Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, inklüzyon cisimciklerinden bir kemoreseptör ligand bağlanma alanını yeniden düzenlemek ve yapısal ve fonksiyonel çalışmalarda kullanılmak üzere saflaştırmaktır. Bir bakteriyel kemoreseptörün hangi sinyalleri gönderdiğini ve nasıl gönderdiğini belirlemek için, küçük molekül kütüphanelerine karşı tarama yapmak veya ligandlı ve ligandsız yapıyı belirlemek için izole edilmiş ligand bağlanma alanları kullanılabilir. E.coli'de hücre dışı ligand bağlanma alanının baskılanması sıklıkla inklüzyon cisimciklerinde birikme ile sonuçlanır.

Burada, inklüzyon cisimlerinden miligram miktarda fonksiyonel proteinin nasıl geri kazanılabileceğini gösteriyoruz. Başlamak için, mL ampisilin başına 50 mikrogram içeren 150 mL steril LB suyunu, hekzahistidin TIp3-LBD ekspresyonu için pET151 D-TOPO vektörü ile dönüştürülmüş BL21-CodonPlus RIPL hücreleri ile aşılayın. Kültürü gece boyunca 200 RPM ve 37 santigrat derecede inkübe edin.

800 mL steril LB suyu ve mL ampisilin başına 50 mikrogram içeren altı adet 2L Erlenmeyer şişesi hazırlayın. Her şişeyi 20 mL gece boyunca kültür ile aşılayın. Şişeleri 37 santigrat derecede inkübe edin ve OD200 600'ya ulaşana kadar 0.6 RPM'de sürekli çalkalayın.

Bu noktada, her şişeye 1 milimolar IPTG ekleyerek protein ekspresyonunu indükleyin. Şişeleri 37 santigrat derecede 200 RPM'de bir çalkalayıcıda dört saat daha inkübe etmeye devam edin. Hücreleri 15 dakika boyunca 5000 xg ve dört santigrat derecede santrifüjleme ile hasat edin.

Ardından, süpernatanı atın. Tüm hücre peletlerini 250 mL'lik bir behere aktarın ve 100 mL Tampon A ekleyin.Dondurulursa, hücrelerin tamamen çözülmesine izin verin ve ardından peleti yeniden süspanse edin. Aksi belirtilmedikçe numuneyi buz üzerinde tutun.

Daha sonra, hücreleri parçalamak ve genomik DNA'nın tamamen kesilmesini sağlamak için yeniden askıya alınan hücreleri üç kez yüksek basınçlı bir homojenizatörden geçirin. Ardından, lizatı 15 dakika boyunca 10.000 xg ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatantın bir mL'lik bir örneğini toplayın ve sonraki SDS-PAGE analizi için eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Ardından, süpernatantın geri kalanını atın ve peleti buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, inklüzyon cisimleri peletini 20 mL buz gibi soğuk Tampon B'de iyice yeniden süspanse edin. Bu, membran ve membran proteinlerinin çözünmesini kolaylaştırır. Yeniden süspansiyona yardımcı olmak için numuneyi bir ila iki dakika vorteksleyin.

Numuneyi santrifüjledikten sonra, önce tüpü bir ila iki dakika vorteksleme yaparak peleti 20 mL buz gibi soğuk Tampon B'de tekrar iyice yeniden süspanse edin. Peletin küçük parçalara ayrıldığından emin olun. Ardından, numuneyi yeniden süspanse etmek için yukarı ve aşağı pipetleyin.

Numuneyi daha önce olduğu gibi santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Süpernatan bulanık veya renkliyse, numuneyi tekrar santrifüjleyin ve yeniden süspanse etmek için ek buz gibi soğuk Tampon B kullanın. Tekrar peletlemeden önce süpernatan berrak ve renksiz olana kadar santrifüjleme ve yeniden süspansiyonu tekrarlayın.

Pelete 20 mL buz gibi soğuk Tampon C ekleyin ve tüpü bir ila iki dakika girdaplayarak yeniden süspanse edin. Daha sonra, numuneyi döndürdükten sonra, 25 mL buz gibi soğuk denatüre edici Tampon D ekleyin. Tüpü bir ila iki dakika boyunca veya pelet küçük parçalara ayrılana kadar girdaplayarak inklüzyon cisimcikleri peletini iyice yeniden süspanse edin. Süspansiyonu 30 ila 120 dakika boyunca 30 RPM ve 4 santigrat derecede eksenel dönüşle karıştırın.

Denatüre protein çözeltisini 30, 000 xg ve 30 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleme ile berraklaştırın. Sonra, süpernatanı buzun üzerine yerleştirin ve peleti atın. 500 RPM'de 250 mL Tampon E'yi karıştırırken, hekzahisadin TIp3-LBD içeren 60 miligram denatüre protein karışımı ekleyin.

Yeniden katlama karışımını 24 ila 48 saat boyunca 500 RPM'de sürekli karıştırarak dört santigrat derecede inkübe edin. Nihai protein konsantrasyonu mL başına 0.2 mg'dır. Metin protokolüne göre yedi L önceden soğutulmuş Tampon A ve diyaliz tüpü hazırladıktan sonra, diyaliz membranının bir ucunu kelepçelemek ve diyaliz karışımını tüpe aktarmak için diyaliz tüpü kapağını kullanın.

Ardından açık ucu sıkıştırın ve sızıntı olmadığından emin olun. Diyaliz tüpünü önceden soğutulmuş Tampon A ile bir diyaliz kovasına yerleştirin. Ardından, karıştırırken diyaliz tüpüne temas etmeyeceğinden emin olarak manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin. Numuneyi 500 RPM'de sürekli karıştırarak dört santigrat derecede diyalize edin ve tamponu 12 saatlik bir süre içinde en az dört kez değiştirin.

Son tampon değişiminden sonra, numuneyi gece boyunca diyalize bırakın. Ertesi sabah, diyaliz tüpünü kovadan çıkarın ve içindekileri 500 mL'lik bir behere aktarın. Aksi belirtilmedikçe protein çözeltisini buz üzerinde tutun.

Çökelmiş proteini çıkarmak için protein çözeltisini 0.43 mikron gözenek büyüklüğünde bir zardan 500 mL'lik bir cam şişeye süzün. Metin protokolüne göre bir şelatlama kolonunu yıkadıktan, şarj ettikten ve dengeledikten sonra, 25 mL 5 M sodyum klorür, 2.5 mL 1 M tris-HCl, pH 8.0 ve 2.5 mL 2 M İmidazol stok çözeltileri ekleyerek elde edilen yeniden katlanmış protein örneğini Tampon F bileşimine ayarlayın. Numuneyi dakikada 5 mL veya daha düşük bir hızda kolona yükleyin ve bağlanmamış proteinleri içeren akışı atın.

Ardından, spesifik olarak bağlanmamış proteinleri çıkarmak ve akışı atmak için sütunu 50 ila 100 mL Tampon F ile yıkayın. Hekzahisadin TIp3-LBD'yi 25 mL Tampon G ile elute edin. Ardından, proteini içeren akış fraksiyonlarını bir araya getirin. Tampon H ve diyaliz tüpünü metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, tüpteki hekzahisadin etiketli proteine hekzahisadin etiketli TEV proteaz ekleyin.

Bir TEV'den sekize kadar proteinin son molar oranını ekleyin. Kelepçeli diyaliz tüpünü önceden soğutulmuş dört L Tampon H'ye yerleştirin ve iki saat boyunca sürekli karıştırarak dört santigrat derecede inkübe edin. Ardından, tamponu değiştirin ve TEV aracılı bölünme reaksiyonunun tamamlanmasına izin vermek için gece boyunca diyalize devam edin.

Tampon I'e geçtikten, protein çözeltisini filtreledikten ve numuneyi tekrar ayarladıktan sonra, numuneyi hazırlanmış beş mL HiTrap şelatlama HP kolonuna yükleyin. Dakikada beş mL'lik bir akış hızında, etiketlenmemiş TIp3-LBD'yi içeren akışı toplayın. Bölünmüş protein üzerinde, bölünmüş hekzahistadin etiketi ve hekzahisadin TEV sütun tarafından tutulur.

Etiketlenmemiş proteinin akmasına ve elüatı toplamasına izin vermek için sütunu yıkamak için beş mL Tampon F kullanın. Daha sonra, bir boyut dışlama kolonunu dengeledikten ve protein numunesini metin protokolüne göre konsantre ettikten ve arıttıktan sonra, numuneyi önceden dengelenmiş 26/60 jel filtrasyon kolonuna yükleyin. Tampon A'yı dakikada dört mL'lik bir akış hızında uygulayın ve protein elüsyonu için UV izini izleyin.

TIp3-LBD, 210 ila 220 mL'lik bir tutma hacminde ortaya çıkar. Son olarak, kromatografiyi takiben, fraksiyonları bir araya getirin, ardından protein konsantrasyonunu ölçün ve SDS-PAGE'i gerçekleştirin. Bu videoda gösterilen protein izolasyon prosedürü, bir L bakteri kültürü başına 10 ila 20 mg saf etiketlenmemiş TIp3-LBD verdi.

Burada görüldüğü gibi, jel filtrasyon kolonundan ayrıştırılan protein, hesaplanan 29 kDa moleküler ağırlık ile 220 mL'lik bir tutma hacmine karşılık gelen tek, simetrik bir tepe noktasına sahiptir. Burada SDS-PAGE tarafından gösterildiği gibi, inklüzyon cisimleri, 31.8 kDa'lık amino asit dizisinden hesaplanan değere yakın olan, 28 kDa'lık görünür bir moleküler ağırlığa sahip ağırlıklı olarak hekzahisadin TIp3-LBD içeriyordu. Hekzahisadin etiketinin çıkarılması, afinite kromatografisi ve jel filtrasyon adımları, oldukça saf protein verdi.

CDSSTR kullanan CD spektroskopisi, hekzahisdidin TIp3-LBD'nin ikincil yapısının %31 alfa-sarmal ve %23 beta-yaprak içeriğinden oluştuğunu ortaya koydu. Bunlar aynı zamanda JPred 3 sunucusu kullanılarak yapılan dizi analizinden sırasıyla %37 ve %26 olan tahmin edilen değerlere de yakındı. Bu protokol baştan sona en az beş gün gerektirir ve gerekirse üç farklı aşamada duraklatılabilir.

Bu prosedürü denerken, inklüzyon cisimciklerinin denatüre edici tampon içindeki girdaplama veya yukarı ve aşağı pipetleme yoluyla tam ve eksiksiz bir şekilde yeniden süspansiyonunun, tüm bu gerçekleştirme için kritik olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, kemoreseptör TIp3'ün ligand bağlanma alanının nasıl yeniden düzenleneceğini ve saflaştırılacağını iyi anlamalısınız. Saflaştırılmış protein, ligandın bu reseptör için özgüllüğünü araştırmak için asitleri bağlamak için kullanılabilir.

Ek olarak, bu prosedürle elde edilen proteinin yüksek dereceli kristaller üretmek için kullanılabileceğini daha önce göstermiştik ve bu, ligand özgüllüğünün yapısal temelinin çalışmalarının yolunu açmıştı. Bu prosedür genellikle kristalize edilebilir ve çözünür bir formda diğer bakterilerden mg miktarlarda kemoreseptör üretimi için yararlı olabilir. Bu protokolü, kristalografik çalışmalar için bu tipteki diğer kemoreseptörlerin ligand bağlanma alanını yeniden düzenlemek ve saflaştırmak için orijinal veya hafifçe değiştirilmiş formunda kullandık.

Lütfen, her bir ayrı durumda, protokolün optimizasyonunun, örneğin, denatüre etme ve yeniden katlama tamponlarının bileşiminin ve inkübasyon sürelerinin muhtemelen gerekli olacağını unutmayın.