Görselleştirme ve miktar Mezenkimal hücre Adipojenik farklılaşma potansiyeli bir Lineage belirli Marker ile

Bu prosedürün genel amacı, soya özgü bir protein markörü, yağ asidi bağlayıcı protein dört kullanarak stromal hücrelerin adipojenik soya farklılaşmasını görselleştirmek ve ölçmektir. Bu, ilk önce ilgilenilen stromal hücrelerin izole edilmesi ve genişletilmesiyle gerçekleştirilir. Stromal hücreler daha sonra toplanır ve standart in vitro kültür plakalarına kaplanır.

Birkaç gün inkübasyondan sonra, hücreler adipojenik bir farklılaşma ortamı ile muamele edilir. Hücreler, düzenli ortam değişimi ile 14 gün boyunca inkübe edilir. Farklılaşmadan sonra, hücreler sabitlenir ve yağ asidi bağlayıcı protein dördüne karşı antikorlarla boyanır.

Mikrokuyu plakalarındaki etiketli hücrelerin görüntülerini yakalamak için otomatik yüksek içerikli bir tarama immünofloresan mikroskobu kullanılır. Farklılaşma daha sonra özel görüntü analiz yazılımı kullanılarak ölçülür. Oil Red O gibi boyalar kullanılarak adipojenik farklılaşmayı ölçmeye yönelik geleneksel yöntemlerin aksine, bu videoda açıklanan tahlil, adipojenik farklılaşmayı doğrulamak için soya özgü proteine, yağ asidi bağlayıcı protein dörde karşı bir antikor kullanır.

Bunu yaparken, bu yöntem, adipojenik farklılaşmaya karşılık gelen gen ekspresyonundaki değişiklikleri nicelleştirir. Bu tahlil, farklılaşmış hücrelerin yüzdesi, hücre başına floresan sinyalinin yoğunluğu ve hücre morfolojisindeki değişiklikler dahil olmak üzere çok sayıda bilgi sağlayabilir. Birden fazla özelliği analiz etme yeteneği, çeşitli tedavilere yanıt olarak farklılaşmadaki potansiyel ince değişikliklerin tanımlanmasını sağlar.

Bu tahlil aynı zamanda yüksek geçiş kabiliyetine sahiptir, bu da onu yüksek geçişli ilaç tarama uygulamaları için ideal hale getirir. % 10 fetal sığır serumu, GlutaMAX ve antibiyotiklerle desteklenmiş DMEM / F-12 bazal ortamı olan tam ASC ortamında hücreleri yeniden süspanse edin. Kuyucuk başına 5000 hücre olacak şekilde 96 oyuklu bir kültür plakasına pipetleyin.

Her donör için sekiz kuyuya ihtiyaç vardır. Dört kuyu kontrol ortamı alırken, geri kalanı farklılaşma ortamı alır. Her tedavinin her dördüncü kuyucuğu bir düğüm birincil kontrolüne hizmet edecektir.

Hücreleri 37 derecede inkübe edin, dört gün boyunca% 5 karbondioksit atmosferik koşulu ile nemlendirin. Bu, hücrelerin her bir kuyucukta birleşecek şekilde büyümesine izin vermek içindir. Dördüncü günde, plakaları inkübatörden çıkarın.

Ortamın yarısını her kuyucuktan çıkarın. İnsülin, izobütilmetilksantin, deksametazon ve indometazon ile desteklenmiş eşit hacimde tam ASC ortamı veya adipojenik farklılaşma ortamı ekleyin. Plakayı 37 derecede inkübe edin, atmosferik% 5 karbondioksit koşulu ile nemlendirin.

Yeterli farklılaşma için gereken süre 14 gündür. Bu süre zarfında, her iki ila üç günde bir medya değişikliği yaparak medyayı yenileyin. Farklılaşmadan sonra, plakaları inkübatörden çıkarın.

Tüm ortamları her bir kuyucuktan dikkatlice pipetleyin. Buz gibi soğuk metanol ekleyerek hücreleri sabitleyin. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Metanolü çıkarın, ardından Tris tamponlu tuzlu su ile yıkayın. % 0.25 kazein blokeri ekleyerek bloke edin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Kazeini çıkarın, ardından Tris tamponlu tuzlu su ile yıkayın. Anti-FABP4 antikorunu antikor seyreltme tamponunda 200 kat seyrelterek birincil antikor karışımını hazırlayın. Düğüm birincil kontrolü olarak ayrılmış olanlar dışındaki tüm kuyucuklara karışım ekleyin.

Bunun yerine bu kuyucuklara antikor seyreltme tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri bir kez Tris tamponlu tuzlu su ile yıkayın.

Çıkarın, taze Tris tamponlu salin ekleyin ve külbütör üzerinde beş dakika inkübe edin. Bu işlemi iki kez tekrarlayın. Anti-Rabbit Alexa 488 ikinci reantikoru antikor seyreltme tamponunda 200 kat seyrelterek ikinci reantikor karışımını hazırlayın.

Hücre çekirdeklerini etiketleyen DAPI'yi bir ila 2000 arasında bir son seyreltmede ekleyin. Karışımı tüm kuyucuklara ekleyin ve fotoağartmayı önlemek için plakayı folyo ile sarın. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, hücreleri TBS ile yıkayın ve külbütör üzerinde iki adet 15 dakikalık yıkama daha yapın. Tüm tamponu kuyulardan çıkarın ve bakteri üremesini önlemek için mililitre timerosal başına 0.4 miligram ile desteklenmiş depolama tamponu ekleyin. Bu biyo-tahlili görüntülemek için otomatik aşama, odaklama hedefleri ve filtrelerle donatılmış yüksek içerikli bir tarama makinesi kullanılır.

Doğru filtrelerin yerinde olup olmadığını kontrol edin. En iyi kalite için plakanın altını temizleyin. Plakayı, A1 sol üst köşeye gelecek şekilde s'ye yükleyin.

Plaka edinme sihirbazını kullanarak, plaka numarası, büyütme, tarih, deney koşulları ve etiketleme ayrıntıları gibi deneyle ilgili temel bilgileri kaydedin. Kullanılan mikro kuyu plakası tipini seçin. Kullanıcılar kuyuları ve edinilecek site sayısını seçebilirler.

Izgarayı vurgulayarak görüntülenecek tüm kuyuları seçin. Sahneyi en parlak kuyuya taşıyın. En parlak kuyunun seçilmesi, tüm görüntülerin doğrusal bir aralıkta olan ve dolayısıyla lekelenme yoğunluğuyla doğru orantılı olan piksel-gri değerlerle elde edilmesini sağlayacaktır.

Bu adım gerçekleştirilmezse, daha parlak kuyularda çekilen görüntüler aşırı doygun olabilir. Deney için uygun kanal kombinasyonlarını, pozlama süresini ve Z-ofset parametrelerini seçin. FABP4 ve DAPI'nin görüntülenmesi için kullanılan filtreler, boyamayı görselleştirmek için kullanılan özel etiketlere karşılık gelir.

480 nanometrede uyaran ve 560 nanometrede yayan Alexa 488, FABP4'ü görselleştirmek için kullanıldı. Ve 360 nanometrede uyaran ve 460 nanometrede yayılan DAPI boyası, hücre çekirdeklerini görselleştirmek için kullanıldı. Yağ Kırmızısı O ile etiketlenmiş plakalar için, yağ damlacıkları yakıtla iletilen parlak ışıkla görselleştirildi.

Petrol Kırmızısı O etiketi de 575 nanometrede uyardığı ve 630 nanometrede yaydığı için floresan ile görselleştirildi. Tüm kurulum tamamlandığında, biyolojik tahlil elde edilmeye hazırdır. Görüntülere uzaktan kolay erişim sağlamak için görüntü otomatik olarak çevrimiçi sunucuya kaydedilir.

Çevrimiçi sunucuda depolanan tüm görüntü setine uzak masaüstü programı kullanılarak erişilebilir. Görüntüler daha sonra MetaXpress yazılımı kullanılarak analiz edilebilir. Hücre puanlama uygulaması, kullanıcıların bu örnekte DAPI gibi bir alandaki tüm çekirdekleri tespit etmek için bir dalga boyu seçmesine olanak tanır.

Sonraki dalga boyları, çekirdek, sitoplazma veya her iki hücre konumunda pozitif bir işaretleyiciyi tespit etmek için kullanılabilir. Yağ asidi bağlayıcı protein dört veya FABP4, adipojenik soyun bir göstergesidir. FABP4'ün ekspresyonu, farklılaşmış adipositlerin çekirdeğine ve sitoplazmasına lokalizedir.

Bu biyolojik tahlilde, hücre puanlama modülünü kullanarak FABP4 ekspresyonunu analiz ediyoruz. İlk olarak, arka planın üzerinde boyut ve sinyal yoğunluğu için kullanıcı tanımlı parametrelerle DAPI kanalını kullanarak hücre çekirdeklerini tespit edin. Ayak C kanalını ve arka plan üzerindeki boyut ve sinyal yoğunluğu için kullanıcı tanımlı parametreleri kullanarak FABP4 sinyalini algılayın.

Bu biyolojik tahlilde, 560 nanometre aralığında floresan olan Yağ-Kırmızı-O etiketli yağ damlacıkları, bir MetaXpress kutu modülü olan Transflour ile analiz edildi. Bu analiz algoritması, kullanıcı tarafından belirtilen hücre boyutu ve boyama yoğunluğu kriterlerini karşılayan DAPI etiketli çekirdekleri kullanarak toplam hücreleri tespit eder. Kullanıcı ayrıca, bu durumda hücresel çekirdeklere yakın çevredeki yağ damlacıklarını tespit eden çukurların boyutunu ve yoğunluğunu da belirtir.

Yağ damlası boyutu, boyama yoğunluğu, hücre başına sayı ile ilgili bilgiler Transflour testi tarafından kaydedilir. Yağ Kırmızısı O etiketinin bazı hücrelerden sızdığını veya çözündüğünü, meydana gelen gerçek farklılaşma miktarını potansiyel olarak sınırladığını ve karıştırdığını not etmek önemlidir. DAPI, nükleer bir leke ve FABP4 ile etiketlenmiş erken ve geç geçiş, kontrol ve farklılaşmış hücrelerin temsili görüntüleri, birleştirme ve segmentasyon görüntülerinin yanında gösterilir.

Segmentasyon görüntüleri, yeşil bir katmana sahip farklılaşmış hücreleri ve kırmızı bir katmana sahip farklılaşmamış hücreleri görüntüler. FABP4 eksprese eden hücrelerin yüzdesi, adipojenik farklılaşma potansiyelinin bir ölçüsü olarak kullanıldı. Erken ve geç geçiş hücrelerinde adipojenik farklılaşma ile FABP4 eksprese eden hücrelerde önemli bir artış gözlendi.

Erken geçiş hücreleri, geç geçiş hücrelerine göre farklılaşmada önemli ölçüde daha fazla artış gösterdi. DAPI ve Oil Red O'nun temsili görüntüleri, birleştirme ve segmentasyon görüntüleriyle birlikte gösterilir. Segmentasyon görüntüleri, tüm çekirdekleri yeşil kaplamalı, Yağ-Kırmızı-O lekeli lipid damlacıklarını ise kırmızı kaplamalı, Yağ-Kırmızı-O lekeli olarak gösterir.

Hücre başına Yağ Kırmızısı O boyama alanı, adipojenik farklılaşma potansiyelinin bir ölçüsü olarak kullanıldı. Adipojenik farklılaşma ile Yağ Kırmızısı O boyama alanında önemli bir artış gözlendi. Erken geçiş hücreleri, geç geçiş hücrelerine kıyasla hücre başına daha fazla Yağ Kırmızısı O lekesi alanı gösterdi.

Diferansiye erken ve geç pasaj ASC'lerin FABP4 protein ekspresyon seviyesini analiz etmek için western blot yapıldı. Toplam protein yükleme kontrolünün bir oranı olarak FABP4 bantlarının optik yoğunluğunun yarı kantitatif analizi, FABP4 immünoetiketlemesinin erken geçişte ve daha az derecede geç geçişte farklılaşmış hücrelerde önemli ölçüde arttığını gösterdi. Bu videoyu izleyerek, kök hücreleri adipojenik soya nasıl ayırt edeceğinizi, adipojenik gene özgü belirteç kullanarak immünofloresan boyamanın nasıl yapılacağını, yağ asidi bağlayıcı protein dördünü ve son olarak, yağ asidi bağlayıcı protein dördü için immünopozitif olan hücrelerden ilgili tüm morfolojik özellikleri nasıl görüntüleyeceğinizi ve analiz edeceğinizi anlamış olmalısınız.

Umarım bu videoyu araştırmanız için faydalı bulursunuz.