İnsan göbek bağı ve fetal plasentadan Mezenkimal Stromal Hücre İzolasyonu ve Vasıflandırılması

Bu protokolün genel amacı, mezenkimal stromal hücreleri dört farklı perinatal doku kaynağından, göbek kordonu astarından, Wharton jölesinden, kordon-plasenta bileşkesinden ve fetal plasentadan izole etmektir. Bu yöntem, non-invaziv olarak özel kaliteli mezenkimal kök hücreler elde ederek kök hücre biyolojisi, alternatif tıp alanının ilerlemesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, farklı perinatal doku kaynaklarından çok sayıda yüksek kaliteli homojen hücre popülasyonunu verimli bir şekilde vermesidir.

Bu teknikten elde edilen çok potent kordon mezenkimal stromal hücreleri, erişkin dokulardan izole edilen mezenkimal kök hücrelere göre daha ilkel oldukları için çeşitli hastalık ve bozuklukların tedavisinde kullanılabilir. Bu yöntem, kordon ve plasentanın farklı segmentlerinden ve spesifik nişlerinden mezenkimal stromal hücrelerin özellikleri hakkında fikir verebilir. Numuneyi bir biyogüvenlik kabininde buz üzerinde 150 milimetrelik bir petri kabına yerleştirerek başlayın ve dokuyu buz gibi soğuk PBS ile birkaç kez durulamak için bir iğne ve şırınga kullanın.

Tüm kan pıhtıları çıkarıldığında, farklı anatomik bölgeleri tanımlamak için numuneyi dikkatlice inceleyin. Daha sonra göbek kordonunun fetal ucunu kavramak için forseps kullanın ve kordon-plasenta bağlantısının tepesinde dikkatlice bir kesi yapmak için makas kullanın. Kord-plasenta bileşkesini plasentadan ayırmak için bileşkin altında ikinci bir kesi yapın.

Ve ayrılan dokuları ayrı petri kaplarına bölün. Ardından, epiteli rahatsız etmeden kan damarlarını ve çevresindeki Wharton jölesini tamamen ortaya çıkarmak için göbek kordonunu uzunlamasına kesin. Wharton'un jölesini kan damarlarından ve subamniyonun interepitelinden uzaklaştırmak için bir neşter kullanın.

Ardından, kan damarlarını çıkarın, kan damarlarının altında ve çevresinde kalan perivasküler jöleyi Wharton'un jöle kabına aktarın ve kalan kordon astar dokusunu kendi kabına yerleştirin. Tüm dokular diseke edildiğinde, her tabaktaki PBS'yi üç ila beş mililitre tripsin ile değiştirin ve her doku örneğini 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksitte 30 dakikalık bir inkübasyon için bir ila iki milimetre parçaya kesmek için makas kullanın. Hücrelerin dokudan salınmasını görselleştirerek kısmi sindirimi gözlemlemek için bir faz kontrast mikroskobu kullanın.

Kısmi sindirim süresinin sonunda, tripsini eşit hacimde bir kültür ortamı ile nötralize edin ve numuneleri ayrı ayrı 50 mililitrelik konik tüplere aktarın. Doku parçalarının üç dakika oturmasına izin verin. Daha sonra süpernatanı dikkatlice aspire edin ve numune başına 15 ila 20 kısmen sindirilmiş doku parçasını ayrı ayrı 75 santimetre karelik doku kültürü şişelerine yerleştirin.

Daha sonra, 37 santigrat derecede iki ila üç günlük bir inkübasyon için dokuz mililitre kültür ortamı ekleyin. Üç gün sonra kültür ortamını değiştirin ve hücre büyümesi için xplants'i faz kontrast mikroskobu ile inceleyin. Hücre büyümesi yüzde 70 birleşmeye ulaştığında, hücreleri şişe başına bir ila iki mililitre tripsin çözeltisi içinde ayırın, şişeyi enzim çözeltisi ile eşit bir kaplama için döndürün ve kültürleri 37 santigrat derecede üç dakika inkübe edin.

Daha sonra reaksiyonu bir ila iki mililitre kültür ortamı ile nötralize edin. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın, peleti alt kültür için kültür ortamında santimetre kare tohumlama yoğunluğu başına bir kez on ila dördüncü hücrede yeniden süspanse edin. Kordon astarından ve Wharton'un jöle kültürlerinden elde edilen hücreler, sırasıyla 59 ve 80 koloni oluşturma verimlilik değerleri sergiler.

Bununla birlikte, kordon-plasenta bileşke hücrelerinin koloni oluşturan verimlilik değeri, kemik iliği mezenkimal kök hücreleri için gözlenene benzerdir, bu da kordon-plasenta bileşke türevi hücrelerin daha yüksek proliferitif ve kendini yenileme yeteneklerine sahip olduğunu düşündürmektedir. Akış tarafı: Bu perinatal dokulardan izole edilen tek hücreli süspansiyonların metrik analizi, dört doku kaynağının tümünden spesifik mezenkimal kök hücre belirteçleri için pozitif hücrelerin yüzdelerinin, standart kemik iliği kaynaklı mezenkimal hücreler tarafından ifade edilenlere benzer olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, medyan floresan yoğunluk oranları, Wharton'un jöle ve kordon-plasenta bileşkesinden türetilmiş hücrelerin, fetal plasenta türevli hücrelerdeki kordon astarına çok benzer veya daha yüksek olduğunu göstermektedir.

İlginç bir şekilde, değişen koloni oluşturma verimlilik değerlerine rağmen, farklı perinatal kaynaklardan gelen tüm hücreler, test edilen tüm pluripotens belirteçleri için en yüksek ekspresyon seviyelerini ifade eden kordon-plasenta birleşiminden türetilmiş mezenkimal stromal hücreler dışında, kantitatif RTPCR analizi ile benzer seviyelerde pluripotens belirteçleri ifade eder. Ayrıca, tüm perinatal kaynaklardan izole edilen mezenkimal stromal hücreler, adipojenik, kondrojenik ve osteojenik hücre tiplerine kolayca farklılaşır ve ayrıca trisoy farklılaşması gösterir. Farklılaşma potansiyeli mezenkimal stromal hücre kaynağına göre değişmekle birlikte.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik verimli bir şekilde gerçekleştirilirse iki ila üç saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, lateral tekniği uygulamak ve doku kaynakları arasında çapraz kontaminasyonu önlemek önemlidir. Bu teknik, araştırmacıların perinatal dokulardaki kök hücre nişlerinin doğasını keşfetmelerinin yolunu açtı.