Üç boyutlu görüntü oluşturma ve çözümleme-in Immunolabeled, açıklık insan plasental Villous damar ağları
March 29th, 2018
Bu çalışmada tersinir doku takas, immunostaining, 3D işleme ve analiz insan plasenta villus örneklerinde sırasına 1-2 mm3damar ağları için bir protokol sunar.
Bu prosedürün genel amacı, içerdikleri vasküler ağların analizi için uygun olan plasental villöz ağaç parçalarının üç boyutlu görüntülerini oluşturmaktır. Bu yöntem, bir çocuğun büyümesinin neden kısıtlı olabileceği veya erken doğuma yol açan stresin ne kadar şiddetli olabileceği ve stresin ne kadar şiddetli olabileceği gibi alanımızdaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Prosedürümüzün ana avantajı, artık plasental villöz ağaç dokusunu immüno-etiketleme ve daha sonra vasküler ağlarını görselleştirme ve bu görselleştirmeleri bu vasküler ağları karakterize etmek ve analiz etmek için kullanma konumunda olmamızdır.
Bu tekniğin etkileri birçok tanı ve tedaviye yayılabilir, çünkü çoğu yaşam bilimi iki boyutlu histolojik karakterizasyona dayanır. Prosedürü göstermek, plasenta dokusunun immüno-etiketlemesini ve temizlenmesini gerçekleştirecek olan Bayan Valerie Schwenk olacak ve daha sonra plasenta dokusunun diseksiyonunu yapacak ve aynı zamanda dokunun ters temizliğini yapacak olan Bay Phillip Necaise olacaktır. Villöz ağacın diseksiyonuna hazırlanmak için, önce resmi ve sabit plasental dokuyu fosfat tamponlu salin ile durulayın.
Daha sonra bir diseksiyon mikroskobu aşamasında bir petri kabına yerleştirin. Villöz ağacını bulmak için plasenta dokusunu parçalamak için neşter ve ince forseps kullanın. Daha sonra, villöz ağacının parçalarını yaklaşık beş milimetre uzunluğunda inceleyin ve bir mililitre fosfat tamponlu salin içeren bir mikrotüpe aktarın.
Fosfat tamponlu tuzlu suyu yenisiyle değiştirin ve ara sıra dönerek 10 dakika bekleyin. Daha sonra, dokuyu geçirgen hale getirmek ve ikincil antikorların spesifik olmayan bağlanmasını bloke etmek için fosfat tamponlu salini geçirgenleştirici tampon ile değiştirin. Ardından 30 dakika inkübe edin.
Daha sonra, geçirgenleştirici tamponu, fare monoklonal anti CD31 ve tavşan anti CK7 ile yüzde iki keçi serumu içeren fosfat tamponlu salin ile değiştirin. Dokuyu gece boyunca dört santigrat derecede bırakın. Ertesi gün, kalan antikorları yüzde iki keçi serumu ile fosfat tamponlu salin ile ek yıkamalarla çıkarın.
Daha sonra, fosfat tamponlu salini yüzde iki keçi serumu ile çıkarın ve yeşil bir florofor ile birleştirilmiş keçi anti-fare immünoglobulini G ve bir kızılötesi florofor ile birleştirilmiş keçi anti-tavşan immünoglobulini G ile takviye edilmiş aynı tamponu ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Ardından, mendili PBS-GS ile bir kez yıkayın ve etiketli mendili temizlenene kadar karanlıkta oda sıcaklığında saklayın.
Numuneleri PBS ile 10 dakikalık aralıklarla üç kez yıkayın. Dokuyu kurutmak için, fosfat tamponlu salini çıkarın ve dokuya% 50 etanol ekleyin ve 10 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, atın ve ardından 10 dakikalık aralıklarla %70 etanol ile üç kez yıkayın, ardından 15 dakikalık aralıklarla %100 etanol ile üç yıkama yapın.
Daha sonra, dokuyu dört saat boyunca bir mililitre çözelti ile doldurulmuş bir mikrotüpe aktarmak için ince uçlu forseps kullanın. Dört saat sonra, dokuyu ikinci çözelti ile doldurulmuş bir mikrotüpe aktarın ve dört saat daha inkübe edin. Dokuyu bir Sykes-Moore Odasına monte etmek için, oda tabanına 25 milimetrelik yuvarlak bir kapak kızağı yerleştirmek için ince uçlu forseps kullanın.
Yine, kapak kızağının tabanına kauçuk bir conta yerleştirmek için ince uçlu forsepsleri kullanın. İkinci solüsyona batırılmış dokuyu çıkarın ve kapak kaymasının ortasına yerleştirin. Daha sonra, doku üzerine yaklaşık 40 mikrolitrelik bir damla çözelti ekleyin.
Ardından, ikinci bir kapak fişi alın ve contanın üzerine yerleştirin. Ardından, tabanın üst kısmına bir kilitleme halkası geçirerek kapak kızağını ve contayı sıkıca sıkıştırın. Ardından, contadan 25 gauge bir iğneyi tabandaki bağlantı noktasına sokun.
Daha sonra, üç mililitrelik bir şırıngayı bir nokta beş mililitre çözelti iki ile doldurun. Ardından, şırıngaya 25 gauge bir iğne takın ve iğneyi contadan karşı porta yerleştirin. Ardından, hazneye ikinci solüsyonu enjekte etmeye başlayın ve haznenin içindeki havanın diğer 25 gauge iğneden dışarı atıldığını kontrol edin.
Hazne dolduğunda, iğneyi ve şırıngayı çıkarın ve Sykes-Moore hazne tutucusunu konfokal mikroskop aşamasına yerleştirin. Odaya yerleştirilen dokuyu odaklamak için 10X'lik bir objektif kullanın. Ardından, sahne için bir referans noktası belirleyin ve dokunun üst ve alt kısımlarını tanımlamak ve ayarlamak için mikroskop aşamasını odak düzlemi boyunca yukarı ve aşağı hareket ettirin.
Adım boyutunu iki nokta beş mikrometre olarak ayarlayın ve dokunun yukarıdan aşağıya bir dizi görüntüsünü içeren konfokal bir görüntü dosyası toplayın. Daha sonra, temizlemeyi tersine çevirmek için dokuyu hacmin 20 katından fazla %100 etanol içeren bir mikrotüpe aktarın. Daha sonra, her bir saatlik aralıktan sonra, 70 ile değiştirin ve ardından% 50 etanol ve son olarak fosfat tamponlu tuzlu su ile değiştirin.
Gömülene kadar karanlıkta dört santigrat derecede saklayın. Burada, plasental vasküler ağı göstermek için, bir insan plasentasının hem mikroskobik hem de konfokal mikroskobik görüntüleri elde edilmiştir. Plasentanın bu mikroskobik görüntüleri, plasental parankimmaya nüfuz etmiş yayılan villöz ağacı gösterir.
Bu mikroskobik görüntüler, villus kümesinde sonlanan villöz ağaç parçalarının distal bir kısmının varlığını göstermektedir. Daha sonra, villöz trofoblast tabakasını göstermek için, villöz ağacının distal kısmı immüno-etiketlendi. Görselde dış trofoblast tabakası yeşil renkle, kılcal damarlar ise kırmızı ile gösterilmiştir.
Daha sonra, plasenta dokusunu temizlemeden önce ve sonra kontrol etmek için, netleşmemiş ve temizlenmiş plasental dokuların konfokal görüntüleri elde edildi. Görüntüler, netleşmemiş bir doku için, dokunun 100 mikrometre veya daha az derinliğinde immünofloresanın yakalanabileceğini göstermektedir. Aksine, temizlenmiş plasental doku için immünofloresan çok daha yüksek bir derinlikte yakalanabilir.
Ayrıca, konvansiyonel dokuyu ters çevrilmiş şeffaf bölümlerle karşılaştırmak için, temizlenen doku etanol ile ters bir işlemde dehidre edildi. Plasenta dokusunun temizlenmeden önce ve sonra anti CK7 ile immünohistokimyasal boyanması, temizlemeye bağlı doku morfolojisinde önemli bir değişiklik göstermez. Animasyon, immün tipi villöz dokunun doku hacminin tüm derinliği boyunca dağıldığını göstermektedir.
Prosedürü rahatça yapmaya başladığınızda, üç güne bölünerek yaklaşık 18 saat sürmesini bekleyebilirsiniz. Bu prosedürü yapmaya çalışırken, birkaç farklı beceri seti gerektirdiğini hatırlamak önemlidir. Plasental patoloji, konfokal mikroskopi yapabilmek gerekir.
Görüntülemenin üç boyutlu görüntülerini oluşturabilmeniz ve immüno-işleme ve analiz konusunda bilgili olmanız gerekir. Bu prosedürü takiben, geleneksel histoloji, STS sayfası veya maldi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesiyle birlikte bu teknik, maternal fetal tıp, neonatoloji ve trofoblast biyolojisi alanında, preeklampsi, zayıf fetal büyüme ve fetal sıkıntının altında yatan temel nedenleri araştırmak için yol açmaktadır.
Bu videoyu izledikten sonra, plasenta villöz ağaç dokusunun nasıl temizleneceğini, işleneceğini ve analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Videoyu izlediğiniz için çok teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, damar ağı analizi için uygun plasenta villus ağacı parçalarının üç boyutlu görselleştirmeleri oluşturmak için bir protokol sunmaktadır. Yöntem, çocuk büyüme kısıtlaması ve prematüre doğumla ilgili temel soruları ele alma amacını taşımaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyoloji
- Damar biyolojisi
Arka Plan
- Plasentadaki damar ağlarını anlamak, büyüme kısıtlamalarını incelemek için çok önemlidir.
- İki boyutlu histolojik karakterizasyon, içgörüler sağlamada sınırlıdır.
- İmmunolabeling ve clearing teknikleri, damar yapılarının görselleştirilmesini artırır.
- Bu çalışma, yaşam bilimlerinde teşhis ve terapötik yaklaşımları geliştirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Plasental dokuda damar ağlarını analiz etmek için bir yöntem geliştirmek.
- Çocuk büyüme kısıtlamalarına ve prematüre doğuma katkıda bulunan faktörleri araştırmak.
- Plasental vaskülarizasyon hakkında daha net bir anlayış sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Plasental villus örneklerinin geri dönüştürülebilir doku clearing'i.
- Damar ağlarını etiketlemek için immunostaining.
- Görselleştirme için clearing yapılan dokunun 3D-rendering'i.
- Plasental dokunun diseksiyonu ve ters clearing'i.
Ana Sonuçlar
- Plasental dokuda damar ağlarının başarılı görselleştirilmesi.
- Plasental vaskülatürün yapısal organizasyonu hakkında geliştirilmiş anlayış.
- Büyüme ile ilgili sorunların teşhisi ve tedavisinde potansiyel etkiler.
- Eğitimli personel tarafından prosedürün gösterimi.
Sonuçlar
- Geliştirilen protokol, plasental vasküler ağların ayrıntılı analizini sağlamaktadır.
- Bu teknik, plasental sağlığın anlaşılmasında ilerlemelere yol açabilir.
- Gelecekteki araştırmalar, bu bulgulara dayanarak kritik sağlık sorunlarına yönelik çözümler geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables detailed three-dimensional analysis of placental vascular networks, supporting mechanistic de-risking in maternal-fetal medicine by clarifying structural determinants of fetal growth restriction and preterm birth. It provides a disease-relevant system for evaluating vascular integrity under pathophysiological conditions such as diabetes, hypertension, and obesity. The approach enhances predictive confidence in target validation by linking placental microstructure to clinical outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vascular architecture as a therapeutic target in placental insufficiency.
- Operational Value: Provides quantitative structural metrics such as branch points and volume for target engagement assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible vascular network readouts for compound screening in placental models.
- Operational Value: Supports assay scalability through reversible clearing and multiplex immunostaining of endothelial and trophoblast markers.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by preserving human placental tissue architecture for preclinical continuity.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by correlating vascular phenotypes with maternal metabolic stressors.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology by enabling hypothesis testing of vascular targets, progresses to screening via standardized 3D vascular phenotyping, and supports translational research through preserved tissue integrity and biomarker-compatible labeling.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking of vascular targets in placental disease models.
- Screening: Delivers assay readiness through quantitative, reproducible vascular network metrics from cleared tissues.
- Analytics: Generates measurable outputs including capillary volume, branch number, and end points for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical validation via human tissue relevance and immunohistochemical fidelity post-clearing.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for vascular phenotyping across gestational and disease-state placental models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in vascular target validation through direct structural phenotyping.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via reversible clearing and synchronized immunostaining protocols.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk in maternal-fetal therapeutics.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on vascular network integrity in disease-relevant placental models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in placental pathology, immunofluorescence labeling, and confocal microscopy.
- Dependent on tissue clearing infrastructure, Sykes-Moore chambers, and reversible ethanol-based clearing solutions.
- Necessitates cross-team standardization for consistent immunolabeling of CD31 and CK7 across laboratories.
- Involves adaptation considerations for varying placental tissue quality and gestational age.
- Limited by tissue size constraints (~1–2 mm³) and clearing depth (~1 mm) affecting network capture completeness.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:17
Villous Tree Dissection and Immunofluorescent Staining
3:16
Clarification of the Tissue
4:07
Mounting for Microscopy and Confocal Microscopy
6:04
Reversing the Clearing
6:33
Results: Use of Confocal Microscopy, Immunostaining, and Reverse Clearing to Analyze the Vascularization of Placental Network
8:21
Conclusion
