Domuz yağ dokusundan yağ kök hücrelerinin ve adipositlerin etkili izolasyonu

Bu araştırmanın amacı, yağ dokusundan hücreleri verimli ve hızlı şekilde izole etmektir. Geleneksel sindirim zaman maliyeti gerektirir ve aşırı sindirilebilir. Enzim ve mekanik dalga ölçümümüz nazik bir dispersiya sağlar ve izolasyon süresini azaltır.

Başlamak için, ötenazi yapılmış bir domuzun sırt deri altı yağ dokusunu bir kültür kabına koyun. Yağ dokusu ile dermis arasındaki doğal düzlem boyunca keserek tam iki ila üç milimetre kalınlığında bir ULB tabakası elde edin. ULB'yi buz gibi steril salinle bir kez durulayın.

Steril kültür kabını yırttıktan sonra, steril kabdaki dokuyu önceden sterilize edilmiş bir terezide tartın. Her 1,8 gram dokuya karşılık, 10 mililitre buz gibi soğuk D-Hank tamponu ekleyin ve dokuyu tamamen suyun altında tutun. Steril cerrahi makas kullanarak tüm görünür kan damarlarını dokudan ayırıp çıkarabilirsiniz.

Bağ dokularını ve fibrotik bileşenleri çıkarın. Çıkarılan malzemeleri belirlenmiş biyolojik tehlike kaplarına atın. D-Hank'in tamponundaki dokuyu durulayarak kalan kan ve kalıntıları temizleyin.

Steril kültür kabındaki dokuyu önceden sterilize edilmiş bir tarazda tartarak tartın. 1,8 gram durula dokusu parçalarını steril 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Tüpe 800 mikrolitre A tip doku dissosiyasyon tamponu ekleyin.

Steril oftalmik makas kullanarak tüpteki dokuyu yaklaşık bir ila iki milimetreküp boyutunda parçalara indirin. Hamyte dokusunu çevresindeki tampon ile birlikte yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Tüpe 200 mikrolitre A tipi doku dissosiyasyon ajanı ekleyin.

İçeriği karıştırmak için tüpü nazikçe döndürüp üç kez el ile sallayın. Yağ parçalarının dissosiyasyon çözeltisine tamamen batırıldığından emin olun. Tüp kapağının sıkıca kapalı olup olmadığını kontrol edin.

Tüpü 37 derece Celsius sıcaklığında bir metal banyoya yerleştirin ve beş ila 10 dakika kuluçka yapın. Kısmen sindirilmiş yağ dokusunu tampon içinde mekanik dissosiyasyon sistemi için tasarlanmış steril 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Yağ dokusu için önceden ayarlanmış programı çalıştırın, böylece 200 hertz sinüzoidal dalga kullanarak mekanik ayrışma gerçekleştirin.

Hücre süspansiyonunu toplayıp 200 mikrometrelik hücre süzgecinden yeni bir 50 mililitrelik santrifüj tüpüne geçirin. Süzgecine dört derece Celsius'ta önceden soğutma D-Hank solüsyesini beş mililitre ekleyin. Süzgeçi D-Hank çözeltisiyle iki kez durulayın.

Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 500 G'de beş dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüjlendirin. Steril bir pastör pipeti kullanarak üst lipid tabakasını aspire edin ve atın, adiposit tabakasını korumak için bir mililitre tampon bırakın. Adipositleri içeren ikinci katmanı üçüncü ve dördüncü katmanları rahatsız etmeden toplayın.

Üçüncü katmanı aspire edin ve atın. Stromal damar fraksiyonu (SVF) içeren alt pellete bir mililitre D.Hank tamponu ekleyin. Hücre pelletini tamponda nazikçe tekrar askıya alın, böylece hücre konsantrasyonu iki ila beş kat 10 ile mililitrede altı hücre gücüne ulaşın.

SVF hücre süspansiyonunu 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde hazırlayın. Süspansiyonu kullanana kadar buzda tutun. 10 mikrolitre SVF hücre süspansiyonu ve 10 mikrolitre %0,4 trypan blue çözeltisi ekleyin, steril bir 0,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünde.

Nazikçe üç kez yukarı ve aşağı pipet yapın. Boyalı hücre karışımından 10 mikrolitre, otomatik hücre sayacı için uygun bir sayma slaytına aktarın. Numunenin odayı tamamen doldurup taşmadan dolup taşmadığını doğrulayın.

Sayma slaytını otomatik hücre sayacına yerleştirin. Tripan mavi test tipini seçin ve gerekirse hücre konsantrasyon aralığını ayarlayın. Otomatik hücre sayımı başlatmak için sayma tuşuna basın.

Sayma odası görüntülerini izleyin ve canlı ile ölü hücrelerin otomatik ayrımını gözlemleyin. Cihaz ekranında gösterilen hücre canlılık yüzdesini ve toplam canlı hücre sayısını kaydedin. Her örnek için üç bağımsız ölçüm yapın.

Yağ dokusunun gramı başına ortalama canlılık ve hücre verimini hesaplayın. D.Hank's ile mililitrede beş mikrogram huksed ve bir mikromolar BODIPY içeren bir boyama çözeltisi hazırlayın. İzole edilen adipositleri boyama çözeltisinde 37 derece Celsius'ta 15 dakika kuluçka edin.

Floresans mikroskopisi için uygun slayt hazırlıkları için kendi yapımı adiposit dostu slayt kapak cam sistemi kullanın. Ev yapımı adiposit dostu montaj sistemi, sağlam adipositlerin eşit dağılımını sağladı ve net görüntüleme sağlandı. Kalabalık, çok katmanlı düzenlemeler üreten geleneksel yöntemlerin aksine, çıkarılan adipositler sağlam yapı ve normal morfoloji sergilemiştir.

Mekanik ayrıştırma yöntemiyle elde edilen adipositlerin hayatta kalma oranı, geleneksel enzimatik hidroliz yöntemine kıyasla anlamlı derecede yüksekti. Saflaştırılmış ve kültürlenmiş yağ kök hücreleri, düzenli bir şekilde düzenlenmiş uzun iğne şeklinde hücrelere sahip uniform bir fibroblast benzeri morfoloji sergiliyordu. Çoğu hücre lekesiz kalmış, bu da yaşamlılığı gösterirken, sadece küçük bir kısmı ölü hücreleri temsil eden mavi boyaya boyanmıştır.

Bu protokol, araştırmacıların yağ deposu boyunca izole hücre karakterlerini karşılaştırmasına olanak tanır. Protokolden izole edilen SVF'ler, organoid yapısı ve yağ kök hücre arındırılması için kullanılabilir. Gelecekteki çalışmalar, depo boyunca ekstraselüler matriksindeki yağ dokusu varyasyonlarını göz önünde bulundurarak izolasyon yöntemini daha da optimize edebilir.