Name: Üç boyutlu görüntü oluşturma ve çözümleme-in Immunolabeled, açıklık insan plasental Villous damar ağları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Öğrenin, insan plasenta villus ağaç dokusunda damar ağlarını analiz etmek için tersinir doku temizleme, immünolabelleme ve üç boyutlu görüntüleme yöntemlerini. Bu teknik, fetal büyüme kısıtlaması ve erken doğum nedenlerini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser gelişme bozuklukları ve plasental Analytics LLC, New Rochelle, NY olan kişiler için New York eyalet Office tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol kuralları New York Devlet Enstitüsü temel araştırma için gelişimsel Engelli insan araştırma Etik Komitesi izler.
1. villous ağacı diseksiyon
<ol><li>Plasenta doku formalin kaldırıp bir kabında diseksiyon mikroskop sahnesinde yerini için buffed fosfat serum fizyolojik (PBS)14 ile sabit formalin durulayın. Neşter ve forseps iyi villous ağaçlar (beyaz ipliksi dallanma yapıları) bulmak için plasenta doku ayrı alay için kullanın. İ. ağaç (birkaç mm uzun) parçalarını dışarı incelemek ve dokuyu mikro-tüp içeren ~ 1 mL PBS aktarın.</li>
</ol>2. immünfloresan boyama
<ol><li>Bir pipet ile PBS kaldırın ve taze PBS ile değiştirin. Ara sıra dönen ile 10 dakika bekletin. Bir kez daha yineleyin. Not: Bu adım ve tüm diğer adımları birincil antikor kuluçka dışında oda sıcaklığında yapılır.</li>
	<li>Bir pipet kullanarak kaldırmak ve PBS PBS ile +0.1 yerine % Triton-X100 + % 2 keçi serum (PBS-T-GS) ikincil antikorların doku ve blok non-spesifik bağlama permeabilize için. 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>PBS-T-GS %2 keçi serum içeren PBS ile yerine, her iki fare monoklonal anti-CK7 ve tavşan anti-CK7.<ol>
<li>Doku gecede 4 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Kalan antikorlar ile ara sıra dönen 10 dakika için PBS-GS ile yıkayarak çıkarın.</li>
		<li>PBS-GS kaldırmak ve PBS-GS IgG birleştiğinde bir yeşil yayan ile her iki keçi Anti-fare içeren yerine (520 nm) fluorophore ve keçi Anti-tavşan IgG birleştiğinde bir kızılötesi yayan (652 nm) fluorophore.</li>
		<li>Antikorlar adım 2.1 yineleyerek kaldırın.</li>
		<li>Oda sıcaklığında immunolabeled doku karanlıkta saklamak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. açıklama doku
<ol><li>3 kez PBS ile örnekleri 10 dakikalık aralıklarla yıkamak.</li>
	<li>PBS bir pipet ile kaldırma ve % 50 etanol ile değiştirerek doku kurutmak (metanol de kullanılabilir). Kuluçkaya için 10 dk. eski yerine koymak ile taze % 50 etanol ve 10 dk. yinelemek için bu bir kez daha 3 incubations toplam için kuluçkaya. İncubations % 70 ile yineleyin. O zaman % 100 etanol ile eski yerine koymak ve 15 dakika boyunca kuluçkaya (metanol alternatif olarak kullanılabilir).</li>
	<li>Mikro-tüp içeren bir taze için doku ince uçlu Forseps ile transfer ~ 1 mL çözüm-1 4 h için.</li>
	<li>Bir taze mikro-tüp içeren çözüm-2 için doku ince uçlu Forseps ile transfer ~ 4 h. Not: karanlıkta depolandıklarında, ayirt en az 6 ay için oda sıcaklığında stabil.</li>
	<li>Takas kaybetti herhangi bir sulu çözüm (örneğin montaj orta) ile birlikte kullanmayın.</li>
</ol>4. montaj mikroskopi için
<ol><li>Doku yumuşak ve kolay deforme olduğu gibi bir coverslip ve bir standart cam slayt arasındaki doku bağlanmaz.</li>
	<li>Şekil 5' eB bakın ve aşağıdaki gibi Sykes-Moore odası dokusunda mount;<ol>
<li>İnce uçlu Forseps ile 25 mm yuvarlak coverslip odasında temel yerleştirin.</li>
		<li>İnce uçlu Forseps ile Lastik conta coverslip üste yerleştirin.</li>
		<li>Bir pipet ile bir damla (~ 40 µL) çözüm-2 coverslip ortasına yerleştirin.</li>
		<li>İnce uçlu Forseps ile bir parça doku çözüm-2 den coverslip ortasına düşüş aktarın.</li>
		<li>Conta üst kısmında ikinci bir coverslip bir yer.</li>
		<li>Kilitleme halka coverslips ve conta firma kadar sıkıştırma Bankası üst içine iş parçacığı. Not: aşırı değil sıkın için dikkatli olun ya da coverslip paramparça edecek.</li>
		<li>Bir 22'lik iğne temel ve conta ile bir bağlantı noktasına takın.</li>
		<li>3-mL şırınga ile doldurmak ~ 1,5 mL çözüm-2.</li>
		<li>25'lik iğne şırıngayı bağlayın.</li>
		<li>Şırınga iğne ters bağlantı noktasına ve conta ile ekleyin.</li>
		<li>Yavaşça çözüm-2and dolgu odası enjekte, odasında hava diğer 25'lik iğne havalandırma sağlamak.</li>
		<li>İğne ve şırınga çıkarın ve odası confocal mikroskop Sahne Alanı'nda bir büyük cam slayt üzerinde yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternatif olarak, özel wells PDMS silikon yaprak dışarı kesmek.<ol>
<li>Bir 25,4 x 25,4 mm2 parça PDMS sayfasından makasla kesme.</li>
		<li>Neşterle kesmek ~ 12,7 × 12,7 mm2 parça halinde de.</li>
		<li>Parça mikroskop slayt üzerine sıkıca basın.</li>
		<li>Kuyu Üst çözüm-2 ile doldurun.</li>
		<li>Doku parça mikro-tüp sizden iyi Center'a aktarın.</li>
		<li>Öyle ki coverslip alt çözüm-2 ile ıslak ince uçlu Forseps ile bir coverslip kuyu üstüne yerleştirin.</li>
		<li>Confocal mikroskop sahnede Sykes Moore odası derleme doku ile bağlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. confocal mikroskobu
<ol><li>Doku odasında 10 x amacı ile odak haline getirmek.</li>
	<li>Mikroskop sahne yukarı ve aşağı üst ve alt doku arasındaki mesafeyi ölçmek için odak düzlemi arasında hareket eder.</li>
	<li>Sahne alanı üst dokudan yukarıdan aşağıya doğru resimlerle kümesi içeren bir confocal resim dosyasını toplamak için 2.5 µm adımları hareket eder.</li>
</ol>6. açıklığın ters
<ol><li>Takas için bir mikro-tüp içeren > 20 x % 100 etanol hacmi doku aktararak ters. 1 h aralıkları ile % 70 etanol, sonra % 50 etanol ve son olarak PBS değiştirin. Karanlıkta 4 ° C'de depolayın. Not: Şimdi standart parafin yerleştirme, parça ve histolojik dokusu veya immün histochemical boyama işlemi.</li>
</ol>7. deconvolution
Not: aşağıdaki adımları için yazılım komutlar, sekmeler ve aşağı açılan menüleri italik.
<ol><li>Deconvolution yazılımını başlatın ve görüntü dosyasını açın.</li>
	<li>'Summary' penceresinde listelenen parametreleri girin.<ol>
<li>İçin 'serisinde girin Voksel x, y ve z boyutlu µm olarak.</li>
		<li>Her renk kanalı için aþaðý açýlan menüsünden immunostaining için kullanılan floresan boya seçin.</li>
		<li>İçin 'modalite ', lazer tarama Confocal aþaðý açýlan menüsünden seçin.</li>
		<li>İçin 'objektif Lens, 10 x aşağı açılan menüden seçin.</li>
		<li>İçin 'daldırma orta ', hava aþaðý açýlan menüsünden seçin.</li>
		<li>Tıklayın 'Uygula ' düğmesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>'Deconvolution' sekmesini tıklayın.</li>
	<li>Tıklayın '3D Deconvolution' damla-aşağı yemek listesi içinde.</li>
	<li>Buna '3D - Deconvolution' pencere sigorta ayarlar şunlardır: 1) adaptif PSF kör, 2) teorik PSF, 3) kullanımı (Adaptive PSF varsayılan, 10 yinelemeden, orta gürültü), 4) Bankası adı.</li>
	<li>Tıklayın 'Yeşil onay düğmesine ' programını başlatmak için.</li>
	<li>Ne zaman tamamlanmak, programı yeniden başlatmayı 7.3-7.6 adımları yineleyin. Ne zaman tamamlanmak için üçüncü ve son kez yeniden başlatın.</li>
	<li>İçinde 'Veri Yöneticisi ' pencere, tıkırtı üstünde eğe ile öneki "10-10 - 10-".</li>
	<li>Tıklayın 'dosyası ' sekme, o zaman tıkırtı üstünde 'Farklı Kaydet.</li>
	<li>'A kurtarmaks' penceresinde seçin '8 bitlik işaretsiz tamsayı ' dan 'veri türü ' damla-aşağı yemek listesi ve tıkırtı Kaydet.</li>
</ol>8. görüntü işleme
<ol><li>Fiji yazılımını başlatın.<ol>
<li>Tıklayın 'dosyası ', tıkırtı üstünde 'Açık ' ve Deconvolved görüntü dosyasını seçin ve tıklayın 'Açık ' düğmesini 'Açık ' pencere.</li>
		<li>Tıklayın 'görüntü/renk/Split kanalları ve convert üç renkli görüntü dosya tek bir renk içeren üç yeni dosyaları. İmmunolabeled villous kılcal görüntü kümesi içerir kırmızı görüntü dosyasını kaydedin. Yeşil ve mavi görüntü dosyaları silin.</li>
		<li>Kırmızı görüntü dosyası ile arka plan Floresans çıkarma: 'işlem/çıkarma arka plan '.</li>
		<li>Damla-aşağı yemek listesi 10 piksel Rolling ball yarıçapı ayarlayın.</li>
		<li>4 menü seçeneklerini işaretlemeyin ve tıklatın 'ı '.</li>
		<li>Tıkırtı 'Evet işlem yığın menüsünde.</li>
		<li>Doğal doku floresan (autofluorescence) açarak kaldırmak 'Image/Adjust/Parlaklık-Kontrast ' menü ve minimum, maksimum, parlaklık ve kontrast ayarlarını yaparak. Kapiller ayirt hiçbirini kaldırmak değil dikkatli olun.</li>
		<li>Alakasız Floresans açarak kalan en aza indirmek 'Image/Adjust/eşik ' menü ve öyle ki kılcal ayirt vurgulanır kaydırıcıları ayarlayarak. Kontrol 'koyu arka plan ' kutu ve tıkırtı üstünde 'Uygula '. Üzerinde 'için ikili açılan dönüştürmek ' menüsü onay 'siyah arka plan ' kutu ve tıkırtı üstünde 'ı '. Analizleri aşağıdaki için siyah ve beyaz (ikili) görüntü dosyası kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. analiz
<ol><li>Nesne sayma ve iskeletleşmiş.<ol>
<li>8.1.8. adımda oluşturduğunuz ikili görüntü dosyasını seçin.</li>
		<li>Tıklayın 'analiz/3D OC seçenekleri ve yalnızca onay 'Birim ' ve 'mağaza sonuç...' damla-aşağı yemek listesi kutuları. Sigorta 'Gösteri numaraları' kutusu seçili değildir. Tıklayın 'ı ' düğmesini.
</li>
		<li>CLIck 'analiz/3D obje Counter'. Açılan menüde ayarla 'boyut filtresi: dk. ' 5000'e. Bunu garantilemek 'kenarları nesnelerde dışlamak kutusudur denetlenmeyen. Şuna bir 'nesnesİstatistikler ve 'Özeti ' kutuları kontrol edilir. Tıklayın 'ı ' düğmesini. Not: Bu dosya boyutu ve bilgisayarın yapılandırmasına bağlı olarak birkaç dakika sürebilir.</li>
		<li>İstatistik tablo ve nesneleri harita dosyası kaydedin.</li>
		<li>Nesneleri harita dosyasını seçin. Tıklayın 'eklentileri/iskelet/Skeletonize 2D-3D' ikili dosyasında kılcal ağ skeletonize için. Tıklayın 'Dosya/Kaydet olarak. Seçin 'TIFF...' damla-aşağı yemek listesi içinde. TIFF pencere farklı kaydet "içmek" nesne harita dosya adı ekleme ve tıkırtı üstünde 'Kaydet ' düğmesini.
</li>
		<li>Tıklayın 'analiz/iskelet/analiz iskelet 2D-3D'. Damla-aşağı yemek listesi varsayılan ayarları kabul edin ve tıkırtı üstünde 'ı ' düğmesini. Şube 'bilgi' tabloyu kaydedin 'sonuçları tablo ve iki çıktı dosyaları (içmek-nesneler-etiketli - iskelet ve takip edilen iskelet).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+features+of+placental+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Biological features of placental programming.</a> Placenta. 48, Suppl 1 47-53 (2016).</li>
<li>Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+weights+smaller+or+larger+than+the+placenta+predict+BMI+and+blood+pressure+at+age+7+years%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dev+Orig+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years.</a> J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).</li>
<li>Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+Origins+of+Chronic+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Placental Origins of Chronic Disease.</a> Physiol Rev. 96 (4), 1509-1565 (2016).</li>
<li>Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective+study+of+villous+capillary+lesions+in+complicated+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pregnancy%22%5BJournal%5D)">A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies.</a> J Pregnancy. 2014, 193925(2014).</li>
<li>Jones, C. J. P., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+possible+function+for+placental+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">A new possible function for placental pericytes.</a> Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).</li>
<li>Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histomorphometric+study+of+placental+villi+vascular+volume+in+toxemia+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes.</a> Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).</li>
<li>Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+transcriptional+activity+in+the+syncytiotrophoblast+of+the+human+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Evidence for transcriptional activity in the syncytiotrophoblast of the human placenta.</a> Placenta. 30 (4), 329-334 (2009).</li>
<li>Jirkovská, M., Kubínová, L., Janáček, J., Kaláb, J. <a target="_blank" href="https://www.ias-iss.org/ojs/IAS/article/view/820">3-D study of vessels in peripheral placental villi.</a> Image Anal Stereol. 26 (3), 165-168 (2011).</li>
<li>Pearce, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-Based+Modeling+of+Blood+Flow+and+Oxygen+Transfer+in+Feto-Placental+Capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Image-Based Modeling of Blood Flow and Oxygen Transfer in Feto-Placental Capillaries.</a> PLOS ONE. 11 (10), 0165369(2016).</li>
<li>Plitman Mayo, R., Olsthoorn, J., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+modeling+of+the+structure-function+relationship+in+human+placental+terminal+villi%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi.</a> J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).</li>
<li>Mayhew, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stereological+perspective+on+placental+morphology+in+normal+and+complicated+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies.</a> J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).</li>
<li>Teasdale, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gestational+changes+in+the+functional+structure+of+the+human+placenta+in+relation+to+fetal+growth%3A+a+morphometric+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study.</a> Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(15)00837-5">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque+formation+and+isolation+of+pure+lines+with+poliomyelitis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses.</a> J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).</li>
<li>Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+oxygen+transport+in+human+placental+terminal+villi%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling oxygen transport in human placental terminal villi.</a> J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).</li>
<li>Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+modeling+of+human+placental+terminal+villi%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional modeling of human placental terminal villi.</a> Placenta. 43, 54-60 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Kurumsal değerlendirme Komitesi electively sonlanmış gebeliklerin üzerinden formalin fiksasyon için plasenta villous doku topluluğu onayladı. Yordamlar gerçekleştirilmesi için önce tıbbi kayıt kısa bir tekrarıdır maternal yaş, eşlik, kaydetti ve herhangi bir (örneğin, hipertansiyon, şeker hastalığı ve lupus) altta yatan tıbbi ya da cenin (yapısal veya Kromozom anomalileri, yokluğu doğruladı anormal büyüme) gerçekleştirildi. Veri sayfası ve herhangi bir toplanan numuneler sadece bir çalışma kimliği ile etiketli B...

Gelişen plasenta ve onun patolojiler anlayışımızı büyük ölçüde bitişik villus ve histolojik kesitler elde bulunan kılcal damarlar arasındaki uzamsal ilişkileri anlaşılmaktadır için sınırlı. Bu çalışmada, biz üç boyutlu (3D) kaplamalar kılcal ağ özellikleri (dallanma, Kesintisizlikörneğin ) analizleri için uygun insan plasental kılcal damar ağları oluşturmak için bir araç geliştirerek bu sorunu ele sahip. Bunu yapmak için iki ticari doku Temizleme ürünleri, Visikol-1 ve Visikol-2 (aşağıda çözüm-1 ve çözüm-2 anılacaktır) ile immünfloresan boyama birleştirdik.
İnsan plasenta kan damarlarının anne intervillous kan ve gelişmekte olan fetus arasında arayüz bulunan büyük bir kompleks olduğunu. Dışarı onun ekleme koryonik plaka içine uzanan, göbek kordonu atar ve toplar damarlardaki ayrıntılı damar ağıyla koryonik yüzey kapsayacak şekilde ramify bir ağ içine dalları. Amaçları sonra aşağı iç ya da nerede birçok daha dallanma nesiller geçmesi ve bitir, terminal villus ve içerdiği kapiller ağlarına gazlar, besin, Satım sitesi plasental disk derinliği içine nüfuz ve metabolik Fetal-maternal kan kaybı.
Plasental kapiller ağ geliştirme sırasında hakaret fetus, yeni doğan bebek ve acil yetişkin 1,2,3sağlığı için kalıcı sonuçlar doğurabilir. İçinde görüş-in gebelik ile ilgili patolojiler düşük, intrauterin büyüme kısıtlama, gibi ön eklampsi ve maternal diyabet 4,5,6 orada ölçüm yöntemleri geliştirmek üzerine yerleştirilen bir yüksek değerdir ve plasental villous kılcal damar ağları karakterizasyonu. Büyük bir barikat plasental damar ağları geniş ölçekli bir kapsayacak var. Yüzey damar ağları olarak 4-5 mm çapında büyük olabilir. Terminal villous kılcal damar çapı 10 -20 µm sırasına vardır; Plasenta kan damarlarının 7300 km üzerinde içerir. Şu anda, bu büyük gemi ölçek-ebilmek esir alma birkaç kolay ve hızlı teknikleri vardır. Bugüne kadar az sayıda villus mikroskobu tarafından işlenebilir. Örneğin, Jirkovska ve ark. plasental villus dönem confocal mikroskobu 120 µm kalınlığında bölümlerden elde edilen 1 µm aralıklarla seri optik bölümleri birleştirme duruldu; veri yokken okudu örnekleri ne de istatistik sayısı 8temin edilmiştir. Kılcal damar yapıları tespit edilmiştir ve çizilmiş, görüntü analizi için ihraç tracings ile kontür villus ve kılcal damarlar. Yazarlar ve bulguların "büyüyen villous damar ağı için" etkileri komisyonda görüşürken, zaman sadece "terimi" (36 + hafta gebelik yaşı) doku eğitimi böyle sonuçlara sorunlu. Benzer şekilde, Mayo et birl. ve Pearce ve ark. dayanıyordu kan akışı ve oksijen transferi, onların simülasyonları için aynı yaşta dokular ama onların analizleri sadece birkaç terim, terminal villus 9,10 sınırlı idi . Stereology da villous damarlarının yapısını çalışma odasına uygulanmıştır. Ama yine, odak genellikle daha sonraki gebelikler ile bir veya daha fazla gebelik komplikasyonları 11,12liveborn bebekler teslim olmuştur.
Yakın zamana kadar confocal mikroskobu emme uyarma ve floresan emisyon nedeniyle örten doku 13 tarafından 100-200 µm derinliklerinde doku görüntüleme sınırlıydı. Geri dönüşümsüz hiperhidrasyon aracılığıyla hücresel Morfoloji zarar olsa takas doku ve 3D Histoloji yaygın olarak literatürde tarif edilmiştir ve orada birçok takas doku için çok sayıda yöntem genel olarak, dokular ile kullanım için uygun olmayan proteinler veya lipidler kaldırılması. Bu nedenle, bu sonuçlar doku kendisi ve temizleme işlemi bizim doku karşı geleneksel Histoloji doğrulayamıyor tersinir bir tekniktir, ancak işleme gelen eserler göstergesi olduğunu doğrulamak mümkün değil. Doku takas genellikle üç ana yaklaşımdan birini içerir: 1) nedeniyle sürekli mercek neden toplu ışık saçılma kaldıran batma RI eşleşen çözümlerinde tarafından Tekdüzen kırılma indisini (RI) doku bileşenlerinin eşleştirme dalgalanma düşük RI (sitozol) ve yüksek RI (protein/lipidler) bileşenlerinin; 2) hidrojel gömme ve lipid bileşenleri kaldırmak için Elektroforez/Difüzyon kullanmak yoluyla lipid bileşenleri kaldırma; 3) artan penetrasyon çözücüler RI 13tekdüzelik teşvik etmek için izin vermek için protein yapısının genişleme/denatürasyon. Bu yaklaşımlar doku şeffaf render ve biyolojik 3D temsilleri için oluşturulmasına izin ver, bu görüntüleri doku özelliklerini gösterge olup olmadığını belirlemek zor olduğu gibi bu 3D temsilcilikleri şüpheli klinik değeri iken veya takas işlemi doku. Bizim doku takas geri dönüşümlü olduğundan Öte yandan, standart histolojik ve/veya immünhistokimya değişiklikler klinik olarak anlamlı olup aynı doku uygulanabilir.
Bu çalışmada bir analiz toplam 23 klinik olarak normal ve electively sonlanmış gebeliklerin 9-23 tamamlanan haftalık gebelik ve iki tam dönemlik normal teslimatlar arasında elde edilen 47 distal villous örnekleri sunar. Ayirt etiketleme Trofoblast ve endothelia villous damar ağları ve onların karmaşıklığı değişiklikler bir nicel ve otomatik analiz sağladı.
Bu protokol ile izole ve terminal villus ve kapiller ağlarına mümkün değil bir ölçekte daha önce analiz etti. Villous ve kapiller ağ geliştirme için gebelik uygulandığında bu yaklaşım sağlıklı bir çocuk doğum için temelidir bu özellikleri tanımlar. Karmaşık gebelik çalışmaları için uygulandığında, Ayrıca zaman ve plasental patolojileri villous ağaçlar ve onlar kılıf kılcal damar ağları değiştirmek ve bunlar fetal iyilik üzerinde vurmak nasıl açıklığa kavuşacaktır.

<table><tbody><tr><td>Sulu fosfat tamponunda %10 Formaldehit çözeltisi (w/h)</td><td>Macron İnce Kimyasallar</td><td>H-121-08</td><td>Genel fiksasyon ajanı, kullanıma hazır formül, buharlar toksik olduğundan dikkatli kullanın</td></tr><tr><td>Neşter bıçakları</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-916-5B No. 11</td><td></td></tr><tr><td>Neşter</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-913-5</td><td></td></tr><tr><td>İnce forseps</td><td>Elektron Mikroskobu Hizmetleri</td><td>78354-119</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Tüp (1.7 mL)</td><td>PGC Scientifics</td><td>505-201</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Pipet</td><td>VWR</td><td>52947-948</td><td>tek kullanımlık, 3ml transfer pipeti</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Boehriner Mannheim</td><td>789 704</td><td>Stoktan %0,1'e seyreltin</td></tr><tr><td>Keçi Serumu</td><td>Gibco</td><td>16210-064</td><td> PBS çözeltisinde% 2</td></tr><tr><td>Fare monoklonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Klon OV-TL 12/30)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>MS-1352-RQ</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan Anti-CD31 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>yeşil yayan (520 nm) florokrom ve nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11017</td><td>Alexa-Fluor 488</td></tr><tr><td>kızılötesi yayan (652 nm) florokrom</td><td>Invitrogen</td><td>A21072</td><td>Alexa Fluor 633</td></tr><tr><td>Etanol alkol 200 kanıt</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>Gerektiği gibi PBS kullanarak daha düşük konsantrasyonlara seyreltin</td></tr><tr><td>Çözüm-1</td><td>Visikol Inc.</td><td></td><td>Visikol Histo-1</td></tr><tr><td>Solüsyon-2</td><td>Visikol A.Ş.</td><td></td><td>Visikol Histo-2</td></tr><tr><td>Skyes-Moore odaları</td><td>BellCo Cam A.Ş.</td><td>P / N 1943-1111</td><td></td></tr><tr><td>25 gauge iğne</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-826AA</td><td>BD Hassas Kayma 3</td></tr><tr><td>mL şırınga</td> gerektirir <td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-823-40</td><td>BD tek kullanımlık şırınga</td></tr><tr><td>PDMS silikon levhalar</td><td>McMaster-Carr</td><td>P / N 578T31</td><td></td></tr><tr><td>konfokal mikroskop</td><td>Nikon Inc.</td><td></td><td>Nikon C1 Konfokal Mikroskop</td></tr><tr><td>Evrişim Çözme yazılımı</td><td>Medya Sibernetik</td><td></td><td>AutoQuant X22</td></tr><tr><td>Fiji görüntü işleme yazılımı</td><td></td><td></td><td>ücretsiz, Açık kaynak kodlu ve https://fiji.sc</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Leica Biosystems</td><td>adresinde</td> bulunan yazılım 3801570 <td>SelecTech H& Bileşen 1 E boyama sistemi</td></tr><tr><td>Alkolik Eosin</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801615</td><td>SelecTech H& Bileşen 2 E boyama sistemi</td></tr><tr><td>Blue Buffer</td><td>Leica Biosystems</td><td>3802918</td><td>SelecTech H& Bileşen 3 E boyama sistemi</td></tr><tr><td>Aqua Define MCX</td><td>Leica Biosystems</td><td>3803598</td><td>SelecTech H& Bileşen 4 E boyama sistemi</td></tr><tr><td>İmmünohistokimya tespit sistemi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TL-125-QHD</td><td>UltraVision Quanto Tespit Sistemi HRP DAB</td></tr></tbody></table>

Üç boyutlu görüntü oluşturma ve çözümleme-in immunolabeled, açıklık insan plasental villous damar ağları

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Anne intervillous kan ve insan plasenta parankimi çoğunu yapar büyük villous kılcal ağ arabiriminin, anne ve fetüs arasındaki besin ve gaz değişimi gerçekleşir. Distal villous kılcal damarları dışarı--dan göbek kordonu uzanan dallanma birkaç kuşak sonra fetal kan akımı terminus ağıdır. Bu ağ bir bitişik hücresel kılıf, fetal kan karıştırma engeller sinsisyal Trofoblast bariyer tabakası ve içinde sürekli boğulmuş olduğunu maternal kan var. Maternal diyabet, hipertansiyon ve obezite, gibi bozukluklar meydana plasental kılcal ağ bütünlüğü için hakaret fetus, çocuk ve yetişkin için bu mevcut ciddi sağlık riskleri doğurabilir. Bu hakaret yapısal etkileri daha iyi tanımlamak için bir protokol kılcal ağ yapısı onda bir topolojik özellikleri tam karmaşıklığı içinde araştırmak için 1-2 mm3 sırasına yakalar Bu çalışma için geliştirilmiştir. Terminal villus kümeleri plasenta üzerinden bunu yapmak için disseke ve Trofoblast katman ve kapiller endothelia immunolabeled vardır. Bu örnekler o zaman confocal görüntü yığınları z-~ 1 mm derinliklerinde elde etmek olanaklı kılan süreci temizleyerek yeni bir doku ile açıklık. Bu yığınlar üç boyutlu render sonra işlenir ve bu yaklaşım için uygunluğunun doğrulanmasını birim, kılcal damar dalları ve kapiller şube bitiş noktaları, sayısı gibi temel kapiller ağ tedbirler oluşturmak için analiz kapiller ağ karakterizasyonu.

İnsan 8 hafta gebelik yaşı vadeli teslim için plasenta içinde terminal villus kümeler halinde kılcal oluşturulan 3D render bireysel kümeleri sayılır ve ağ analizi için Iskeletlenmiş. Fonksiyonel plasenta (şekil 1A) yüzey gemileri nerede onlar plasenta parankimi (şekil 1Bve genişlemiş içinde 1 C) nüfuz bir uzantısı olan villus ağaçlar birimleridir. Bir disseke ağacı (Figur...

Bu çalışmada tersinir doku takas, immunostaining, 3D işleme ve analiz insan plasenta villus örneklerinde sırasına 1-2 mm3damar ağları için bir protokol sunar.

Üç boyutlu görüntü oluşturma ve çözümleme-in Immunolabeled, açıklık insan plasental Villous damar ağları

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Bu prosedürün genel amacı, içerdikleri vasküler ağların analizi için uygun olan plasental villöz ağaç parçalarının üç boyutlu görüntülerini oluşturmaktır. Bu yöntem, bir çocuğun büyümesinin neden kısıtlı olabileceği veya erken doğuma yol açan stresin ne kadar şiddetli olabileceği ve stresin ne kadar şiddetli olabileceği gibi alanımızdaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Prosedürümüzün ana avantajı, artık plasental villöz ağaç dokusunu immüno-etiketleme ve daha sonra vasküler ağlarını görselleştirme ve bu görselleştirmeleri bu vasküler ağları karakterize etmek ve analiz etmek için kullanma konumunda olmamızdır.Bu tekniğin etkileri birçok tanı ve tedaviye yayılabilir, çünkü çoğu yaşam bilimi iki boyutlu histolojik karakterizasyona dayanır. Prosedürü göstermek, plasenta dokusunun immüno-etiketlemesini ve temizlenmesini gerçekleştirecek olan Bayan Valerie Schwenk olacak ve daha sonra plasenta dokusunun diseksiyonunu yapacak ve aynı zamanda dokunun ters temizliğini yapacak olan Bay Phillip Necaise olacaktır. Villöz ağacın diseksiyonuna hazırlanmak için, önce resmi ve sabit plasental dokuyu fosfat tamponlu salin ile durulayın.Daha sonra bir diseksiyon mikroskobu aşamasında

three-dimensional-rendering-analysis-immunolabeled-clarified-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Ikizden ikize transfüzyon sendromu ve perinatal tıp ikiz anemi polisitemia dizisi iki potansiyel olarak yıkıcı sorunlar. Her iki bozukluk da sadece monokoryonik ikizlerde ve plasental vasküler anastomozlar yoluyla dengesiz kan akımı sonucu oluşur. Doğumdan sonra plasenta damarlarının renkli boya enjeksiyon kullanılarak vasküler anastomozlar varlığı doğru değerlendirmek için basit bir protokol sağlar.

Renkli Boya kullanarak Monokoryonik Plasenta vasküler anastomozlar doğru ve basit Değerlendirme

Bu video, ex vivo koşullarda primer insan plasental villöz ve yaprak döken organ kültürlerinin oluşumunu göstermektedir. Bu modeller, insan maternal-fetal arayüzünde patogenezi incelemek için çok uygundur.

İnsan Maternal-Fetal Arayüzünün Ex Vivo Modelleri Olarak Villöz ve Desidual Organ Kültürlerinin Kurulması

Bu protokol, farelerde hamilelik sırasında maternal vaskülatürdeki değişiklikleri değerlendirmek için bir tekniği tanımlar. Stereolojik yöntemler kullanılarak, desidual spiral arterlerin yeniden şekillenmesi kantitatif olarak değerlendirildi ve sonuçlar immünohistokimya kullanılarak kalitatif olarak doğrulandı.

Fare Uterus içinde Gebelikte maternal Vasküler Yaptırma Değerlendirilmesi

Birincil insan plasental (villöz) ve plasental organ kültürleri oluşturmak için basit bir yöntem tarif edilmektedir. Villus ve desidual organ kültürleri, insan maternal-fetal arayüzünde patogenezinde eğitim için çok değerli araçlardır. Fakültatif hücre içi bakteri Listeria monocytogenes ile enfeksiyon gösterilmiştir.

İnsan Plasental ve Desidual Organ Kültürleri Maternal-Fetal Arayüz de Enfeksiyonlar Eğitim için

Bu dönemde in vivo insan plasental fizyoloji çalışmak için ayrıntılı bir yöntem sunulmaktadır. Yöntem, plasentanın maternal ve fetal taraflarındaki gelen ve giden damarlardan alınan kan örneklerini, hacimsel kan akışı ve plasental doku örneklemesi ile ilgili ultrason ölçümleri ile birleştirir.

İnsan vücudunun fizyolojisini bütünleştiren 4 damarlı Örnekleme Yaklaşımı<emIn vivo</em

Burada olduğu gibi fare yumurtalıklarda bir uyum pasif NETLİK ve 3D yeniden yapılanma yöntemi yumurtalık damarlara ve foliküler kılcal görselleştirme için mevcut.

Pasif AÇIKLIĞI temizlenmiş Mouse ovarium vasküler mimarisinin üç boyutlu yeniden yapılandırma

İndüklenen pluripotent kök hücrelerinden (IPSC-EPs) elde edilen endotel progenatörler, kardiyovasküler hastalık tedavilerinin devrimleştirilmesi ve daha sadık kardiyovasküler hastalık modellerinin oluşturulmasını sağlamak için potansiyele sahiptir. Burada, üç boyutlu (3D) kollajen mikroortamlarda IPSC-EPs kapsülleme ve bu hücrelerin vasculogenik potansiyelinin nicel Analizi açıklanmıştır.

Bir In vitro 3D model ve hesaplamalı boru hattı PSC-türetilen endotel progenitors Vazculogenik potansiyelini ölçmek için

İşte sabit akış koşulları altında plasental eksplantların kültürlenmesi için bir protokol. Bu yaklaşım, dinamik fizyolojik ortamların replikasyonunu sağlayarak geleneksel statik villöz kültür sistemlerini geliştirir.

Ex Vivo (Canlı Canlı) Plasental Eksplant Akış Kültürü - Utero'daki Dinamik Koşulları Taklit Etmek

Retinal vasküler sistemdeki perisitler, retroorbital floresan domates lektin enjeksiyonu sonrası trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü β ile immünofloresan boyama ile incelendi. Etiketli retina, doku temizleme yöntemi ile daha fazla tedavi edildi ve retina vaskülatürünü çevreleyen perisitlerin üç boyutlu görünümlerini konfokal mikroskop altında görselleştirmek için tamamen monte edildi.

Farelerde Retinal Vasküler Perisitlerin İmmün Boyama ile 3D Görüntülenmesi 

Bu protokol, viral enfeksiyonların incelenmesi için hava-sıvı arayüzünde kültürlenen insan plasenta dokusu eksplantlarının hazırlanmasını açıklar.

Ex vivo Anne-Fetal Arayüzü üzerinden viral iletimin incelenmesi için insan plasenta eksplantlarının kültürü

Bu protokol, insan termi plasentalarının decidua bazalis ve koriyonik membranından primer HLA-G+ ekstravillous trofoblastlarının (EVT) arındırılması, karakterizasyonu ve kültürünü sağlar. Birincil EVT kültürleri 96 saat boyunca canlılık korur; bu da örnek eşleştirilmiş anne bağışıklık hücreleriyle birlikte kültür yapılmasına ve ardından etkileşimlerinin akış sitometrik ve moleküler analizine olanak tanır.

İnsan termi plasenta dokularından HLA-G+ ekstravillous trofoblastların fenotipleme ve fonksiyonel analiz için arındırılması

Öğrenin, insan plasenta villus ağaç dokusunda damar ağlarını analiz etmek için tersinir doku temizleme, immünolabelleme ve üç boyutlu görüntüleme yöntemlerini. Bu teknik, fetal büyüme kısıtlaması ve erken doğum nedenlerini anlamaya yardımcı olur.

Üç boyutlu görüntü oluşturma ve çözümleme-in Immunolabeled, açıklık insan plasental Villous damar ağları

Daha fazla video keşfet