Name: Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: Öğrenin, Campylobacter jejuni Tlp3 kemoreseptörünün ligand bağlayıcı etki alanını inklüzyon cisimciklerinden refold ederek arıtma yöntemini. Bu teknik, fonksiyonel protein elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yu C. Liu Tlp3-yakın üretim üzerine erken çalışmaları için teşekkür ediyoruz. Mayra A. Machuca Paraguay Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS doktora burs için borçlu.

1. ifade onun6-Tlp3- E. coli yakın
<ol><li>150 mL steril Luria-Bertani (LB) suyu 50 µg mL-1 Ampisilin ile BL21-kodon-Plus (DE3) içeren aşılamak - RIPL hücreleri ile ifade onun6pET151/D-TOPO vektör dönüşüm - Tlp3-yakın (amino asit kalıntıları 42-291), ve Bu bir shaker (yörünge çapı, 25 mm) 37 ° C'de 200 d / gecede kuluçkaya.</li>
	<li>800 mL steril LB suyu ve 50 µg mL-1 Ampisilin içeren altı 2 L Erlenmeyer şişe hazırlayın. Her şişesi 20 mL adım 1.1 den elde edilen gecede kültür ile aşılamak. Onları 37 ° C'de sürekli 200 devir / dakikada 600 nm ulaşır 0.6, optik yoğunluk kadar sallayarak ile kuluçkaya.</li>
	<li>1 mL şişe (uninduced denetimi örneğini), bir benchtop santrifüj (13.000 x g, 4 ° C, 10 dk) kullanarak Pelet birinden aliquot almak ve süpernatant atın. Bakteriyel Pelet sonraki SDS-sayfa analizi için-20 ° C'de depolayın.</li>
	<li>Protein ifade her şişeyi kültürü ile 1 mM lik izopropil β-D-thiogalactoside (IPTG) ekleyerek teşvik. Şişeler için bir ek 4 h 200 devirde bir shaker 37 ° C'de kuluçka devam edin.</li>
	<li>Hücreleri tarafından Santrifüjü 5000 x g 4 ° C'de 15 dakika, hasat ve süpernatant atın. Not: Bu noktada,-80 ° C dondurucu depolama içine hücre Pelet yerleştirerek yordamı duraklatılmış.</li>
</ol>2. izolasyon ve denatürasyon dahil organlarının
<ol><li>250 mL kabı 1.5. adımda elde edilen tüm hücre topakları nakletmek ve 100 mL (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl) arabelleği A eklemek. Eğer tamamen (dondurulmuş) çözülme hücrelere izin ve Pelet resuspend. Örnek buz üzerinde aksi belirtilmedikçe tutun.</li>
	<li>Yüksek basınç homogeniser ile resuspended hücreleri hücreleri parçalayıcı ve tam genomik DNA kesme emin olmak için üç kez geçmek.</li>
	<li>Lysate, 10.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi 1 mL örnek süpernatant (çözünür kesir) toplamak ve -20 ° c daha sonraki SDS-sayfa analiz için saklayın. Süpernatant geri kalanı atın ve Pelet Buza koyun. Not: Bu Pelet renk beyazdır (kahverengi gölgesinde olan kırılmamış hücrelerden ismi renkli) ve dahil organları içerir.</li>
	<li>Dahil organları Pelet buz gibi soğuk arabellek B iyice 20 mL resuspend (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.2 mM phenylmethanesulfonyl florür (PMSF), % 1 Triton X-100). Bu solubilisation membran ve membran proteinlerinin kolaylaştırır. Resuspension yardım etmek 1-2 min için girdap.</li>
	<li>Örneği ' 10.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
	<li>Pelet buz gibi soğuk arabellek B iyice 20 mL vortexing 1-2 dk. Pelet küçük parçalara ayrılır sağlamak için tüp tarafından resuspend. Damlalıklı yukarı ve aşağı Pelet resuspension yardımcı olmak için örnek. Not: İyice organları eklenmesi kirleri ücretsiz almak için Pelet resuspend önemlidir.</li>
	<li>2.5 arasındaki adımları yineleyin. Süpernatant bulutlu veya renkli 2.6 ve (bu sırayla) 2.5 süpernatant kadar adımları yineleyin ise, açık ve renksiz.</li>
	<li>Vortexing 1-2 min için tüp tarafından Pelet buz gibi soğuk arabellek C 20 ml (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.2 mM PMSF) resuspend.</li>
	<li>2.5 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>25 dahil organları Pelet çözülmeye mL buz gibi denaturing arabellek D (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 8 M üre, 10 mM dithiothreitol (DTT), 0.2 mM PMSF) ekleyin. İyice vortexing kadar Pelet küçük parçalara ayrılır veya 1-2 min için tarafından resuspend.</li>
	<li>Mix süspansiyon tarafından 30-120 dk 4 ° C'de 30 RPM dönüş hızı ile eksenel dönme</li>
	<li>Santrifüjü 30.000 x g, 30 dk için 4 ° C de tarafından denatüre protein çözüm açıklamak, süpernatant Buza koyun ve Pelet atın.</li>
	<li>Bradford tahlil kullanarak protein konsantrasyonu ölçmek. 24 SDS-jel analiz için bir aliquot alıp -20 ° C'de yerleştirin Not: Bu noktada, yordamı ek-bölünmemeli örnek sıvı azot donma tarafından durduruldu ve depolama için-80 ° C'de tutun.</li>
</ol>3. protein Refolding
<ol><li>250 mL arabelleği E (3 M üre, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.4 M L-Arginin monohydrochloride, 20 mM azaltılmış L-glutatyon, 2 mM oksitlenmiş L-glutatyon) 500 mL ölçek hazırlamak ve arabellek 4 ° c kadar serin</li>
	<li>Onun6içeren denatüre protein karışımı 60 mg eklemek-Tlp3-yakın 500 rpm'de arabellek karıştırarak arabellek E, 2.13-250 mL. adımda elde. Sürekli karıştırarak için 24-48 h 500 RPM ile 4 ° C'de mix refolding kuluçkaya. Bu adımda son protein konsantrasyonu 0.2 mg mL-1olduğunu.</li>
	<li>7 L 8-10 L kovası A arabellekte hazırlamak ve bir sonraki adım (Adım 3.4) için 24-48 h gerçekleşecek hazırlık 4 ° C aşağı soğumaya (akış çizelgesi Şekil1 bakınız).</li>
	<li>Bir ~ 50 cm adet diyaliz hortumunun 28 mm şişirilmiş çapının, molekül ağırlığı kesme, 12-14 kDa 10 mM ethylenediaminetetraacetic asit disodyum tuzu (EDTA-Na2) 200 mL içine sokmak ve gaz alev üzerinde kaynar kadar ısı. Durulama diyaliz membran ile GKD2O. 200 mL</li>
	<li>Diyaliz boru kapatma ile diyaliz membran bir ucunu kelepçe ve 250 mL karışımı adım 3.2 diyaliz tüp içine elde refolding transfer. Açık ucu başka bir kelepçe ile kapatın. Sızıntı yok emin olmak için membran bütünlüğünü denetleyin.</li>
	<li>3.3. adımda hazırlanan tampon a önceden soğutulmuş 7 L ile diyaliz kovada diyaliz tüpü yerleştirin. Bar, karıştırma sırasında diyaliz boru dokunmayacaksın sağlanması manyetik bir heyecan yerleştirin.</li>
	<li>Örnek 4 ° C'de 500 rpm'de karıştırmaya devam ile dialyse ve arabellek en az dört kez bir süre 12 h içinde değiştirin. Son arabellek değiştirdikten sonra bir gecede dialyse örnek bırakın. Not: yavaş yavaş diyaliz sırasında üre (~ 3 M) fazlalığı sağlar refold protein denatüre protein eriyik--dan kaldırılır. Ağır protein yağış diyaliz sonunda görülebilmektedir.</li>
	<li>Ve 500 mL kabı içeriğini transfer diyaliz tüp kova çıkarın. Protein çözüm buz, aksi belirtilmedikçe tutun.</li>
	<li>Protein çözüm 0.43 µm gözenek boyutu membran aracılığıyla zarlarını protein var kaldırmak için 500 mL cam şişe içine filtre.</li>
</ol>4. arıtma onun6-Metal iyon hareketli benzeşme Kromatografi kullanarak Protein öğesini
<ol><li>
Ücret ve 5 mL prepacked şelat sütun equilibrate.
	<ol>
<li>Sütun bağlayan boru içinde hapsolmuş hava olduğunu kontrol ettikten bir Peristaltik pompa bağlayın.</li>
		<li>Sütun ile 25-50 mL GKD2O. geçirerek yıkama</li>
		<li>Sütun 3 mL 0.1 M NiCl2 yükleme ve sonra GKD2O. 25 mL şarj</li>
		<li>Sütun 25 mL (yükleme tampon, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole) arabelleği F ile equilibrate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adım 3.9 arabellek F kompozisyon 1 M Tris-HCl pH 8.0, 25 mL 5 M NaCl ve 2 M imidazole hisse senedi çözümleri 2.5 mL 2.5 mL ekleyerek elde refolded protein örneği ayarlayın.</li>
	<li>Örnek hızı 5 mL/dak veya daha az ve atma akışı aracılığıyla sütuna (ilişkisiz proteinler) yükleyin.</li>
	<li>Sütun olmayan özellikle ilişkili proteinler kaldırmak ve akışı üzerinden atmak için arabellek F 50-100 mL ile yıkayın.</li>
	<li>Onun6elute-Tlp3-25 mL (elüsyon arabellek, 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 500 mM imidazole) arabelleği G ile yakın ve (Bradford reaktifi kullanılarak belirlenen) protein içeren akış yoluyla kesirler Havuzu.</li>
	<li>Bradford tahlil kullanarak havuza alınan örnek protein konsantrasyonu ölçmek. Küçük bir aliquot SDS-sayfa analizi ve-20 ° C'de yer almak</li>
</ol>5. onun6-TEV proteaz (isteğe bağlı) kullanarak kaldırma etiketi
<ol><li>Hazırlamak ve aşağı 4 ° C, 4 L (TEV bölünme tampon, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, %1 (v/v) gliserol, 2 mM DTT) arabelleği H serin.</li>
	<li>Yaklaşık 5-7 cm diyaliz Boru kesme (çapı 2-3 cm) ve 200 mL GKD2O. bırakın</li>
	<li>Onun6eklemek-TEV proteaz onun için öğesini6-etiket protein 1 TEV son molar oranı 4.5. adımda hazırlanan: 8 protein.</li>
	<li>Bir ucunu bir Diyaliz boru kapatma ile boru kelepçe ve protein/TEV proteaz karışımı ile doldurun. Diğer ucunu kapatın ve hiçbir sızıntı olduğundan emin olun.</li>
	<li>Diyaliz öncesi soğutmalı 4 L arabelleği H (Kimden adım 5.1) içine tüp ve sürekli ile 4 ° C'de kuluçkaya yer 2 h. değişiklik arabellek karıştırma ve diyaliz gecede TEV-aracılı bölünme tepki tamamlamak izin vermek için devam edin.</li>
	<li>Bu arada, hazırlamak ve serin (4 ° C) 4 L arabellek ben (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, %1 (v/v) gliserol) ertesi gün için hazırlık.</li>
	<li>Gecede diyaliz sonra 5.6 adımda hazırlanan tampon tampon Döviz ve başka bir 1-2 h 4 ° C'de dialyse</li>
	<li>Tüp bir ucunu Açıl ve protein çözüm bir 50 mL Falcon tüp transfer tüp diyaliz kova çıkarın. Çözüm 0.43 µm gözenek boyutu şırınga filtre ile filtre ve aksi belirtilmediği sürece buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Örnek hacmi ölçmek ve arabellek F kompozisyon Tris, NaCl ve imidazole konsantrasyon ayarlayın (örneğin protein çözüm arabelleği J 25 mL için eklemek 0.25 mL 1 M Tris-HCl pH 8.0, 1,75 mL 5 M NaCl ve 2 M imidazole 0.25 mL).</li>
	<li>5 mL HiTrap şelat HP sütun 4.1. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
	<li>Örnek sütuna yük (akış oranı: 5 mL/dak) ve akış-etiketsiz Tlp3-yakın (artıkları 42-291) içeren aracılığıyla, toplamak. Uncleaved protein, i ciddi onun6-etiket ve onun6- TEV sütun tarafından korunur.</li>
	<li>Tüm etiketsiz protein akışı ve eluate toplamak izin vermek için sütun ile 5 mL arabellek F (yükleme arabellek) yıkayın.</li>
	<li>Havuz eluate 5,11 ve 5.12 adımlarda elde edilen ve protein konsantrasyonu ölçmek. Küçük bir aliquot almak ve SDS-sayfa analizi için-20 ° C'de saklayın.</li>
</ol>6. boyut-dışlama Kromatografi (jel filtrasyon) Tlp3-yakın
<ol><li>1 L (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl) arabelleği A hazırlamak ve 0.43 µm membran kullanarak filtre uygulayabilirsiniz.</li>
	<li>Arabellek A 4 mL/dk akış hızında bir 26/60 boyutu-dışlama sütun equilibrate.</li>
	<li>3-4 mL 15 mL santrifüj yoğunlaştırıcı bir 10 kDa kesme ile (4 ° C, 4.000 x g) kullanarak bir birimi 5.13. adımda elde edilen protein örnek konsantre.</li>
	<li>Santrifüjü 13.000 x g, zarlarını protein var kaldırmak 30 dk için 4 ° C de tarafından protein çözüm açıklamak.</li>
	<li>Örnek önceden dengelenmiş 26/60 jel filtrasyon sütuna yerleştirin. Kromatografi arabellek A 4 mL/dak monitör UV izleme akış hızında gerçekleştirir. Tlp3-yakın 210-220 mL saklama ses seviyesinde elutes. Tepe kesirler havuz.</li>
	<li>Protein konsantrasyonu ölçmek. Küçük SDS-sayfa analizi için aliquot al.</li>
</ol>7. SDS-sayfa analiz Protein arıtma çeşitli aşamalarında toplanan örnekleri
<ol><li>SDS-sayfa çalışan arabelleği (arabellek J) 1 L hazırlamak, 25 mM içeren Tris, 250 mM glisin pH 8.3 ve % 0.1 (w/v) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS).</li>
	<li>5 SDS-sayfa yükleme arabellek (arabellek K) x 10 mL hazırlamak, 0.25 M Tris-HCl pH 6.8 içeren, mavi (w/v) % 10 SDS, % 50 (v/v) gliserol, 1 mM DTT ve %0,05 bromophenol.</li>
	<li>İzin arıtma farklı adımları sırasında toplanan aliquots (adımlar 1.3, 2.3, 2.13, 4.6, 5.13, 6,6) çözülme.</li>
	<li>Her örnek için toplam protein 15 µg SDS-sayfa yükleme tampon ve 10 µL GKD2O. için ses seviyesini 5 x 2 µL ile karşılık gelen birim mix</li>
	<li>Örnekleri 5-10dk için 95 ° c ısı, onları 10.000 x g 30 s ve transferi de spin temiz bir tüp içine örnekleri.</li>
	<li>Jel ayıran % 15 polyacrylamide kullanarak bir SDS-sayfa jel hazırlamak (5 mL: 2.5 mL %30 (w/v) BIS-Akrilamid, 1.2 mL için 1,5 M Tris-HCl pH 8.8, 1.2 mL GKD2O, 50 µL (w/v) SDS % 10, 50 µL % 20 (w/v) amonyum persülfat (APS), 3 µL tetramethylethylenediamine (TEMED) ve % 5 polyacrylamide jel istifleme (2 mL: 340 µL % 30 (w/v) BIS-Akrilamid için 250 µL 1 M Tris pH 6.8, 1,37 mL GKD2O, 20 µL %10 (w/v) SDS, 20 µL %20 (w/v) APS, 2 µL TEMED).</li>
	<li>Elektroforez cihazları monte ve SDS sayfa arabellek üreticisinin tavsiye başı olarak çalıştıran x 1 ile doldurun.</li>
	<li>Protein molekül ağırlığı marker ve 7,5 adımda hazırlanan örnekleri yükleyin. 25 sabit bir akım, Elektroforez gerçekleştirmek anne.</li>
	<li>Jel bir konteyner içine aktarmak ve GKD2O. eklemek 150 mL % 25 (v/v) isopropanol, % 10 (v/v) Asetik asit ve %0.03 (w/v) parlak mavi R-250 içeren çözüm boyama Coomassie mavi ile durulayın. Kapsayıcı bir yatay döndürme platform, oda sıcaklığında 30 dakika yerleştirin.</li>
	<li>Jel GKD2O ile durulayın ve %5 (v/v) metanol ve %7 (v/v) Asetik asit içeren destaining çözüm yerleştirin. Yatay döndürme platformu için 1 h kullanarak karıştırma sırasında destain.</li>
	<li>Jel görüntü ve analiz.</li>
</ol>8. dairesel Dichroism (CD) spektroskopi analiz ikincil yapısı refolded saf protein
<ol><li>0.5 - 1 mg diyaliz tüp içine adım 6,6 elde refolded protein aktarmak ve 5 4 ° C'ye precooled L L tamponunun (50 mM sodyum fosfat pH 7,4), içeren bir Diyaliz kova yere koyun Sürekli karıştırarak ile 4 ° C'de örnek dialyse ve en az 3-4 arabellek değişiklikleri gerçekleştirmek üzerinde 2-4 h gecede dialyse örnek ayrılmadan önce.</li>
	<li>Dialysed protein çözüm 10 kDa kesme santrifüj yoğunlaştırıcı kullanarak 0.06 mg mL-1 için konsantre.</li>
	<li>Santrifüjü 13.000 x g, 30 dk için 4 ° C de tarafından çözüm açıklamak.</li>
	<li>Örnek bir spectropolarimeter 20 nm min-1tarama oranı ile kullanarak 200-260 nm dalga boyu aralığı boyunca 25 ° c kadar UV CD spektrum kaydedin. Diyaliz arabellek boş bir denetim olarak kullanın. Nüsha kayıt tekrarlayın ve ortalama spektrum oluşturmak.</li>
	<li>İkincil yapı içeriğini hesaplamak CD deconvoluting tarafından25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk) DichroWeb CDSSTR programdan kullanarak spectra sever.</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

İfade ve bakteriyel chemoreceptor Tlp3 periplasmic yakın dahil vücutlarından refolding için basit bir yordam sunulur. Saf protein hazırlanması içerir E. coli, arıtma ve solubilisation dahil organlarının evde beslenen hayvan-plazmid kodlu genin aşırı ifade denatüre protein ve onun arıtma ardışık benzeşimi tarafından refolding ve Boyut-dışlama Kromatografi adımları. Denatürasyon üre kolaylaştırdı ve seyreltme/diyaliz-aracılı refolding protokolündeki optimizasyonu hangi kez dahil organları26...

Kemotaksis ve motilite bakteri kolonizasyonu ve ana bilgisayar1,2,3işgali teşvik ederek Campylobacter jejuni patogenezinde önemli rol oynamaya gösterilmiştir. Kemotaksis kimyasal sinyalleri tarafından güdümlü olarak bakteri büyüme için en iyi bir ortam doğru taşımak izin verir. Bu işlem chemoreceptors olarak adlandırdığı proteinler veya dönüştürücü gibi proteinler (TIPS) kümesi tarafından tanınması hücre içi ve çevresel kimyasal ipuçları içerir. Çoğu chemoreceptors proteinler membran katıştırılmış bağlayıcı etki alanı (yakın), bir transmembran ve ikincisi olan sinyal iletimi sitozolik sinyalizasyon proteinler ile etkileşim bir sitoplazmik sinyal verme etki alanı, bir extracytoplasmic ligand ile vardır kamçılı motorlar4,5,6,7.
Onbir farklı chemoreceptors C. jejuni genom4,8' tespit edilmiştir. Bugüne kadar bu chemoreceptors yalnızca bazılarını tanımlanabilecek ve Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712ve13 Tlp11 ligand özgüllük bilinmektedir. Bu türler içinde kalan chemoreceptors ve çok sayıda chemoreceptors diğer bakterilerde doğal ligandlar tanımlaması büyük ölçüde katlanmış ve son derece saf rekombinant chemoreceptor LBDs14, üretim tarafından kolaylaştırılabilir 15 , 16. ancak, girişimleri heterologously Escherichia coli bakteri chemoreceptors periplasmic LBDs sık sık ifade etmek için neden kendi dahil organları17,18,19 hedefleme . Yine de, bu olay kolay yalıtım ve kurtarma protein el kolaylaştırabilir. Burada, protein kurtarma dahil organları, refolding ve arıtma, C. jejuni chemoreceptor Tlp3 periplasmic yakın bir örnek olarak kullanarak bir yöntem sunulur. Çünkü, iki bileşenli histidin kinaz ve prokaryotlar20,21, chemoreceptors bol bol bulunan algılama etki alanlarının dCACHE aile20 Tlp3-yakın ait bu örnek seçildi 22 , 23.
Bu yaklaşım, pET151/D-TOPO vektör üzerinde alarak ifade inşa bir N-terminal onun6dahil etmek için dizayn edilmiştir-etiket bir tütün tarafından takip etch virüs (TEV) proteaz bölünme sitesi, sonraki etiketi kaldırma19. E. coli, yalıtım ve dahil organları ve üre tükenmesi tarafından refolding protein solubilisation üre-aracılı protein overexpression protokolünü açıklar. Refolding, aşağıdaki örnekte benzeşimi Kromatografi, isteğe bağlı etiket kaldırma ve boyutu-dışlama Kromatografi ile tarafından saf. Saf protein katlanmış durumunu dairesel dichroism spektroskopisi kullanılarak doğrulanır. Bu daha önce yeniden elde etmek ve farklı bir chemoreceptor, Helicobacter pylori TlpC19yakın arındırmak için geliştirilen yöntem değiştirilmiş bir sürümü var. Şekil 1' de özetlenmiştir bu yordamı, saf, etiketsiz Tlp3-yakın bakteri kültürü, 1 litre başına 10-20 mg protein saflığı verimleri > SDS-sayfa tarafından tahmini olarak % 90'ı.

<table><tbody><tr><td>Tris bazı</td><td>AMRESCO</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>MERK MILLIPORE</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>G-BIOSCIENCES</td><td>A051-B</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetansülfonil florür (PMSF)</td><td>MERCK</td><td>52332</td><td></td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>AMRESCO</td><td>694</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil ve beta;-D-tiyogalaktozit (IPTG)</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td></td><td></td></tr> AST0487 <tr><td>Üre</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC0568</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td>C-1029</td><td></td></tr><tr><td>L-arginin monohidroklorür</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A5131</td><td></td></tr><tr><td>Azaltılmış L-glutatyon</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Oksitlenmiş L-glutatyon</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G4376</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik (Na2HPO4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik (NaH2PO4)</td> <td>SIGMA-ALDRICH</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu dehidrat (EDTA)</td> <td>AMRESCO</td><td>VWRC20302.260</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td></td><td></td></tr> BIOGB0232 <tr><td>Nikel klorür (NiCl2)</td> <td>SIGMA-ALDRICH</td><td>339350</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC0167</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat (SDS)</td> <td>SIGMA-ALDRICH</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Lekesiz Protein Merdiveni, Geniş Aralık (10-250 kDa)</td><td>NEW ENGLAND BIOLABS</td><td>P7703</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultracel santrifüj yoğunlaştırıcı (Millipore)</td><td>MERCK</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tüp</td><td>FALCON</td><td>BDAA352070</td><td></td></tr><tr><td>Diyaliz tüpü</td><td>LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY</td><td>Diyaliz</td><td></td></tr><tr><td>Yılan derisi diyaliz tüpü</td><td>THERMO SCIENTIFIC &TİCARET;</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>Hazır Ambalajlı HiTrap Şelatlama HP sütunu</td><td>GE HEALTHCARE YAŞAM BİLİMLERİ</td><td>17-0408-01</td><td></td></tr><tr><td>EmulsiFlex-C5 yüksek basınçlı homojenizatör</td><td>AVESTIN</td><td>EmulsiFlex&trade; - C5</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik Pompa P-1</td><td>GE HEALTHCARE YAŞAM BİLİMLERİ</td><td>18-1110-91</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 HiLoad 26/60 boyut ayırma sütunu&nbsp;</td><td>GE HEALTHCARE YAŞAM BILIMLERI</td><td></td><td></td></tr> 28989336 <tr><td>JASCO J-815 spektropolarimetre</td><td>JASCO</td><td>J-815</td><td></td></tr></tbody></table>

verimli refolding ve arıtma chemoreceptor ligand bağlayıcı etki için yöntemi

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Chemoreceptors ve yapısal çalışmaların ligand özgüllük moleküler temeli aydınlatma amaçlı doğal ligandlar tanımlaması büyük ölçüde saf, katlanmış ligand bağlayıcı etki alanları miligram miktarda üretim tarafından kolaylaştırılabilir. Heterologously periplasmic ligand bağlayıcı etki bakteriyel chemoreceptors Escherichia coli (e.coli) sık sık ifade etmek için girişimleri kendi dahil bedenlere hedefleme neden. Burada, bir yöntem dahil organları, onun refolding ve arıtma periplasmic dCACHE ligand bağlayıcı etki Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3, örnek olarak kullanarak, protein kurtarma için sunulmaktadır. Yaklaşım ifade ilgi ile bir yarilabilir protein içerir onun6-etiketi, yalıtım ve dahil organlarının solubilisation üre-aracılı protein üre tükenmesi ve arıtma benzeşme Kromatografi ile refolding etiketi kaldırma ve boyutu-dışlama Kromatografi tarafından takip. Dairesel dichroism spektroskopisi saf protein katlanmış durumunu doğrulamak için kullanılır. Bu iletişim kuralı genellikle dCACHE periplasmic ligand bağlayıcı etki alanından diğer bakteriyel chemoreceptors çözünür ve crystallisable miligram miktarda üretim için yararlıdır kanıtlanmıştır.

Rekombinant ifade onun6-Tlp3- E. coli yakın protein ifade dahil organlarında sonuçlandı. Onun6yaklaşık 100 mg 1 l bakteri kültürü 2,13 adımda hesaplanan ifade verim yapıldı-Tlp3-yakın dahil gövdelerinde yatırılır. Burada açıklanan ve şekil 1' de, resimli protein yalıtım, solubilisation dahil organları, protein refolding ve arıtma, benzeşim Kromatografi, etiketi kaldırma ve boyutu-dışlama Kromatografi ile özetlenebilir ve saf, et...

Bir yordam dCACHE periplasmic ligand bağlayıcı etki dahil organları ve protein miligram miktarlarda verim için arıtma Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3, refolding için sunulmaktadır.

Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Bu prosedürün genel amacı, inklüzyon cisimciklerinden bir kemoreseptör ligand bağlanma alanını yeniden düzenlemek ve yapısal ve fonksiyonel çalışmalarda kullanılmak üzere saflaştırmaktır. Bir bakteriyel kemoreseptörün hangi sinyalleri gönderdiğini ve nasıl gönderdiğini belirlemek için, küçük molekül kütüphanelerine karşı tarama yapmak veya ligandlı ve ligandsız yapıyı belirlemek için izole edilmiş ligand bağlanma alanları kullanılabilir. E.coli'de hücre dışı ligand bağlanma alanının baskılanması sıklıkla inklüzyon cisimciklerinde birikme ile sonuçlanır.Burada, inklüzyon cisimlerinden miligram miktarda fonksiyonel proteinin nasıl geri kazanılabileceğini gösteriyoruz. Başlamak için, mL ampisilin başına 50 mikrogram içeren 150 mL steril LB suyunu, hekzahistidin TIp3-LBD ekspresyonu için pET151 D-TOPO vektörü ile dönüştürülmüş BL21-CodonPlus RIPL hücreleri ile aşılayın. Kültürü gece boyunca 200 RPM ve 37 santigrat derecede inkübe edin.800 mL steril LB suyu ve mL ampisilin başına 50 mikrogram içeren altı adet 2L Erlenmeyer şişesi hazırlayın. Her şişeyi 20 mL gece boyunca kültür ile aşılayın. Şişeleri 37 santigrat derecede inkübe edin ve OD200 600'ya ulaşana kadar 0.6 RPM'de sürekli çalkalayın.Bu noktada, her şişeye 1 milimolar IPTG ekleyerek protein ekspresyonunu indükleyin. Şişeleri 37 santigrat derecede 200 RPM'de bir çalkalayıcıda dört saat daha inkübe etmeye devam edin. Hücreleri 15 dakika boyunca 5000 xg ve dört santigrat derecede santrifüjleme ile hasat edin.Ardından, süpernatanı atın. Tüm hücre peletlerini 250 mL'lik bir behere aktarın ve 100 mL Tampon A ekleyin.Dondurulursa, hücrelerin tamamen çözülmesine izin verin ve ardından peleti yeniden süspanse edin. Aksi belirtilmedikçe numuneyi buz üzerinde tutun.Daha sonra, hücreleri parçalamak ve genomik DNA'nın tamamen kesilmesini sağlamak için yeniden askıya alınan hücreleri üç kez yüksek basınçlı bir homojenizatörden geçirin. Ardından, lizatı 15 dakika boyunca 10.000 xg ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatantın bir mL'lik bir örneğini toplayın ve sonraki SDS-PAGE analizi için eksi 20 santigrat derecede saklayın.Ardından, süpernatantın geri kalanını atın ve peleti buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, inklüzyon cisimleri peletini 20 mL buz gibi soğuk Tampon B'de iyice yeniden süspanse edin. Bu, membran ve membran proteinlerinin çözünmesini kolaylaştırır. Yeniden süspansiyona yardımcı olmak için numuneyi bir ila iki dakika vorteksleyin.Numuneyi santrifüjledikten sonra, önce tüpü bir ila iki dakika vorteksleme yaparak peleti 20 mL buz gibi soğuk Tampon B'de tekrar iyice yeniden süspanse edin. Peletin küçük parçalara ayrıldığından emin olun. Ardından, numuneyi yeniden süspanse etmek için yukarı ve aşağı pipetleyin.Numuneyi daha önce olduğu gibi santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Süpernatan bulanık veya renkliyse, numuneyi tekrar santrifüjleyin ve yeniden süspanse etmek için ek buz gibi soğuk Tampon B kullanın. Tekrar peletlemeden önce süpernatan berrak ve renksiz olana kadar santrifüjleme ve yeniden süspansiyonu tekrarlayın.Pelete 20 mL buz gibi soğuk Tampon C ekleyin ve tüpü bir ila iki dakika girdaplayarak yeniden süspanse edin. Daha sonra, numuneyi döndürdükten sonra, 25 mL buz gibi soğuk denatüre edici Tampon D ekleyin. Tüpü bir ila iki dakika boyunca veya pelet küçük parçalara ayrılana kadar girdaplayarak inklüzyon cisimcikleri peletini iyice yeniden süspanse edin. Süspansiyonu 30 ila 120 dakika boyunca 30 RPM ve 4 santigrat derecede eksenel dönüşle karıştırın.Denatüre protein çözeltisini 30, 000 xg ve 30 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleme ile berraklaştırın. Sonra, süpernatanı buzun üzerine yerleştirin ve peleti atın. 500 RPM'de 250 mL Tampon E'yi karıştırırken, hekzahisadin TIp3-LBD içeren 60 miligram denatüre protein karışımı ekleyin.Yeniden katlama karışımını 24 ila 48 saat boyunca 500 RPM'de sürekli karıştırarak dört santigrat derecede inkübe edin. Nihai protein konsantrasyonu mL başına 0.2 mg'dır. Metin protokolüne göre yedi L önceden soğutulmuş Tampon A ve diyaliz tüpü hazırladıktan sonra, diyaliz membranının bir ucunu kelepçelemek ve diyaliz karışımını tüpe aktarmak için diyaliz tüpü kapağını kullanın.Ardından açık ucu sıkıştırın ve sızıntı olmadığından emin olun. Diyaliz tüpünü önceden soğutulmuş Tampon A ile bir diyaliz kovasına yerleştirin. Ardından, karıştırırken diyaliz tüpüne temas etmeyeceğinden emin olarak manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin. Numuneyi 500 RPM'de sürekli karıştırarak dört santigrat derecede diyalize edin ve tamponu 12 saatlik bir süre içinde en az dört kez değiştirin.Son tampon değişiminden sonra, numuneyi gece boyunca diyalize bırakın. Ertesi sabah, diyaliz tüpünü kovadan çıkarın ve içindekileri 500 mL'lik bir behere aktarın. Aksi belirtilmedikçe protein çözeltisini buz üzerinde tutun.Çökelmiş proteini çıkarmak için protein çözeltisini 0.43 mikron gözenek büyüklüğünde bir zardan 500 mL'lik bir cam şişeye süzün. Metin protokolüne göre bir şelatlama kolonunu yıkadıktan, şarj ettikten ve dengeledikten sonra, 25 mL 5 M sodyum klorür, 2.5 mL 1 M tris-HCl, pH 8.0 ve 2.5 mL 2 M İmidazol stok çözeltileri ekleyerek elde edilen yeniden katlanmış protein örneğini Tampon F bileşimine ayarlayın. Numuneyi dakikada 5 mL veya daha düşük bir hızda kolona yükleyin ve bağlanmamış proteinleri içeren akışı atın.Ardından, spesifik olarak bağlanmamış proteinleri çıkarmak ve akışı atmak için sütunu 50 ila 100 mL Tampon F ile yıkayın. Hekzahisadin TIp3-LBD'yi 25 mL Tampon G ile elute edin. Ardından, proteini içeren akış fraksiyonlarını bir araya getirin. Tampon H ve diyaliz tüpünü metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, tüpteki hekzahisadin etiketli proteine hekzahisadin etiketli TEV proteaz ekleyin.Bir TEV'den sekize kadar proteinin son molar oranını ekleyin. Kelepçeli diyaliz tüpünü önceden soğutulmuş dört L Tampon H'ye yerleştirin ve iki saat boyunca sürekli karıştırarak dört santigrat derecede inkübe edin. Ardından, tamponu değiştirin ve TEV aracılı bölünme reaksiyonunun tamamlanmasına izin vermek için gece boyunca diyalize devam edin.Tampon I'e geçtikten, protein çözeltisini filtreledikten ve numuneyi tekrar ayarladıktan sonra, numuneyi hazırlanmış beş mL HiTrap şelatlama HP kolonuna yükleyin. Dakikada beş mL'lik bir akış hızında, etiketlenmemiş TIp3-LBD'yi içeren akışı toplayın. Bölünmüş protein üzerinde, bölünmüş hekzahistadin etiketi ve hekzahisadin TEV sütun tarafından tutulur.Etiketlenmemiş proteinin akmasına ve elüatı toplamasına izin vermek için sütunu yıkamak için beş mL Tampon F kullanın. Daha sonra, bir boyut dışlama kolonunu dengeledikten ve protein numunesini metin protokolüne göre konsantre ettikten ve arıttıktan sonra, numuneyi önceden dengelenmiş 26/60 jel filtrasyon kolonuna yükleyin. Tampon A'yı dakikada dört mL'lik bir akış hızında uygulayın ve protein elüsyonu için UV izini izleyin.TIp3-LBD, 210 ila 220 mL'lik bir tutma hacminde ortaya çıkar. Son olarak, kromatografiyi takiben, fraksiyonları bir araya getirin, ardından protein konsantrasyonunu ölçün ve SDS-PAGE'i gerçekleştirin. Bu videoda gösterilen protein izolasyon prosedürü, bir L bakteri kültürü başına 10 ila 20 mg saf etiketlenmemiş TIp3-LBD verdi.Burada görüldüğü gibi, jel filtrasyon kolonundan ayrıştırılan protein, hesaplanan 29 kDa moleküler ağırlık ile 220 mL'lik bir tutma hacmine karşılık gelen tek, simetrik bir tepe noktasına sahiptir. Burada SDS-PAGE tarafından gösterildiği gibi, inklüzyon cisimleri, 31.8 kDa'lık amino asit dizisinden hesaplanan değere yakın olan, 28 kDa'lık görünür bir moleküler ağırlığa sahip ağırlıklı olarak hekzahisadin TIp3-LBD içeriyordu. Hekzahisadin etiketinin çıkarılması, afinite kromatografisi ve jel filtrasyon adımları, oldukça saf protein verdi.CDSSTR kullanan CD spektroskopisi, hekzahisdidin TIp3-LBD'nin ikincil yapısının %31 alfa-sarmal ve %23 beta-yaprak içeriğinden oluştuğunu ortaya koydu. Bunlar aynı zamanda JPred 3 sunucusu kullanılarak yapılan dizi analizinden sırasıyla %37 ve %26 olan tahmin edilen değerlere de yakındı. Bu protokol baştan sona en az beş gün gerektirir ve gerekirse üç farklı aşamada duraklatılabilir.Bu prosedürü denerken, inklüzyon cisimciklerinin denatüre edici tampon içindeki girdaplama veya yukarı ve aşağı pipetleme yoluyla tam ve eksiksiz bir şekilde yeniden süspansiyonunun, tüm bu gerçekleştirme için kritik olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, kemoreseptör TIp3'ün ligand bağlanma alanının nasıl yeniden düzenleneceğini ve saflaştırılacağını iyi anlamalısınız. Saflaştırılmış protein, ligandın bu reseptör için özgüllüğünü araştırmak için asitleri bağlamak için kullanılabilir.Ek olarak, bu prosedürle elde edilen proteinin yüksek dereceli kristaller üretmek için kullanılabileceğini daha önce göstermiştik ve bu, ligand özgüllüğünün yapısal temelinin çalışmalarının yolunu açmıştı. Bu prosedür genellikle kristalize edilebilir ve çözünür bir formda diğer bakterilerden mg miktarlarda kemoreseptör üretimi için yararlı olabilir. Bu protokolü, kristalografik çalışmalar için bu tipteki diğer kemoreseptörlerin ligand bağlanma alanını yeniden düzenlemek ve saflaştırmak için orijinal veya hafifçe değiştirilmiş formunda kullandık.Lütfen, her bir ayrı durumda, protokolün optimizasyonunun, örneğin, denatüre etme ve yeniden katlama tamponlarının bileşiminin ve inkübasyon sürelerinin muhtemelen gerekli olacağını unutmayın.

method-for-efficient-refolding-purification-chemoreceptor-ligand

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Protein-protein etkileşimlerini hedeflemek için REPLACE stratejisinin uygulanmasını açıklıyoruz. REPLACE , optimize edilmiş peptidik inhibitörlerin ilaç benzeri moleküllere dönüştürülmesi için sentetik ve hesaplamalı yaklaşımları içeren yinelemeli bir stratejidir.

Aracılığıyla DEĞİŞTİR Protein-protein etkileşimleri İnhibitörlerinin Geliştirilmesi: Tasarım ve Geliştirme Olmayan ATP Rekabetçi CDK inhibitörleri Uygulama

Burada, insan lökosit antijenleri tarafından sunulan T hücresi reseptörü ve tümör antijenleri arasındaki etkileşimin doğasının T hücresi işlevselliğini nasıl yönettiğini belirlemek için laboratuvarda yaygın olarak kullandığımız yöntemleri açıklıyoruz; bu yöntemler arasında protein üretimi, X-ışını kristalografisi, biyofizik ve fonksiyonel T-hücresi deneyleri yer alır.

X-ışını kristalografisi, biyofizik ve fonksiyonel tahliller kullanılarak mekanizmalar Yönetim T hücresi kanser antijenleri Reseptör tanıma belirlemek için

Tek molekül seviyesinde yüksek hassasiyetli FRET deneyleri için bir protokol burada sunulmuştur. Buna ek olarak, bu metodoloji, N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörünün ligand bağlama alanındaki üç konformasyonel durumu tanımlamak için kullanılabilir. Kesin mesafelerin belirlenmesi FRET deneylerine dayanan yapısal modellerin oluşturulmasına yönelik ilk adımdır.

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

Bu çalışma, doğal olmayan amino asit (UAA) dahil etme yoluyla bölgeye özgü etiketleme kullanarak G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerinde tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET) deneyleri gerçekleştirmek için ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. Protokol, smFRET numune hazırlama, deneyler ve veri analizi için adım adım bir kılavuz sağlar.

Tek Moleküllü FRET Kullanarak Membran Reseptörlerinin Konformasyonel Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Bu protokol, makromoleküllerin kriyoEM haritalarında küçük moleküllü ligandları modellemek için mevcut araçları tanıtır.

Ligandların Elektron Kriyomikroskopisinden Türetilen Haritalara Modellenmesi

Protein-protein etkileşimlerinde (PPI'ler) çok spesifik bağlanma bölgelerinin amino asit tercihlerini tahmin etmek için dizi çeşitlendirmesine dayalı bir metodoloji açıklıyoruz. Bu stratejide, binlerce potansiyel peptit ligandı üretilir ve in silico olarak taranır, böylece mevcut deneysel yöntemlerin bazı sınırlamalarının üstesinden gelinir.

Protein-Protein Etkileşimlerinde Görev Alan Potansiyel Olarak Çok Spesifik Peptit Bağlayıcı Alanların Amino Asit Tercihlerinin Hesaplamalı Tahmini

Burada, yeni ilaçların keşfinde hayati öneme sahip olan Sanglifehrin A ile Cyclophilin A/Ganoderiol-F arasındaki protein-ligand bağlanma etkileşiminin yapısal rehberli tasarımına yönelik bir protokol sunuyoruz. Ligand-reseptör kompleksinin kararlılığı moleküler dinamik simülasyonu kullanılarak değerlendirildi.

Yeni Siklofilin A Inhibitörleri ve Ganoderiol-F Türevlerinin Yapı Yönlendirmeli Tasarımı ve Geliştirilmesi: Bir Silico İçeri Yaklaşım

Protein tasarımı, amino asit dizilerinin inşasını ve fonksiyonel varyantlar oluşturmak için belirli motiflerin dahil edilmesini içerir. Bu yaklaşım, antibiyotiğe dirençli patojenlerle savaşmak için antimikrobiyal peptitlerin (AMP'ler) geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Bu makale, çeşitli biyoinformatik araçları kullanılarak protein yapımı için bir prosedür sunmaktadır.

Proteinlerin De Novo ve In Silico Tasarımı için I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, HADDOCK sunucusu ve HEX loria uygulaması

Aynı dizide karışık katyonik işlevselliğe sahip peptoidleri sentezlemek için bir protokol sunulmuştur (lizin ve arginin tipi monomerler). Bu bileşiklerin, kutanöz leishmaniasis'e neden olan protozoan parazitler olan Leishmania mexicana'ya karşı daha sonraki testleri de açıklanmaktadır.

Bunların Anti layişmanya Faaliyet karışık Lizin tipi / Arjinin-monomerleri ve Değerlendirilmesi peptoidler Sentezi için etkili bir yöntem

Yüksek saflıkta RNA izolasyonu üzerinde inhibitör etkileri olan büyük miktarlarda yağ, protein ve polifenol içeren bitki tohumlarından RNA izolasyonu için bir yöntem oluşturmayı başardık. Yöntemimiz, tohumlarda düşük seviyeli transkriptlere sahip genlerin ekspresyonunu izlemek için uygundur.

Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA&#39;nın izolasyonu için etkili bir yöntem

Öğrenin, Campylobacter jejuni Tlp3 kemoreseptörünün ligand bağlayıcı etki alanını inklüzyon cisimciklerinden refold ederek arıtma yöntemini. Bu teknik, fonksiyonel protein elde edilmesini sağlar.

Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi

Daha fazla video keşfet