İnsan göbek bağı ve fetal plasentadan Mezenkimal Stromal Hücre İzolasyonu ve Vasıflandırılması
3 Nisan 2017
Burada, insan göbek kordonu (UC) ve kord fetal plasenta örnek izolasyonu için (CL) Wharton jöle (WJ), kordon plasenta bileşke (CPJ) ve fetal plasenta (FP) astar diseksiyon için bir protokol mevcut ve eksplant kültürü tekniği kullanılarak mezenkimal stromal hücreler (MSC) karakterizasyonu.
Bu protokolün genel amacı, mezenkimal stromal hücreleri dört farklı perinatal doku kaynağından, göbek kordonu astarından, Wharton jölesinden, kordon-plasenta bileşkesinden ve fetal plasentadan izole etmektir. Bu yöntem, non-invaziv olarak özel kaliteli mezenkimal kök hücreler elde ederek kök hücre biyolojisi, alternatif tıp alanının ilerlemesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, farklı perinatal doku kaynaklarından çok sayıda yüksek kaliteli homojen hücre popülasyonunu verimli bir şekilde vermesidir.
Bu teknikten elde edilen çok potent kordon mezenkimal stromal hücreleri, erişkin dokulardan izole edilen mezenkimal kök hücrelere göre daha ilkel oldukları için çeşitli hastalık ve bozuklukların tedavisinde kullanılabilir. Bu yöntem, kordon ve plasentanın farklı segmentlerinden ve spesifik nişlerinden mezenkimal stromal hücrelerin özellikleri hakkında fikir verebilir. Numuneyi bir biyogüvenlik kabininde buz üzerinde 150 milimetrelik bir petri kabına yerleştirerek başlayın ve dokuyu buz gibi soğuk PBS ile birkaç kez durulamak için bir iğne ve şırınga kullanın.
Tüm kan pıhtıları çıkarıldığında, farklı anatomik bölgeleri tanımlamak için numuneyi dikkatlice inceleyin. Daha sonra göbek kordonunun fetal ucunu kavramak için forseps kullanın ve kordon-plasenta bağlantısının tepesinde dikkatlice bir kesi yapmak için makas kullanın. Kord-plasenta bileşkesini plasentadan ayırmak için bileşkin altında ikinci bir kesi yapın.
Ve ayrılan dokuları ayrı petri kaplarına bölün. Ardından, epiteli rahatsız etmeden kan damarlarını ve çevresindeki Wharton jölesini tamamen ortaya çıkarmak için göbek kordonunu uzunlamasına kesin. Wharton'un jölesini kan damarlarından ve subamniyonun interepitelinden uzaklaştırmak için bir neşter kullanın.
Ardından, kan damarlarını çıkarın, kan damarlarının altında ve çevresinde kalan perivasküler jöleyi Wharton'un jöle kabına aktarın ve kalan kordon astar dokusunu kendi kabına yerleştirin. Tüm dokular diseke edildiğinde, her tabaktaki PBS'yi üç ila beş mililitre tripsin ile değiştirin ve her doku örneğini 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksitte 30 dakikalık bir inkübasyon için bir ila iki milimetre parçaya kesmek için makas kullanın. Hücrelerin dokudan salınmasını görselleştirerek kısmi sindirimi gözlemlemek için bir faz kontrast mikroskobu kullanın.
Kısmi sindirim süresinin sonunda, tripsini eşit hacimde bir kültür ortamı ile nötralize edin ve numuneleri ayrı ayrı 50 mililitrelik konik tüplere aktarın. Doku parçalarının üç dakika oturmasına izin verin. Daha sonra süpernatanı dikkatlice aspire edin ve numune başına 15 ila 20 kısmen sindirilmiş doku parçasını ayrı ayrı 75 santimetre karelik doku kültürü şişelerine yerleştirin.
Daha sonra, 37 santigrat derecede iki ila üç günlük bir inkübasyon için dokuz mililitre kültür ortamı ekleyin. Üç gün sonra kültür ortamını değiştirin ve hücre büyümesi için xplants'i faz kontrast mikroskobu ile inceleyin. Hücre büyümesi yüzde 70 birleşmeye ulaştığında, hücreleri şişe başına bir ila iki mililitre tripsin çözeltisi içinde ayırın, şişeyi enzim çözeltisi ile eşit bir kaplama için döndürün ve kültürleri 37 santigrat derecede üç dakika inkübe edin.
Daha sonra reaksiyonu bir ila iki mililitre kültür ortamı ile nötralize edin. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın, peleti alt kültür için kültür ortamında santimetre kare tohumlama yoğunluğu başına bir kez on ila dördüncü hücrede yeniden süspanse edin. Kordon astarından ve Wharton'un jöle kültürlerinden elde edilen hücreler, sırasıyla 59 ve 80 koloni oluşturma verimlilik değerleri sergiler.
Bununla birlikte, kordon-plasenta bileşke hücrelerinin koloni oluşturan verimlilik değeri, kemik iliği mezenkimal kök hücreleri için gözlenene benzerdir, bu da kordon-plasenta bileşke türevi hücrelerin daha yüksek proliferitif ve kendini yenileme yeteneklerine sahip olduğunu düşündürmektedir. Akış tarafı: Bu perinatal dokulardan izole edilen tek hücreli süspansiyonların metrik analizi, dört doku kaynağının tümünden spesifik mezenkimal kök hücre belirteçleri için pozitif hücrelerin yüzdelerinin, standart kemik iliği kaynaklı mezenkimal hücreler tarafından ifade edilenlere benzer olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, medyan floresan yoğunluk oranları, Wharton'un jöle ve kordon-plasenta bileşkesinden türetilmiş hücrelerin, fetal plasenta türevli hücrelerdeki kordon astarına çok benzer veya daha yüksek olduğunu göstermektedir.
İlginç bir şekilde, değişen koloni oluşturma verimlilik değerlerine rağmen, farklı perinatal kaynaklardan gelen tüm hücreler, test edilen tüm pluripotens belirteçleri için en yüksek ekspresyon seviyelerini ifade eden kordon-plasenta birleşiminden türetilmiş mezenkimal stromal hücreler dışında, kantitatif RTPCR analizi ile benzer seviyelerde pluripotens belirteçleri ifade eder. Ayrıca, tüm perinatal kaynaklardan izole edilen mezenkimal stromal hücreler, adipojenik, kondrojenik ve osteojenik hücre tiplerine kolayca farklılaşır ve ayrıca trisoy farklılaşması gösterir. Farklılaşma potansiyeli mezenkimal stromal hücre kaynağına göre değişmekle birlikte.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik verimli bir şekilde gerçekleştirilirse iki ila üç saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, lateral tekniği uygulamak ve doku kaynakları arasında çapraz kontaminasyonu önlemek önemlidir. Bu teknik, araştırmacıların perinatal dokulardaki kök hücre nişlerinin doğasını keşfetmelerinin yolunu açtı.
Genel Bakış
Bu protokol, eksplant kültür tekniği kullanılarak mezenkimal stromal hücreleri (MSCs) izole etmek amacıyla insan göbek kordonu ve fetal plasentanın diseksiyonunu özetlemektedir. Bu yöntem, farklı perinatal doku kaynaklarından MSC'lerin karakterize edilmesine olanak tanıyarak kök hücre biyolojisindeki gelişmelere katkı sağlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kök Hücre Biyolojisi
- Rejeneratif Tıp
- Hücre Kültürü Teknikleri
Arka Plan
- Mezenkimal stromal hücreler (MSCs), multipotensleri nedeniyle terapötik potansiyele sahiptir.
- Perinatal dokular, primitif MSC'ler açısından zengin kaynaklardır.
- Bu protokol, göbek kordonu ve plasentadan yüksek kaliteli MSC'lerin verimini artırmayı amaçlamaktadır.
- Farklı doku kaynaklarından elde edilen MSC'lerin özelliklerini anlamak, bunların klinik uygulamalarına ışık tutabilir.
Çalışmanın Amacı
- Göbek kordonu astarı, Wharton jölesi, kordon-plasenta bileşkesi ve fetal plesentadan MSC'leri izole etmek.
- Bu dokulardan türetilen MSC'lerin kalitesini ve özelliklerini değerlendirmek.
- Araştırma ve terapötik kullanım için MSC elde edilmesine yönelik non-invaziv bir yöntem sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Göbek kordonunun ve plasentanın belirgin anatomik bölgelere ayrılması.*
- Doku örneklerinin kısmi sindirimi için tripsin kullanımı.
- Diseke edilen dokuların spesifik besiyeri koşullarında kültüre edilmesi.
- Mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak hücre büyümesinin değerlendirilmesi ve karakterizasyonu.
Temel Sonuçlar
- Wharton jölesi ve kordon-plasenta birleşim hücrelerinde yüksek koloni oluşturma verimliliği gözlemlendi.
- Tüm MSC'ler, ekspresyon düzeylerindeki farklılıklara rağmen benzer pluripotens belirteçleri eksprese etti.
- MSC'ler, birden fazla lineage'a farklılaşma yeteneği sergiledi.
- Teknik, iki ila üç saat içinde verimli bir şekilde tamamlanabilir.
Sonuçlar
- Bu protokol, perinatal dokulardan yüksek kaliteli MSC'lerin izole edilmesi için güvenilir bir yöntem sunmaktadır.
- Farklı kaynaklardan elde edilen MSC'lerin özelliklerinin anlaşılması, bunların terapötik uygulamalarını geliştirebilir.
- Perinatal dokulardaki kök hücre nişlerinin daha fazla araştırılması teşvik edilmektedir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Bu protokol, kemik iliği kaynaklı mezenkimal stromal hücrelere (MSH'ler) kıyasla invaziv olmayan ve etik açıdan daha uygun bir alternatif sunarak, farklı perinatal doku kaynaklarından mezenkimal stromal hücrelerin (MSH'ler) izolasyonunu sağlar. Kordon-plasenta bileşkesi (CPJ), Wharton jölesi (WJ), kordon astarı (CL) ve fetal plasenta (FP) gibi anatomik bölgeleri karşılaştıran bu yöntem, rejeneratif tıp süreçlerinde hedef doğrulama ve mekanistik risk azaltma çalışmalarını destekler. CPJ kaynaklı MSH'lerde gözlemlenen daha yüksek koloni oluşturma verimliliği ve pluripotensi belirteç ekspresyonu, hücre tedavisi uygulamaları için öngörüsel güven sağlayarak öncü adayların belirlenmesine ve portföy önceliklendirmesine yardımcı olur.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Farklı proliferasyon ve kendini yenileme kapasitelerine sahip ayrı perinatal nişlerden MSC'lerin izole edilmesi yoluyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Adipojenik, kondrojenik ve osteojenik soylar genelinde multipotensinin fonksiyonel doğrulaması aracılığıyla biyolojik risk azaltımını destekler.
- Bilimsel Değer: CPJ'nin üstün koloni oluşturma verimliliğine ve plüripotens marker ekspresyonuna sahip güçlü bir MSC kaynağı olduğunu belirleyerek hedef güvenilirliğini artırır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış yüzey belirteç profillerine (CD29, CD44, CD73, CD90, CD105) sahip homojen, aderen MSC popülasyonları elde ederek, valide edilmiş biyolojik sistemleri sonraki iş akışları için hazırlar.
- Bilimsel Değer: Tutarlı eksplant kültürü teknikleri ile koloni oluşturma verimliliği ve akış sitometrisi metrikleri gibi kantitatif çıktılar aracılığıyla analiz standardizasyonu ve tekrarlanabilirlik sorunlarını çözer.
- Operasyonel Değer: Protokolün iki ila üç saat içinde tamamlanmasıyla tarama hazırlığını ve ölçeklenebilirliği vurgulayarak, preklinik tarama basamaklarında güvenilir bileşik değerlendirmesine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Preklinik doğrulama için temel bir fonksiyonel çıktı olan üç hatlı farklılaşma kapasitesini göstererek, hastalık ilişkisi ve translasyonel biyobelirteç uyumunu tartışır.
- Operasyonel Değer: Kemik iliği kaynaklı MSC'lerle karşılaştırılabilir düzeyde aderent, fibroblastoid morfoloji ve yüzey belirteç ekspresyonunu koruyan MSC'ler sağlayarak, keşiften preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği tanımlar.
- Bilimsel Değer: CPJ-MSC'lerin diğer kaynaklara göre daha verimli farklılaştığını göstererek, risk ayarlı ilerleme kararlarını destekleyen öngörücü risk azaltma değerine odaklanır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, anatomik olarak ayrıştırılmış MSC izolasyonu yoluyla hipotez testlerini, yolak netleştirmeyi ve biyolojik risk azaltmayı destekleyerek, Erken Keşiften Öncü Bileşik Belirleme ve Preklinik çalışmalara kadar olan keşif sürekliliğine entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Yöntemin; göbek kordonu astarı, Wharton jölesi, kordon-plasenta bağlantısı ve fetal plasenta genelinde MSC özelliklerinin karşılaştırılmasına olanak tanıyarak hipotez testini ve yolak aydınlatmasını nasıl desteklediğini açıklar.
- Tarama: Analiz hazırlığını, tekrarlanabilirliği ve koloni oluşturma verimliliği (CL için 59, WJ için 80, CPJ için BM ile benzer) ile akış sitometrisi tabanlı marker ekspresyon analizi gibi kantitatif çıktıları tanımlar.
- Analitik: Ekiplerin koşulları karşılaştırmasına ve öngörücü değeri değerlendirmesine yardımcı olan koloni oluşturma verimliliği, floresan yoğunluk oranları ve pluripotensi markerları için kantitatif RTPCR gibi ölçümleri vurgular.
- Translasyonel Araştırma: MSC'lerin adipojenik, kondrojenik ve osteojenik soy hatlarına farklılaşmasını göstererek yöntemi preklinik sürekliliğe bağlar, biyomarker uyumunu ve fonksiyonel doğrulamayı destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Yöntemi tek kullanımlık bir teknikten ziyade yeniden kullanılabilir bir yetkinlik olarak çerçeveler ve rejeneratif tıp programlarında tutarlı MSC tedariki için perinatal doku kaynaklarında standardizasyonu mümkün kılar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Anatomik olarak çözümlenmiş MSC izolasyonu ve fonksiyonel karakterizasyon yoluyla öngörücü güven, hedef doğrulaması ve mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: Eksplant kültürü, tanımlanmış sindirim parametreleri ve tutarlı ekim yoğunluğu (1×10⁴ cells/cm²) aracılığıyla standardizasyon, tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik.
- Stratejik Değer: Keşif sürecinin erken aşamalarında CPJ gibi yüksek potensli MSC kaynaklarının belirlenmesiyle daha iyi git/gitme (go/no-go) kararları, sermaye verimliliği ve azaltılmış geç aşama biyolojik risk.
- Portföy Etkisi: Perinatal MSC kaynakları arasındaki farklı proliferasyon, kendini yenileme ve diferansiyasyon verimliliğine dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirme ve ilerleme kararları.
Uygulama Hususları
- Doku diseksiyonu, steril hücre kültürü ve marker analizi için akım sitometrisi konularında bilimsel uzmanlık gereklidir.
- Enstrümantasyon ve analitik altyapı ihtiyaçları arasında faz kontrast mikroskobisi, santrifüjler, inkübatörler (37°C, %5 CO₂) ve CD markerı ile floresan yoğunluk değerlendirmesi için akım sitometreleri yer almaktadır.
- Ekip içi standardizasyon gereklilikleri, laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliği sağlamak için tutarlı doku diseksiyonu protokollerini, tripsin nötralizasyonunu ve ekim yoğunluklarını içerir.
- Model sistemler arası adaptasyon değerlendirmeleri, outgrowth süresi farklılık gösterdiğinden (CPJ için 3–4 gün, CL/WJ için 7–10 gün, FP için 11–14 gün), doku kaynağına göre eksplant boyutunun ve sindirim süresinin ayarlanmasını içerir.
- Kaynak materyal tarafından desteklenen pratik sınırlamalar arasında, diseksiyon sırasında doku kaynakları arasında çapraz kontaminasyondan kaçınma gerekliliği ile anatomik bölgeler arasında koloni oluşturma verimliliği ve outgrowth süresindeki değişkenlik yer alır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:05
Title
1:09
Human Umbilical Cord (UC), Cord-Placenta Junction (CPJ), and Fetal Placenta (FP) Processing and Cell Isolation
6:21
Conclusion
4:29
Results: Colony-Forming Efficiency and Mesenchmyal Stromal Cell (MSC) Marker Expression of Perinatal Tissue-Isolated Cells
