Gelişim ve karakterizasyonu İn Vitro Mikrodamar Ağ ve Endotel kantitatif ölçümleri [Ca 2+] I Ve Nitrik Oksit Üretimi
19 Mayıs 2016
Birincil insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler), bir mikroakışkan ağ cihazı içinde birleşecek şekilde büyütüldü. Endotel hücre bağlantısı ve F-aktin dağılımları gösterildi ve adenozin trifosfata (ATP) yanıt olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve nitrik oksit üretimindeki değişiklikler, bireysel hücre seviyelerinde gerçek zamanlı olarak ölçüldü.
Bu prosedürün genel amacı, endotel hücrelerinin fizyolojik olarak ilgili kesme akışı altında büyümesine izin veren bir mikroakışkan cihaz geliştirmek ve kalsiyum ve nitrik oksit üretimlerinde agonistin neden olduğu değişiklikleri ölçmektir. Bu mesaj, in vitro mikrodamar modelini doğrulayarak ve in vivo ve in vitro çalışmalar arasındaki boşlukları doldurarak mikrodamar araştırmalarının geleceğini ilerletmeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajları, çeşitli vaskülatürleri taklit etmek için mikrokanalların çok yönlü tasarımıdır ve orijinal kültürlere koşullu statik olandan in vivo olarak daha yakın olan hücre kültürü ortamını iyileştirir.
Prosedürleri gösterenler, laboratuvarımdan ikisi olan Sulei ve Xiang olacak. Başlamadan önce, metin protokolünde açıklandığı gibi PDMS mikro kanal cihazlarını imal etmek için bir ana kalıp ve yumuşak litografi oluşturmak için standart fotolitografi kullanın. Mikrokanal cihazlarını hazırlamak için önce giriş ve çıkışı ince bir PDMS parçası ile kapatın ve cihazı ıslak mendil ile bir Petri kabının içine yerleştirin.
Ardından, çanağı Parafilm ile sarın ve cihazı en az üç saat boyunca UV ışığı altında sterilize edin. Bir sonraki adım fibronektini uygulamaktır. İlk olarak, girişe 30 ila 50 mikrolitre PBS damlatın.
Cihazı durulamak için çıkışta bir vakum oluşturun. Daha sonra, girişe mililitre fibronektin başına 100 mikrogramlık bir damla yerleştirin. Fibronektin çözeltisini yüklemek için çıkışta bir vakum oluşturun.
Ardından, girişi ve çıkışı kapatın. Çanağı tekrar Parafilm ile sarın ve cihazı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, cihazı PBS ile üç kez manuel olarak durulayın.
Ardından, 30 ila 50 mikrolitre hücre kültürü ortamı ile doldurun ve cihazı en az 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatörde ısıtın. HUVEC'leri mililitre başına iki ila dört milyon hücrede yüzde sekiz Dekstran ile HUVEC kültür ortamına karıştırarak başlayın. Dekstran, viskoziteyi arttırmak ve böylece hücre tohumlamasını iyileştirmek için gereklidir.
Daha sonra, girişin üzerine 10 ila 20 mikrolitre hücre koyun ve bunları yerçekimi kullanarak veya çıkıştaki bir cam pastör pipetinden kılcal hareket kullanarak tanıtın. Ardından, cihazı 15 ila 20 dakika inkübe edin. Ardından, tohumlama durumunu mikroskop altında kontrol edin.
Gerekirse, istenen hücre yoğunluğunu elde etmek için daha fazla hücre yükleyin. Yeterli hücre yüklendikten sonra, Dekstran'ı çıkarmak için cihazı normal, ılık hücre kültürü ortamıyla nazikçe durulayın. Ardından, cihazı altı saat boyunca herhangi bir ortam perfüzyonu olmadan kültürleyin.
Ardından, uzun süreli perfüzyon için boru bağlantılarını ayarlayın. Cihazı bir Petri kabına bantlayın ve ardından giriş borusunu bir iğne ile bir şırıngaya bağlayın. Hortumu cihazın hem girişine hem de çıkışına yerleştirin.
Çıkış borusunu bir atık toplayıcıya bağlayın. Şimdi, bulaşığı ve atık kabını bir kuluçka makinesine yerleştirin. Şırıngayı uzun bir giriş tüpü ile inkübatör kapısından geçen harici bir perfüzyon pompasına bağlayın.
Ardından, perfüzyon hızını deneysel tasarıma göre ayarlayın. İyi kontrol edilen bir perfüzyonla, mikrodamar ağındaki kültür iki haftaya kadar korunabilir. Bu nedenle, farklı fizyolojik ve patolojik durumlar üzerinde hücresel ve hemodinamik ortamı taklit eden daha uzun süreli çalışmalara genişletilebilir.
VE-kaderin etiketlemesi gibi immüno-boyamaya başlamak için, önce hücreleri dört santigrat derecede 30 dakika boyunca yüzde iki paraformaldehit ile perfüze ederek sabitleyin. Antikorlarla bloke etmek, geçirgenleştirmek ve lekelemek için bir dizi perfüzyondan sonra, hücreler görüntülenene kadar cihazı dört santigrat derecede tutun. Hücrelerdeki kalsiyum konsantrasyonunu görüntülemek için, cihazı 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca Ringer çözeltisinde mililitre albümin başına 10 miligram ile perfüze edin.
Daha sonra, cihazı 37 santigrat derecede 40 dakika boyunca beş mikromolar Fluo-4 ile perfüze edin. Ardından, lümene bağlı Fluo-4'yi albümin Ringers ile 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca yıkayın. Ardından, Fluo-4 ile hücreler arası kalsiyum seviyesi görüntüleme için konfokal sistemi başlatın. Fluo-4 yüklü mikro damarların görüntülerini elde edin.
Temel görüntüleri 10 dakika boyunca toplayın. Ardından, cihazı 10 mikromolar ATP ile sürekli olarak perfüze edin ve floresan yoğunluğundaki değişiklikleri 20 dakika boyunca kaydedin. Hücrelerdeki nitrik oksit üretimini görüntülemek için, cihazı 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca albümin Ringers ile perfüze edin.
Daha sonra, hücreleri 5 mikromolar DAF-2 DA ile 37 santigrat derecede yaklaşık 35 ila 40 dakika perfüze edin. Ardından, ATP'nin neden olduğu nitrik oksit üretimini ölçmek için floresan görüntüleme sistemini kurun. Taban çizgisini 5 dakika boyunca kaydedin, ardından cihazı 10 mikromolar ATP ile perfüze edin ve görüntüleri bir dakikalık aralıklarla 30 dakika boyunca toplayın.
Hücre nitrik oksit ölçümü için, yoğunluk profili için ayırma adaptörünün bir nitrik oksit konsantrasyonunu değil, zamanla kümülatif bir nitrik oksit üretimini temsil ettiğini anlamak önemlidir. Toplanan görüntülerden tek tek hücre düzeyinde ilgi bölgesini manuel olarak seçin. Her ROI, floresense taslağı ile gösterilebilen bir bireyin hücresinin alanını kapsar.
Endotelyal kalsiyum ve nitrik oksitte ATP'nin neden olduğu değişiklikleri ölçün. Fluo-4'ün floresense yoğunluğundaki değişiklikleri hesaplayarak, doku arka planı daha azdır. Zaman içinde DAF-2'nin floresense yoğunluğunun ilk diferansiyel dönüşümünü gerçekleştirerek azot oksit üretim hızını ölçün.
Cihazdaki mikro kanal deseni, üç seviyeli bir dallanma ağına sahiptir. Dakikada 0,35 mikrolitre akış hızı altında kesme gerilimi dağılımlarını tahmin etmek için bir 3D sayısal simülasyon gerçekleştirildi. Endotel hücreleri tarif edildiği gibi ağa tohumlanıyordu.
Daha sonra F-aktin ve çekirdekler etiketlendi. Benzer şekilde, VE-cadherin de lekelendi. Sonuçlar, sağlam bir venüldeki VE-kaderin ekspresyonuna benzerdi.
Daha sonra, hücre içi kalsiyum ve nitrik oksit üretiminde ATP'ye bağlı artışlar incelendi. Kalsiyum seviyeleri, protokol bölümünde anlatıldığı gibi Fluo-4 kullanılarak incelendi. Nitrik oksit üretimi, protokol bölümünde açıklandığı gibi DAF-2 DA kullanılarak izlendi.
Sonuçlar, ayrı ayrı perfüze edilmiş bozulmamış venüllerle türetilenlerle karşılaştırılabilirdi. Gelişmiş, biyolojik koşullarda ve dinamik akışkan ortamlarda kolay ve sıkı bir şekilde kontrol edildi, bu da geleneksel mikro beceri teknikleriyle mümkün olmayacaktı. Bu videoyu izledikten sonra, cihazın nasıl üretileceğini ve kalsiyum ve nitrik oksit ölçümlerinin nasıl yapıldığını iyi anlamalısınız.
Bu teknik, araştırmacıların sadece altta yatan agonist kaynaklı araştırmaları için değil, aynı zamanda biyomedikal araştırmalar için daha geniş uygulamalar açmaları için de yol açtı.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, fizyolojik olarak ilgili koşullar altında endotel hücrelerinin büyümesini destekleyen bir mikroakışkan cihaz geliştirmeye odaklanmaktadır. Tek hücre düzeyinde ATP'ye verilen tepkide kalsiyum ve nitrik oksit üretimindeki değişiklikleri ölçer.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikroakışkan
- Endotel hücre biyolojisi
- Kalsiyum sinyalizasyonu
Arka Plan
- Endotel hücreleri, vasküler biyolojide kritik bir rol oynar.
- Mikroakışkan cihazlar, hücre kültürü için in vivo ortamlarını taklit edebilir.
- Kalsiyum ve nitrik oksit, endotel fonksiyonunda önemli sinyal molekülleridir.
- Geleneksel statik kültürler fizyolojik koşulları doğru bir şekilde temsil etmez.
Çalışmanın Amacı
- Bir in vitro mikrodamar modelini doğrulamak.
- In vivo ve in vitro çalışmalar arasındaki boşlukları doldurmak.
- ATP'ye hücresel gerçek zamanlı tepkileri ölçmek.
Kullanılan Yöntemler
- Bir ana kalıp oluşturmak için fotolitografi.
- PDMS mikrokanal cihazlarını üretmek için yumuşak litografi.
- Birincil insan göbek kordonu damar endotel hücrelerinin (HUVEC) hücre kültürü.
- İntraselüler kalsiyum ve nitrik oksit seviyelerinin gerçek zamanlı kantitasyonu.
Ana Sonuçlar
- Mikroakışkan ağda HUVEC'lerin başarılı büyümesi.
- Endotel hücre kavşaklarının ve F-aktin dağılımlarının görselleştirilmesi.
- ATP'nin neden olduğu kalsiyum konsantrasyonundaki değişikliklerin gerçek zamanlı ölçümü.
- ATP'ye tepki olarak nitrik oksit üretiminin kantitasyonu.
Sonuçlar
- Mikroakışkan cihaz fizyolojik koşulları etkili bir şekilde taklit eder.
- Bu yaklaşım, endotel hücre sinyalizasyonu hakkındaki anlayışı geliştirir.
- Gelecekteki mikrodamar araştırmaları için değerli bir araç sağlar.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Physiologically relevant in vitro microvessel models are critical for bridging the translational gap between static cell culture and in vivo vascular biology. Quantitative measurement of endothelial calcium and nitric oxide responses under controlled flow conditions enhances predictive confidence in early vascular target validation. This platform supports robust mechanistic de-risking and informs portfolio decisions for vascular-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of endothelial signaling pathways under physiologically relevant flow.
- Supports functional validation of vascular targets through real-time calcium and nitric oxide readouts.
- Facilitates mechanistic de-risking by modeling dynamic vascular environments.
- Improves predictive confidence for vascular biology programs.
Screening & Assay Development
- Provides a validated microfluidic platform for quantitative, reproducible endothelial assays.
- Enables high-resolution, single-cell measurement of agonist-induced responses.
- Supports assay standardization and scalability for compound screening.
- Prepares robust biological systems for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro endothelial responses with in vivo vascular phenotypes.
- Enables investigation of patient-derived blood components on human endothelial cells.
- Supports translational biomarker discovery for vascular function.
- Provides continuity from discovery through preclinical vascular validation.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic microvessel model integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting early target validation, assay development, and translational research for vascular biology programs.
- Discovery Biology: Quantitative calcium and nitric oxide measurements clarify endothelial signaling mechanisms.
- Screening: Platform readiness and reproducibility enable reliable compound evaluation.
- Analytics: Real-time fluorescence imaging provides robust quantitative outputs for condition comparison.
- Translational Research: Patient sample testing supports disease-relevant system modeling.
- Enterprise Reuse: Versatile device design allows adaptation across vascular research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in vascular target validation.
- Operational Value: Standardizes endothelial assays with scalable, reproducible microfluidic platforms.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk for vascular programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of vascular-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication and endothelial cell culture.
- Needs access to confocal or fluorescence microscopy for quantitative imaging.
- Demands cross-team standardization of assay protocols and data analysis.
- Adaptable to primary human endothelial cells and patient-derived samples.
- Limited to in vitro modeling; physiological complexity may require further validation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Preparing the Microchannel Device for Cell Seeding
2:37
Endothelial Cell Seeding and Long-term Perfusion
4:38
Immunofluorescent Staining and Imaging Calcium Concentration or Nitric Oxide Production
6:39
Data Analysis
7:35
Results: Endothelial Cell Culture Under Shear Stress
8:39
Conclusion
