kullanılabilir.
Çalışmaları doğal olarak meydana gelen yararlı etkilerini göstermiştir pankreas beta hücre4bileşikler bitkisel kökenli. Bu bileşiklerin onların etkisi ile artan beta hücre çoğalması, hayatta kalma veya glikoz uyarılmış insülin salgılanması olabilir. Örnek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda monomeric epikateşin mitokondrial solunum artan aracılığıyla glikoz uyarılmış insülin salgılanması artırır ve hücresel ATP artan5düzeyleri gösterdi. Bu nedenle, bu bileşiklerin fonksiyonel beta hücre artırabilir nasıl anlama kitle bu bileşikler potansiyel therapeutics kaldıraç önemlidir.
Hücresel solunum bir dizi araç ölçülebilir. Yüksek çözünürlüklü bir respirometer bir permeabilized ya da sağlam hücre nüfus6kimyasal modülatörler titrasyon için sağlar. Bu araç çeşitli bileşenleri, ek böylece geniş bir dizi bilgi veren farklı konsantrasyonları verir.
Glikoz metabolizması ve beta hücre fonksiyonu arasındaki samimi bağlantı göz önüne alındığında, hücresel solunum ölçümleri kritik öneme sahiptir. Hücresel solunum ölçümleri-ebilmek kılınmak istimal beta hücreleri, ya permeabilized ya da olduğu gibi her avantajları ve dezavantajları7,8, kendi kümesini having ile. Beta hücrelerinin permeabilization bir elektron taşıma zinciri farklı yönlerini ölçmek izin verirken, bunu solunum beta hücre, glikoz alımı ve metabolizma inducing mekanizmasını açısından olmadan yapar. Bu nedenle, unpermeabilized beta hücre solunum kullanımı oksijen tüketim göstergesi kullanarak çeşitli glikoz düzeyleri için beta hücreleri yanıt belirlemek için çok kullanışlı bir yöntemdir.
Bu teknik amacı sağlam INS-1 oksijen tüketimi ölçmek için 832/13 beta hücreleri türetilmiştir. Bu teknik bize beta hücreleri yanıt unstimulatory glikoz koşullarına (2.5 mM glikoz) belirlemek uyarıcı glikoz koşulları (16,7 mM glikoz) yanı sıra sağlar. Unpermeabilized hücreleri tek tek karmaşık test bize izin vermez iken ben, II veya III. elektron taşıma zinciri, tekniği ile karmaşık IV edilişi inhibisyon (Oligomycin A), solunum (FCCP-karbonil siyanür-ilgili ölçümler izin vermez 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone) ve tamamen inhibe solunum (Antimycin A). Bu çalışmada solunum sağlam unpermeabilized pankreas beta hücreleri yanı sıra iki doğal olarak meydana gelen bileşikler, monomeric epikateşin ve curcumin, beta hücre solunum üzerindeki etkisini ölçme etkinliği gösterir.

<table><tbody><tr><td>O2k Çekirdeği: Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>Yüksek çözünürlüklü respirometri cihazı</td></tr><tr><td>DatLab 6 Programı</td><td>Oroboros Instruments</td><td>27141-01</td><td>Yüksek çözünürlüklü respirometri analizi için bilgisayar programı</td></tr><tr><td>INS-1 832/13 hücre hattı</td><td>Duke Üniversitesi Tıp Merkezi</td><td>YOK</td><td>Beta hücre hattı, Dr. Christopher Newgard</td></tr><tr><td>Curcumin'den</td> <td>hediyeSigma</td><td>C7727</td><td>Beta hücrelerinin ön tedavisi</td></tr><tr><td>Kakao epikateşin monomeri</td><td>Virginia Politeknik Enstitüsü ve Eyalet Üniversitesi</td><td>YOK</td><td>Beta hücrelerinin ön işlemi, Dr. Andrew Neilson'dan hediye</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>Hücre kültürü için</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>832/13 beta hücre ortamı</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Hidroklonu</td><td>SH30071.03</td><td>832/13 beta hücre ortamı bileşeni</td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td>832/13 beta hücre ortamı bileşeni</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3662</td><td>832/13 beta hücre ortamı bileşeni / 1x SAB Tampon</td></tr><tr><td>Glutamin Keson</td><td></td><td>GLL01</td><td>832/13 beta hücre ortamı bileşeni</td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td>832/13 beta hücre ortamı bileşeni</td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>832/13 beta hücre ortamı bileşeni</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td>10x SAB tamponunun</td></tr> bileşeni <tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>10x SAB tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>10x SAB tamponu</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td> <td>bileşeniM2643</td><td>10x SAB tamponu</td></tr><tr><td>bileşeni D-(+)-Glikoz Çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>1x SAB tamponunun bileşeni, solunum tahlili için kimyasal</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>1x SAB tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>%35 BSA Çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>A7979</td><td>1x SAB tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>1x SAB tamponu</td></tr><tr><td>200 geçirmez etanol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td>Yıkama Oksigrafı O2k Odaları</td></tr><tr><td>Bileşeni Oligomisin A</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>Solunum tahlili için kimyasallar</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>Solunum tahlili için kimyasallar</td></tr><tr><td>Anitisin A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td>Solunum tahlili için kimyasallar</td></tr><tr><td>BCA Protein Kiti</td><td>Thermo Fisher</td><td>23225</td><td>Protein konsantrasyonunun belirlenmesi için</td></tr></tbody></table>

doğal bileşikler varlığında olduğu gibi beta hücrelerinin mitokondriyal işlev ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri izole mitokondri, hücre ve dokulara oksijen tüketimi ölçüm için sağlar. Beta hücreleri vücut tarafından kontrol kan şekeri düzeyleri insülin salgılanması yanıt olarak yükseltilmiş glikoz konsantrasyonu ile kritik bir rol oynamaktadır. İnsülin salgılanması glikoz metabolizması ve mitokondrial solunum tarafından kontrol edilir. Bu nedenle, bozulmamış beta hücre solunum ölçme şeker hastalığı için bir tedavi olarak beta hücre fonksiyonu geliştirmek için önemlidir. Sağlam 832/13 INS-1'i kullanarak beta hücreleri hücresel solunum glikoz konsantrasyonu artan etkisini ölçebilirsiniz türetilmiş. Bu iletişim kuralı bir etkilerini belirlemenize izin vererek çeşitli bileşenleri, başka yerde içinde beta hücre solunum ölçmek için bize izin verir bileşikler sağlam hücre solunum üzerinde verilen. Burada iki doğal olarak meydana gelen bileşikler, monomeric epikateşin ve curcumin, low (2.5 mM) veya yüksek glikoz (16,7 mM) koşulları altında varlığı beta hücre solunum üzerindeki etkisini göstermektedir. Bu teknik, çeşitli bileşikler etkisi olduğu gibi beta hücre solunum huzurunda farklı glikoz konsantrasyonu belirlemek için kullanılabilir.

Hazırlanan ve iletişim kuralında tanımlandığı gibi hasat INS-1 832/13 beta hücreleri oksijen tüketimi çeşitli kimyasal müdahaleler (şekil 1A) göre modülasyon gösterecektir. Glikoz konsantrasyonu 16,7 mM glikoz (şekil 1B) arttı zaman solunum bir artış gözlenir. Sağlam hücreleri Oligomycin A. ile tedavi ederken solunum azalacak Bu solunum Bazal, nonphosphorylating solunum durumu olarak tanımlanır kaçak olarak bilinir. Beta hücreleri uncoupling Ajan ETS solunum vey...

Bu iletişim kuralı bozulmadan 832/13 beta yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri kullanarak hücreleri glikoz-aracılı değişiklikler doğal bileşikler huzurunda mitokondrial solunum etkisini ölçmek için hedeftir.

Doğal bileşikler varlığında olduğu gibi Beta hücrelerinin mitokondriyal işlev ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

Bu yaklaşımın genel amacı, insülin uyarıcı koşullar altında pankreas beta hücrelerinin solunum fonksiyonunu doğrudan değerlendirmektir. Bu aynı zamanda farklı bileşiklerin beta hücresi solunum fonksiyonu üzerindeki etkisini gözlemlemek için de kullanılabilir. Bu yöntem, belirli bir bileşiğin solunumdaki değişiklikler yoluyla pankreas beta hücresi fonksiyonunu etkileyip etkilemediği gibi pankreas beta hücre fizyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin temel avantajı, bazal ve insülin stimülatör koşullar altında pankreas beta hücrelerinde solunum fonksiyonunu doğrudan değerlendirmek için kullanılabilmesidir. Hücre hazırlama ve solunum ölçümünde gerekli hassasiyet nedeniyle hücre hazırlama ve makine kullanım adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Başlamak için, INS-1'den türetilen 832/13 beta hücrelerini takviye edilmiş RPMI 1640'ta kültürleyin.İki mililitre% 0.25 tripsin ekleyerek ve 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe ederek hücreleri bir T75 şişesinden çıkarın. Ardından, sekiz mililitre tam RPMI 1640 ortamı ekleyerek tripsini nötralize edin. Hücre hacminin 100 mikrolitresini 900 mikrolitr

high-resolution-respirometry-to-measure-mitochondrial-function-intact

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Vastus lateralis biyopsi saflaştırılmış mitokondrinin preparasyonu ve respirometrik profil için yöntemler tarif edilmiştir. Küçük kas hacminin kullanımı klinik araştırma uygulamaları için bu teknik uygundur.

Perkütan İğne Biyopsisi ile Elde Edilen İskelet Kası Doku İzole Mitokondri hazırlanması ve Respirometrik Değerlendirmesi

Yüksek çözünürlüklü Solunum mitokondriyal oksijen tüketimini belirlemek için kullanılır. Bu mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri '(I-IV) solunum hızları, maksimum mitokondriyal elektron transport sistem kapasitesi ve mitokondriyal dış membran bütünlüğü belirlemek için basit bir tekniktir.

Yüksek çözünürlüklü Solunum permeabilize ve bozulmamış Hücreleri Mitokondrial fonksiyonu değerlendirmek için

Burada, anestezi uygulanmış bir domuzdan kuadriseps kas örneği alınır ve mitokondri diferansiyel santrifüjleme ile izole edilir. Daha sonra, mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri I, II ve IV'ün solunum hızları, yüksek çözünürlüklü respirometri kullanılarak belirlenir.

Yüksek çözünürlüklü Solunum Ölçümleri için Diferansiyel Santrifüj tarafından İskelet Kası Bozulmamış Mitokondri izolasyonu

Yüksek çözünürlüklü respirometreler kullanılarak oksidatif fosforilasyonun değerlendirilmesi, mitokondri ve hücresel enerji metabolizmasının fonksiyonel analizinin ayrılmaz bir parçası haline gelmiştir. Burada, oda ve mikroplaka tabanlı yüksek çözünürlüklü respirometreler kullanılarak hücresel enerji metabolizmasının analizi için protokoller sunuyoruz ve her cihazın temel faydalarını tartışıyoruz.

Oda ve Plaka Tabanlı Respirometreler Kullanarak Hücrelerdeki ve Dokulardaki Biyoenerjetik Değerleri Değerlendirmek için Yüksek Çözünürlüklü Respirometri

Floresan sensörlerine bağlı yüksek çözünürlüklü respirometri, mitokondriyal oksijen tüketimini ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumunu belirler. Bu protokol, geçirgenleştirilmiş siyatik sinirde mitokondriyal solunum hızlarını ve ROS üretimini değerlendirmek için bir teknik tanımlamaktadır.

Siyatik Sinirde Mitokondriyal Fonksiyonun Yüksek Rezolüsyonlu Respirometri ile Değerlendirilmesi

İnsan retinal pigment epitel hücrelerinin (H-RPE) metabolik durumu, sağlıklarını ve işlevlerini yansıtır. Burada, yüksek çözünürlüklü respirometri kullanarak H-RPE'nin gerçek zamanlı metabolik akısını incelemek için optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır.

Primer İnsan Retinal Pigment Epitel Hücrelerinde Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanılarak Biyoenerjetik Biyoenerjetik Analizinin Gerçek Zamanlı Analizi

Sperm mitokondriyal fonksiyonunun yüksek çözünürlüklü respirometri ile analizi, kapalı bir oda sisteminde serbestçe hareket eden spermatozoanın oksijen tüketiminin ölçülmesine izin verir. Teknik, sperm mitokondriyal özellikleri ve bütünlüğü hakkında bilgi sağlayan insan spermatozoasında solunumu ölçmek için uygulanabilir.

İnsan Spermatozoasında Mitokondriyal Fonksiyonu Değerlendirmek için Yüksek Çözünürlüklü Respirometri

Burada, insan veya fare kasından taze geçirgen iskelet kası liflerinde mitokondriyal oksidatif fosforilasyonu ölçmek için kapsamlı bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, mevcut mitokondriyal ağları ve membran bütünlüğünü korurken mitokondriyal solunumun gerçek zamanlı olarak ölçülmesine ve yakıt tercihinin ve metabolik esnekliğin değerlendirilmesine olanak tanır.

İnsan ve Fare İskelet Kası Liflerinde Mitokondriyal Solunumun Yüksek Çözünürlüklü Respirometri ile Ölçülmesi

Bağışıklık hücrelerinde fizyolojik olarak ilgili substrat konsantrasyonları altında mitokondriyal biyoenerjetik çalışma yöntemleri sınırlıdır. İnsan T hücrelerinde, monositlerde ve periferik mononükleer hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin enerji talebine tepkisindeki değişiklikleri değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü florespirometri kullanan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

İnsan bağışıklık hücrelerinde mitokondriyal membran potansiyelindeki dinamik değişiklikleri değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü florespirometri

Burada, yüksek çözünürlüklü respirometri için 0.5 mL odacığın, uygun enstrümantal O2 arka plan düzeltmesi uygulandığında 2.0 mL oda ile tutarlı sonuçlar gösterdiğini gösteriyoruz. Daha az numune gerektirir, bu da sınırlı kullanılabilirlik veya düşük solunum kapasitesi olan çalışmalar için avantajlıdır.

Küçük hacimli bir odada yüksek çözünürlüklü respirometri

Rezonans Raman Spektroskopisi (RRS) kullanarak mitokondriyal sağlığı izlemek için invaziv olmayan, gerçek zamanlı bir yöntem sunuyoruz. Mitokondriyal redoks durumlarını nicelendirmek için RRS kullandık ve mitokondriyal sağlık için bir metrik geliştirdik; Rezonans Raman azaltılmış mitokondriyal oranı (3RMR), bu ölçüm oksijenlenme değişikliklerine geleneksel kan gazı analitlerinden daha hızlı yanıt verdiğini gösteriyor.

Rezonans Raman Spektroskopisi Kullanarak Mitokondriyal Fonksiyonun Gerçek Zamanlı, İnvaziv Olmayan Değerlendirmesi

Öğrenin, yüksek çözünürlüklü respirometri ile pankreatik beta hücrelerinin mitokondriyal solunum fonksiyonunu doğrudan ölçmeyi. Bu yöntem, INS-1 türevli 832/13 hücrelerinde doğal bileşiklerin etkilerini değerlendirmek için kullanılır.

Doğal bileşikler varlığında olduğu gibi Beta hücrelerinin mitokondriyal işlev ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri (Video) | JoVE Journal

Doğal bileşikler varlığında olduğu gibi Beta hücrelerinin mitokondriyal işlev ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri

Daha fazla video keşfet