Doğal bileşikler varlığında olduğu gibi Beta hücrelerinin mitokondriyal işlev ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri

Bu yaklaşımın genel amacı, insülin uyarıcı koşullar altında pankreas beta hücrelerinin solunum fonksiyonunu doğrudan değerlendirmektir. Bu aynı zamanda farklı bileşiklerin beta hücresi solunum fonksiyonu üzerindeki etkisini gözlemlemek için de kullanılabilir. Bu yöntem, belirli bir bileşiğin solunumdaki değişiklikler yoluyla pankreas beta hücresi fonksiyonunu etkileyip etkilemediği gibi pankreas beta hücre fizyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, bazal ve insülin stimülatör koşullar altında pankreas beta hücrelerinde solunum fonksiyonunu doğrudan değerlendirmek için kullanılabilmesidir. Hücre hazırlama ve solunum ölçümünde gerekli hassasiyet nedeniyle hücre hazırlama ve makine kullanım adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Başlamak için, INS-1'den türetilen 832/13 beta hücrelerini takviye edilmiş RPMI 1640'ta kültürleyin.

İki mililitre% 0.25 tripsin ekleyerek ve 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe ederek hücreleri bir T75 şişesinden çıkarın. Ardından, sekiz mililitre tam RPMI 1640 ortamı ekleyerek tripsini nötralize edin. Hücre hacminin 100 mikrolitresini 900 mikrolitre PBS'de seyreltin ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.

Daha sonra, hücreleri 10 santimetrelik bir tabakta mililitre başına bir milyon hücre yoğunluğunda kaplayın. Solunum deneylerine başlamadan önce hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de kültürleyin. 832/13 hücrelerini 37 santigrat derece ve %5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde kapladıktan ve kültürledikten 24 saat sonra ortamı değiştirin.

Daha sonra, hücreleri 100 nanomolar nihai konsantrasyon için araç kontrolü veya kakao türevi epikateşin monomeri ile tedavi edin. Nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de 24 saat daha kültür ile tedavinin eklenmesini takip edin. Daha sonra, hücreleri 1x düşük glikoz sekresyon tahlil tamponunda veya SAB'de beş dakika yıkayın.

Tamponu aspire edin ve hücreleri 1x düşük glikoz SAB'de üç saat inkübe edin ve tamponu her saat değiştirin. İnkübasyondan sonra, hücreleri bir mililitre% 0.25 tripsin ile tabaktan çıkarın. Araç kontrolü ile muamele edilen tabaktan alınan tripsin hücrelerini, 15 mililitrelik konik bir tüpte dört mililitre SAB ile birleştirin.

Benzer şekilde, ilgilenilen bileşik ile muamele edilen yemeği bir tampon ile birleştirin. Hücre hacminin 100 mikrolitresini 900 mikrolitre PBS'de seyreltin ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Hücre hacminin 100 mikrolitresini 900 mikrolitre PBS'de seyreltin ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.

Veriler, mililitrede bir milyon hücre konsantrasyonunun en etkili olduğunu göstermektedir. Yüksek çözünürlüklü respirometreyi metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi hazırladıktan sonra, her oksigraf odasına 2,4 mililitre 1x düşük glikoz SAB tamponu ekleyin. Haznedeki manyetik karıştırma çubuklarını kullanarak 750 rpm ve 37 santigrat derecede, 2.0 saniyelik bir veri kayıt aralığı ile tamponu sürekli olarak karıştırın.

Bunu yapmak için F7 düğmesini seçin ve sistemler etiketli sekmeyi açın. Pistonları sonuna kadar itin ve ardından anahtar havalandırma ayarına geri çekin. Sabit oksijen akısı elde edilene kadar makinenin en az bir saat dengelenmesine izin verin.

Ardından, deney süresince Makineyi 37 santigrat dereceye ayarlayın. Polarizasyon voltajını iki kazançla 800 milivolta ayarlamak için F7 düğmesine basın ve Oksijen O2 etiketli sekmeyi açın. SAB tamponunun oksijen konsantrasyonunu, oksijen konsantrasyonundaki değişiklik stabil olana kadar en az 30 dakika dengeleyin.

Ardından, shift tuşuna basarak, fareye sol tıklayarak ve fareyi seçilen bölge boyunca sürükleyerek oksijen konsantrasyonundaki değişimin arka plan ölçümünü oluşturmak için oksijen konsantrasyonundaki değişimin sabit olduğu bir bölge seçin. Seçilen bölgeyle ilişkili harfe tıklayın ve iki odanın her birine karşılık gelen her iz için R1 olarak değiştirin. Ekranın sol ve sağ alt köşelerinde bulunan O2 kalibrasyon kutusuna çift tıklayın.

Hava kalibrasyonu için R1 olarak İşaret Seç düğmesine tıklayın ve ardından her iki oda için kalibre et ve panoya kopyala'yı seçin. Daha sonra, her bir odaya 2.4 mililitre numune yükleyin, kontrol aracıyla muamele edilmiş hücrelerle bir oda ve 1x düşük glikoz SAB'de bileşik muamele edilmiş hücrelerle bir oda yükleyin. Pistonu sonuna kadar itin ve kalan hacmi aspire edin.

Sonraki tüm adımlar için hücreleri deney boyunca 750 rpm ve 37 santigrat derecede sürekli olarak karıştırın. Örnekler yüklendiğinde F4'e tıklayarak ve işareti hücre olarak etiketleyerek bir işaret oluşturun. Numuneleri 30 dakika boyunca ölçün.

Sinyal stabilizasyonundan sonra, düşük glikoz koşullarına karşılık gelen oksijen konsantrasyonundaki değişimin bir bölgesini seçin. Daha sonra, bir şırınga kullanarak titanyum yükleme portundan her bir odaya 12,5 mikrolitre% 45 steril glikoz çözeltisi ekleyin. Tedavi eklendiğinde glikoz etiketli bir işaret yapın.

Kararlı bir oksijen akışı elde edilene kadar sinyalin stabilize olmasına ve hücresel solunumu kaydetmesine izin verin. Bu noktada, uyarıcı koşullara karşılık gelen 16.7 milimolar glikoz okumasını temsil etmek için oksijen konsantrasyonundaki değişim bölgesini seçin. Sinyal stabilizasyonuna ulaşıldıktan sonra, yükleme portundan her odaya bir mikrolitre beş milimolar Oligomisin A ekleyin.

İşlem eklendiğinde OligoA etiketli bir işaret yapın. Kararlı bir oksijen akışı elde edilene kadar sinyalin stabilize olmasına ve hücresel solunumu kaydetmesine izin verin. Kararlı oksijen akışı elde edildiğinde, eğrinin bu alanını seçin.

Oligomisin A, ATP sentazı inhibe eder ve bu nedenle meydana gelen tek oksijen akışı, oksidatif fosforilasyon değil, elektron sızıntısıdır. Daha sonra, maksimum solunum hızı belirlenene kadar bir mikrolitrelik artışlarla bir milimolar FCCP ekleyin. Bu, maksimum bağlanmamış solunumu temsil eder.

Üç ila dört mikrolitre FCCP arasında, INS-1'den türetilmiş 832/13 beta hücrelerinin maksimum eşleşmemiş solunumunu indüklemek için yeterlidir. Tedavi eklendiğinde FCCP etiketli bir işaret yapın. Kararlı bir oksijen akışı elde edilene kadar sinyalin stabilize olmasına ve hücresel solunumu kaydetmesine izin verin.

Ardından, eğrinin bu alanını seçin. FCCP, bağlanmamış solunumun ölçülmesine izin veren bir ayrılma maddesidir. Sinyal stabilizasyonuna ulaşıldıktan sonra, yükleme portundan her odaya bir mikrolitre beş milimolar Antimisin A ekleyin.

Tedavi eklendiğinde AntiA etiketli bir işaret yapın ve eğri seçim prosedürünü tekrarlayın. Respirometre analiz programının F3 düğmesine basarak tahlilde kullanılan mililitre başına hücre sayısını girin. Birimleri mililitre başına hücrelere değiştirin, hücresel konsantrasyonu girin ve ortamı SAB olarak değiştirin.

Oksijen kalibrasyon formunu seçip girerek verileri normalleştirmek için arka plan okumalarını seçin. 2.5 milimolar glukoz, 16.7 milimolar glukoz, Oligomisin A, FCCP ve Antimisin A.Respirometre analiz programı içinde, protein konsantrasyonunu girin ve solunum ölçümü sırasında her tedavi için uygun ortalama değerleri seçin. Ardından, F2'ye tıklayın ve panoya kopyala işlevine tıklayın.

Bu, verileri diğer analiz programlarında kullanılmak üzere dışa aktarır. Hesaplamalar için O2 eğimi negatif değerlerini kullanın. INS-1'den türetilen 832/13 beta hücrelerinin bozulmamış hücresel solunumu üzerindeki etkisini belirlemek için, araçla tedavi edilen kontrollerin ve doğal bileşiklerle tedavi edilen hücrelerin üç ila beş bağımsız çalışması için verileri derleyin.

Bozulmamış INS-1'den türetilen 832/13 beta hücreleri, oksijen kullanımında glikoz kaynaklı bir artış gösterir. Uygun sayıda hücrenin kullanılması çok önemlidir. Bu deneyde toplanan sonuçlar, mililitrede bir milyon hücrenin en uygun miktar olduğunu göstermektedir.

Kurkumin ile tedavi edilen INS-1'den türetilen 832/13 beta hücreleri, genel solunumda değişiklik göstermez. Tersine, monomerik kakao epikateşinleri ile tedavi edilen INS-1'den türetilmiş 832/13 beta hücreleri, 2.5 milimolar glukoz ve 16.7 milimolar glukozda solunumu arttırdı. Bazal, fosforile olmayan solunum durumu olan sızıntı durumunun yanı sıra elektron taşıma sistemi solunumu veya maksimum solunum olan ETS durumu sırasında da artan solunum gözlenir.

Bu videoyu izledikten sonra, insülin uyarıcı koşullar altında pankreas beta hücrelerinin solunum fonksiyonunu doğrudan nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa beş saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, hücreleri düşük glikoz SAB tamponu ile ön işleme tabi tutmayı ve tahlil için doğru hücre sayımlarını almayı unutmamak önemlidir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, etkili ölçümler için doğru miktarda hücre elde etmek için mücadele edeceklerdir. Çok fazla hücre ile sinyalin değerlendirilmesi zordur ve çok az hücre ile sinyal tutarlı bir şekilde ölçmek için yeterince yüksek değildir. Bu tekniğin etkileri, diyabetin ve pankreas beta hücre fonksiyonundaki değişikliklerden etkilenen herhangi bir durumun tedavisine veya teşhisine kadar uzanır, çünkü mitokondriyal solunum, insülin sekresyonunun nasıl çalıştığının kritik bir bileşenidir.

Bu prosedürü takiben, bu bileşiklerin insülin sekresyonu üzerindeki etkisi nedir gibi ek soruları yanıtlamak için glikoz ile uyarılan insülin sekresyonu gibi başka yöntemler de uygulanabilir. Bu yöntem beta hücre fonksiyonu hakkında bilgi verebilse de, kas, karaciğer, yağ ve diğer mitokondriyal solunum analizleri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.