Name: Gelişim ve karakterizasyonu İn Vitro Mikrodamar Ağ ve Endotel kantitatif ölçümleri Ca 2+ I Ve Nitrik Oksit Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Öğrenin, mikroakışkan cihazlar kullanarak endotelyal hücrelerde kalsiyum ve nitrik oksit üretimini nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, mikrodamar araştırmaları için fizyolojik koşulları taklit eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü tarafından desteklenen HL56237, Diyabet, Sindirim Ulusal Enstitüsü ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü DK97391-03, Ulusal Bilim Vakfı (NSF-1227359 ve EPS-1003907) verir.

1. mikroakışkan Aygıt Fabrikasyon <ol><li> Bir SU-8 50 Ana Kalıp Standart Fotolitografi İmalatı <ol><li> Spin-kaplama öncesi silikon gofret temizleyin. 15 dakika boyunca, izopropil alkol (IPA) ve ardından 15 dakika boyunca aseton ile çıplak 2 inç silikon gofret durulayın. 1 saat süre ile 150 ° C&#39;de bir sıcak plaka üzerinde yerleştirerek gofret kurutmak. Dehidrasyon sonra, oda sıcaklığında, gofret soğutulur. </li><li> Spin-kat SU-8 fotorezist ile silikon gofret. gofret üzerine 2 ml SU-8 ışığa ekleyin. 30 saniye için 300 dev / san hızlanma 1.000 rpm, ardından 10 saniye boyunca 100 rpm / saniye hızlanma 500 rpm e gofret rampası. (İlave video 1&#39;e bakınız) </li><li> Ön fırında 30 dakika boyunca 95 ° C&#39;de 10 dakika, daha sonra yumuşak bir fırında 65 ° C&#39;de bir sıcak plaka üzerinde gofret. </li><li> Spin-kaplı paslanmaz çeliğin bir filmin maskesi tasarlanmış desen dönüştürmek için UV ışınlarına maruz kalma kullanın. film maskesi gibi ince şeffaf film desen yazdırın. üstüne bir film maske yerleştirinışığa kaplı-spin ve 300 mJ / cm2 dozda UV maruz. (İlave video 2&#39;ye bakınız) Not: Bu protokol, mikrokanal ağı deseni (159 mikron genişliğinde anne kanalları dört 100 mikron genişliğinde kızı kanallarına dallanma) CAD yazılımları ile tasarlanmıştır. Filmde desen net bir alan olarak gösterir ve filmin geri kalanı siyah mürekkep ile kaplıdır. SU-8 negatif fotorezist olduğundan, UV maruz fotorezist kısmı çapraz olacak ve kalıp geliştirme (adım 1.1.6) sırasında solvent çözünmez hale gelecektir. geliştikten sonra, bu çözülmeyen kısım tasarlanmış ağ deseni çoğaltılacak ve bir ana kalıp olarak hizmet vermektedir. </li><li> Mesaj fırında 1 dakika, 10 dakika boyunca, sonra 95 ° C, 65 ° C &#39;de sıcak bir plaka üzerinde ortaya gofret. </li><li> ana kalıp geliştirin. çözücü olarak kullanın SU-8 geliştirici un çapraz bağlı fotodirencin kaldırmak için. 3 dakika SU-8 geliştirici gofret daldırın ve IPA ile durulayın1 dakika karıştırıldı. </li><li> IPA durulama sonra hiçbir beyaz bir çizgi oluşumu (non-tedavi fotorezist kalıntısı) kalmayıncaya kadar bu gelişen döngüsü 2-3 kez tekrarlayın. Yavaşça nitrojen gazı ile gofret kurulayın ve mikroskop altında desen küçük özelliklerini incelemek. Gerekirse ek gelişmekte döngüleri tekrarlayın. </li><li> Sert 15 dakika boyunca 150 ° C&#39;de bir sıcak plaka üzerinde gofret fırında. </li></ol></li><li> yumuşak Litografi <ol><li> El ile bir ağırlık iki parça polidimetilsiloksan (PDMS) elastomer (taban ve sertleştirici) karıştırın. 10: 1 oranındadır. </li><li> Gazlardan, 15 dakika boyunca, bir ev tipi vakum ile bağlı bir desikatör PDMS karışımı ile gerçekleştirilmektedir. fotorezist ana kalıp üzerinde PDMS çözüm Cast. PDMS kalınlığı giriş / çıkış boru istikrarlı bir tutma sağlamak için fazla 3 mm olması gerekir. Gazlardan, 15 dakika boyunca daha PDMS ve gerekirse azot gazı ile kalan hava kabarcıklarını çıkarmak. 3 saat 65 ° C sıcaklıkta bir fırın içinde döküm PDMS Cure. </li><li> yüzeyini temizleyinBir kapaklar ve plazma temizleyici (30 sn plazma tedavisi) ile cam lamel. 30 sn 500 devir / sn hızlanma hızında 4,000 rpm ramping cam lamel Spin-kat un tedavi PDMS (0.5 ml). En az 30 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta bir fırın içinde PDMS spin kaplı lamel Cure. </li><li> Kes ve ana kalıp tedavi PDMS serbest bırakın. Daha sonra bir giriş ve ana kanal uzak ucunda bir 1 mm çapındaki bir delik zımba ile bir çıkış oluşturur. </li><li> PDMS spin kaplı cam lamel cihazı Bond. PDMS yüzeyleri oksitlenmesi ve 1 dakika süre ile ve plazma ile lamel. oksijen plazma muamelesinden sonra, yapışma yüzeyi deiyonize su (Di su) bir damlacık yerleştirin ve iki parçayı yerleştirin. sürekli bir bağlantı sağlamak için 30 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta bir fırın içinde cihazı pişirin. </li></ol></li></ol><img alt="Ek Video 1" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie1.jpg"/&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_1.mp4" target="_blank">Ek Video 1 (Sağ indirmek için tıklayın).</a> <img alt="Ek Video 2" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_2.mp4" target="_blank">Ek Video 2 (Sağ indirmek için tıklayın).</a> 2. Endotel Hücre Tohum ve Kültür <ol><li> Cihaz Sterilizasyon ve Fibronektin Kaplama <ol><li> oksidasyondan giriş / çıkış çevresinde en PDMS yüzeyinin hidrofobik özelliği korur. giriş etrafında PDMS yüzeyini kaplayan ve oksidasyonu önlemek için kapaklar küçük çizgili çıkış. Bu prosedür doldurma aşamasında (2.1.3) sırasında cihazın üst yüzeyi üzerinde her yayılmasını distile su önleyebilir. </li><li> oksijen plazma fo ile PDMS cihaz tedaviR5 dakika, böylece yüzeyi hidrofilik olacak şekilde değiştirin mikrokanal sıvı akışını kolaylaştırmak ve doldurma prosedürü (2.1.3) &#39;de bindirme kabarcık önler. </li><li> girişten DI suyla cihazı doldurmak için bağlı bir iğne veya bir pipet ile bir şırınga kullanabilirsiniz. çıkışında kartı DI su (30-50 ul), bir damla olana kadar doldurmaya devam edin. Mikrokanallı içinde sıkışıp kabarcıklar olup olmadığını kontrol etmek mikroskop altında cihazı inceleyin. Bir kağıt mendille giriş ve çıkışında aşırı su damlacığı çıkarın. </li><li> laminer biyo-güvenlik başlığı içinde, 3 saat içinde en az UV ile bir petri ürünü sterilize. , Buharlaşmayı önlemek PDMS ince bir parça ile giriş / çıkış karşılamak için çanak içinde ıslak kağıt mendil koymak ve Parafilm çanak sarın. </li><li> Coat fibronektin cihaz. (Buzdolabı / ml fibronektin gece boyunca 100 ug ile kat daha sonra, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile ilk önce cihaz yıkayın4 ° C). girişinde bir çözelti damla yerleştirin ve daha sonra bir ev tipi vakum, bir iğne ya da bir pipet ile bir şırınga ile çıkışında negatif bir basınç oluşturur. </li><li> Hücre kültür ortamı cihazı doldurun. Hücre kültürü ortamını yüklemeden önce 3 kez elle PBS ile cihazı durulayın. 37 ° C&#39;de bir kuluçka cihazı ısıtın. </li></ol></li><li> EC Tohum ve Uzun Vadeli Perfüzyon Not: geleneksel statik 2D AK kültürü ile karşılaştırıldığında, sürekli perfüzyon ile in vitro mikrovasküler ağ modeli daha yakın in vivo koşullara hücre kültür ortamı yaptı. Bu protokolde ortaya konulabilir, in vitro mikro-damar ağı iki hafta kadar muhafaza edilebilir. iyi kontrol perfüzyon sürekli besin doldurmak atıkları kaldırmak ve aşırı izdiham AT tek tabaka önleyecektir. Bu nedenle, farklı physiologica altında cep ve hemodinamik ortamı taklit eden, daha uzun süreli çalışmalar uzatılabilirL ve patolojik durumlar. <ol><li> % 8 dekstran (ağırlıkça mol 70,000) ile HUVEC kültür ortamı birincil HUVECler (MCDB 131) karıştırın. dekstran ortam yükleme viskozitesini arttırır ve daha iyi bir hücre ekim sonucu elde etmek için kullanılır. Tavsiye hücre yoğunluğu yaklaşık 2-4 x 10 6 hücre / ml &#39;dir. </li><li> cihazın içine hücreleri tohumu. giriş üzerinde bir hücre 10-20 ul damlacık yerleştirin. Her iki cihaz eğerek ya da kılcal eylem çıkışında bir cam Pasteur pipeti kullanarak yumuşak bir akış tanıtmak. Başarılı bir hücre yükleme için temel akış hızı küçük kanalları içinde en az 1 mm / sn kontrol etmektir. </li><li> hücre tohumlama kontrol edin. İlk tohumlama sonra, mikroskop altında tohumlama durumunu kontrol etmeden önce 15-20 dakika (37 ° C&#39;de% 5 CO 2 nemlendirilmiş atmosfer) Cihazı kuluçkaya yatmaktadır. Gerekirse arzu edilen bir hücre yoğunluğu elde etmek için ek hücre yükleme yapar. </li><li> Yavaşça (37 hücre kültür ortamı ile yıkayın cihazı° C) dekstran kaldırmak için. Kültür (37 ° C&#39;de% 5 CO2) bir kuluçka makinesi içinde, ilk 6 saat akış yokluğunda cihazı. </li><li> Uzun vadeli perfüzyon için boru bağlantısı kurmak. hareket etmesini önlemek için bir petri çanağı içine cihazı kaydet. giriş ve çıkış boru eklemeler için Petri kabı kapağına küçük delikler oluşturun. hücre kültür ortamı perfüzyon için bir iğne ile bir şırıngaya giriş boru bağlayın. Bir atık toplayıcıya çıkış tüpünü bağlayın. Not: Yer cihaz ve bir hücre kültürü inkübatör atık toplayıcısı, inkübatör dışında bir perfüzyon pompası yerleştirerek ve uzun giriş boru ile cihazla bağlayın. perfüzyon oranı deney tasarımı ile belirlenir. Bu cihazda, 0.35 ul / dk&#39;lık bir perfüzyon oranı ve 1-2 din / cm2 arasında bir kesme stresi aralığı kullanın. Bu perfüzyon koşul altında, HUVECler yaklaşık 3-4 gün içinde izdiham ulaşmak. </li></ol></li></ol> 3. Benmmunofluorescent Boyama <ol><li> 30, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında durulama 1x PBS ardından 4 ° C&#39;de dakikada, ve 30 dakika için bloke% 1 BSA,% 2 paraformaldehit perfüzyon cihazı ECS sabitleyin. Hücre kültürü için kullanılan ile aynı olan bir perfüzyon oranı kullanın. </li><li> % 0.1 Triton X-100 ile antikor boyama için sabit ECS geçirgenliği. etikete 5-7 dakika süreyle Triton cihazı serpmek-VE kaderin ve etiket F-aktin 3 dk. </li><li> cihazın içine antikorlar yükleyin. Önceki çözümler yıkamak için 15 dakika süreyle 1x PBS ile cihazı serpmek. El ile 2 ug / ml (toplam hacim 20-50 ul) konsantrasyonda cihaza VE-cadherin (anti-keçi) karşı birincil antikor yükleyin. 4 ° C&#39;de bir buzdolabı içinde gece boyunca cihazı tutun. 45-60 dakika boyunca 7 ug / ml konsantrasyonunda da bir şırınga pompası ile ikincil antikoru (eşek anti-keçi) serpmek. </li><li> AK F-aktin Etiket Phalloidin ile. 1x PBS Besin cihazı serpmekEl 7-10 dakika boyunca Phalloidin (10 ug / ml) yüklemeden önce R15 Min. </li><li> Etiket AK çekirdekler (Malzeme Listesine bakınız). </li><li> 1X PBS ile durulayın cihaz ve görüntüleme kadar 4 ° C &#39;de muhafaza. </li></ol> Endotel 4. Floresans Görüntüleme [Ca2 +] i <ol><li> albümin ile cihaz (10 mg / ml), 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca -Ringer çözümünü serpmek. Bu hücre kültürü için kullanılan aynı perfüzyon hızı kullanın. Albümine Ringer çözeltisi tüm bileşenlerin konsantrasyonları Malzeme Listesi açıklanmaktadır. </li><li> EC [Ca 2 +] i fluo-4 AM görüntüleme için konfokal sistem kurmak. Ca 2+ görüntüleme için bir konfokal mikroskobik sistemi kullanın. uyarma için bir argon lazer (488 nm) kullanın ve 510-530 nm emisyon bandı ayarlayın. 512 x 512 tarama formatında: (0.95, suya daldırma NA) bir 25X amacı ile görüntüleri toplamak. her i yığınının 2 um z adım ve bir tarama aralığı kullanın20 saniye mages. </li><li> albümine Ringer solüsyonu ile lümen fluo-4 AM yıkamak, ardından 37 ° C&#39;de 40 dakika boyunca Fluo-4 AM (5 uM) ile cihaz serpmek. </li><li> fluo-4 yüklü mikrodamarlar görüntü kazanır. 10 dakika boyunca temel görüntü toplayın. ATP (10 uM) ile cihaz serpmek ve 20 dakika floresan yoğunluğu (FI) değişiklikleri kaydeder. </li></ol> Nitrik Oksit Üretim 5. Floresans Görüntüleme <ol><li> 15 dakika boyunca, albümin-Ringer çözeltisi cihazı serpmek. Hücre kültürü için kullanılan ile aynı olan bir perfüzyon oranı kullanın. </li><li> ATP kaynaklı nitrik oksit üretimini ölçmek için floresan görüntüleme sistemi kurmak. Bir 12-bit dijital CCD kamera ve nitrik oksit ölçümü için bilgisayar kontrollü bir çekim ile donatılmış bir mikroskop kullanarak. Işık kaynağı olarak 75 W bir ksenon lambasını kullanarak. Not: bir girişim filtresi (480/40) ve dikroik ayna DAF-2 DA için uyarılma ve emisyon dalga boyu seçinbir band geçiren bariyer ile (505 nm) (535/50 nm). görüntüleri toplamak için: 20X objektif lens (0.75 NA) kullanın. photobleaching en aza indirmek için, parazit filtrenin önüne bir nötral yoğunluk filtresi (0.5 N) pozisyonuna ve 0.12 sn pozlama süresini sınırlamak. </li><li> DAF-2 DA (5 mcM) hücreleri yükleyin. 37 ° C&#39;de yaklaşık 35-40 dakika boyunca DAF-2 DA cihazı serpmek. İlk yüklemeden sonra DAF-2 floresan yoğunluğu (FI DAF) ve temel kaydedin. Not: DAF-2 DA deney 7 boyunca perfüzat sürekli mevcuttur. </li><li> DAF-2 görüntüleri toplamak. 5 dakika boyunca FI DAF temel kaydedin. ATP (10 uM) ile cihaz serpmek ve 1 dakika aralıklar ile 30 dakika boyunca görsel imajı. Aynı odak düzlemi hücrelerin aynı grup tüm görüntüleri toplayın. </li></ol> 6. Veri Analizi <ol><li> Elle tek tek hücre düzeyinde toplanan görüntülerden çıkarları (ROI) bölgeyi seçin. HerYG floresan anahat gösterilebilir bir hücrenin teker teker alanı kaplamaktadır. </li><li> Arka plan floresan çıkarma ve her ROI ortalama FI hesaplayın. </li><li> EC ATP kaynaklı değişiklikleri ölçmek [Ca2 +] i ve NO üretimi. (FI 0 albümin-Ringer perfüzyon sırasında ortalama bazal FI ATP eklemeden önce olduğu FI / FI 0 * 100) Flu-4 FI değişiklikleri hesaplayarak EC [Ca 2 +] i ATP kaynaklı değişiklikleri ölçmek eksi ölçülür arka plan. Zamanla FI DAF ilk diferansiyel dönüşüm yaparak YOK üretim hızını ölçmek. Not: FI DAF zaman ders süresi ile kümülatif NO üretimini temsil eder. Bu nedenle, NO üretim hızı bazal ve ATP koşulları uyarılmış hem altında FI DAF profiline göre hesaplanır. Veri analizi ve deneysel prosedürler ayrıntıları daha önce yayın 7&#39;de tarif edilmiştir. </li></ol>

<ol><li>Curry, F. R. E., Adamson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability+modulation+at+the+cell%2C+microvessel%2C+or+whole+organ+level%3A+towards+closing+gaps+in+our+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge.</a> Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).</li>
<li>Michel, C. C., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Microvascular permeability.</a> Physiol Rev. 79, 703-761 (1999).</li>
<li>Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Today%22%5BJournal%5D)">Recent progress in soft lithography.</a> Mater Today. 8, 50-56 (2005).</li>
<li>Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+present+and+future+role+of+microfluidics+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The present and future role of microfluidics in biomedical research.</a> Nature. 507, 181-189 (2014).</li>
<li>Li, X., Xu, S., He, P., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+recapitulation+of+functional+microvessels+for+the+study+of+endothelial+shear+response%2C+nitric+oxide+and+%5BCa2%2B%5DI%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro recapitulation of functional microvessels for the study of endothelial shear response, nitric oxide and [Ca2+]I.</a> PLoS One. 10, 0126797(2015).</li>
<li>He, P., Pagakis, S. N., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cytoplasmic+calcium+in+single+microvessels+with+increased+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Measurement of cytoplasmic calcium in single microvessels with increased permeability.</a> Am J Physiol. 258, 1366-1374 (1990).</li>
<li>Zhou, X., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+measurements+of+intracellular+nitric+oxide+in+intact+microvessels+using+4%2C5-diaminofluorescein+diacetate%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Heart+C%22%5BJournal%5D)">Improved measurements of intracellular nitric oxide in intact microvessels using 4,5-diaminofluorescein diacetate.</a> Am J Physiol-Heart C. 301, 108-114 (2011).</li>
<li>Yuan, D., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+remodeling+alters+adhesion+protein+and+cytoskeleton+reactions+to+inflammatory+stimuli+resulting+in+enhanced+permeability+increases+in+rat+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules.</a> Journal of Applied Physiology. 113, 1110-1120 (2012).</li>
<li>He, P., Zhang, X., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+entry+through+conductive+pathway+modulates+receptor-mediated+increase+in+microvessel+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ entry through conductive pathway modulates receptor-mediated increase in microvessel permeability.</a> Am J Physiol. 271, 2377-2387 (1996).</li>
<li>Zhou, X., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+%5BCa2%2B%5Di+and+caveolin-1+antagonistically+regulate+eNOS+activity+and+microvessel+permeability+in+rat+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial [Ca2+]i and caveolin-1 antagonistically regulate eNOS activity and microvessel permeability in rat venules.</a> Cardiovasc Res. 87, 340-347 (2010).</li>
<li>Zhu, L., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-activating+factor+increases+endothelial+%5BCa2%2B%5D+i+and+NO+production+in+individually+perfused+intact+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Heart+C%22%5BJournal%5D)">Platelet-activating factor increases endothelial [Ca2+] i and NO production in individually perfused intact microvessels.</a> Am J Physiol-Heart C. 288, 2869-2877 (2005).</li>
<li>He, P., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depolarization+modulates+endothelial+cell+calcium+influx+and+microvessel+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Depolarization modulates endothelial cell calcium influx and microvessel permeability.</a> Am J Physiol. 261, 1246-1254 (1991).</li>
<li>He, P., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+hyperpolarization+increases+%5BCa2%2B%5Di+and+venular+microvessel+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell hyperpolarization increases [Ca2+]i and venular microvessel permeability.</a> J Appl Physiol. 76 (1985), 2288-2297 (1994).</li>
<li>Xu, S., Zhou, X., Yuan, D., Xu, Y., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin-1+scaffolding+domain+promotes+leukocyte+adhesion+by+reduced+basal+endothelial+nitric+oxide-mediated+ICAM-1+phosphorylation+in+rat+mesenteric+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Caveolin-1 scaffolding domain promotes leukocyte adhesion by reduced basal endothelial nitric oxide-mediated ICAM-1 phosphorylation in rat mesenteric venules.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305, 1484-1493 (2013).</li>
<li>Zadeh, M. H., Glass, C. A., Magnussen, A., Hancox, J. C., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-Mediated+Elevated+Intracellular+Calcium+and+Angiogenesis+in+Human+Microvascular+Endothelial+Cells+In+Vitro+are+Inhibited+by+Dominant+Negative+TRPC6%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial Cells In Vitro are Inhibited by Dominant Negative TRPC6.</a> Microcirculation. 15, 605-614 (2008).</li>
<li>Tsai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+the+microvascular+occlusion+and+thrombosis+that+occur+in+hematologic+diseases+using+microfluidic+technology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology.</a> The Journal of clinical investigation. 122, 408-418 (2012).</li>
<li>Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+functional%2C+perfusable+3D+microvascular+networks+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip.</a> Lab Chip. 13, 1489-1500 (2013).</li>
<li>D'Amico Oblak, T., Root, P., Spence, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+monitoring+of+ATP-stimulated%2C+endothelium-derived+nitric+oxide+production+in+channels+of+a+poly%28dimethylsiloxane%29-based+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescence monitoring of ATP-stimulated, endothelium-derived nitric oxide production in channels of a poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic device.</a> Analytical chemistry. 78, 3193-3197 (2006).</li>
<li>Zhou, X. P., Yuan, D., Wang, M. X., He, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2O2-induced+endothelial+NO+production+contributes+to+vascular+cell+apoptosis+and+increased+permeability+in+rat+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Heart+C%22%5BJournal%5D)">H2O2-induced endothelial NO production contributes to vascular cell apoptosis and increased permeability in rat venules.</a> Am J Physiol-Heart C. 304, 82-93 (2013).</li>
<li>Lee, P. J., Hung, P. J., Rao, V. M., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+scale+microbioreactor+array+for+quantitative+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology.</a> Biotechnol Bioeng. 94, 5-14 (2006).</li>
<li>Zakrzewicz, A., Secomb, T. W., Pries, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angioadaptation%3A+Keeping+the+Vascular+System+in+Shape%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Angioadaptation: Keeping the Vascular System in Shape.</a> Physiology. 17, 197-201 (2002).</li>
<li>Lipowsky, H. H., Kovalcheck, S., Zweifach, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+blood+rheological+parameters+in+the+microvasculature+of+cat+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The distribution of blood rheological parameters in the microvasculature of cat mesentery.</a> Circulation Research. 43, 738-749 (1978).</li>
<li>Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+the+tumor-lymphatic+microenvironment+with+simultaneous+transendothelial+and+luminal+flows+reveals+mechanisms+of+flow+enhanced+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion.</a> Integr Biol (Camb). 7, 525-533 (2015).</li>
<li>McCann, J. A., Peterson, S. D., Plesniak, M. W., Webster, T. J., Haberstroh, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-uniform+flow+behavior+in+a+parallel+plate+flow+chamber+%3A+alters+endothelial+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Non-uniform flow behavior in a parallel plate flow chamber : alters endothelial cell responses.</a> Ann Biomed Eng. 33, 328-336 (2005).</li>
<li>Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+venular+microvessel+permeability+by+calcium+influx+into+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Modulation of venular microvessel permeability by calcium influx into endothelial cells.</a> FASEB J. 6, 2456-2466 (1992).</li>
<li>Kojima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+imaging+of+nitric+oxide+with+novel+fluorescent+indicators%3A+diaminofluoresceins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins.</a> Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).</li>
<li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+the+future+of+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li>
<li>Lamberti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinspired+microfluidic+assay+for+in+vitro+modeling+of+leukocyte-endothelium+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions.</a> Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).</li>
<li>Myers, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelialized+microfluidics+for+studying+microvascular+interactions+in+hematologic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Shear+Adhesion+Map+Using+SynVivo+Synthetic+Microvascular+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Jove-J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks.</a> Jove-J Vis Exp. , e51025(2014).</li>
<li>Booth, R., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+microfluidic+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+%28iBBB%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB).</a> Lab on a Chip. 12, (vol 12, pg 1784, 2012) 5282-5282 (2012).</li>
<li>Shao, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+microfluidic+chip+for+endothelial+cells+culture+and+analysis+exposed+to+a+pulsatile+and+oscillatory+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress.</a> Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).</li>
<li>Yeon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+permeability+assay+system+in+a+microfluidic+device+mimicking+cerebral+vasculatures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures.</a> Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).</li>
<li>Golden, A. P., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microfluidic+hydrogels+using+molded+gelatin+as+a+sacrificial+element%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element.</a> Lab Chip. 7, 720-725 (2007).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+microvessels+for+the+study+of+angiogenesis+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).</li>
<li>Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+embedded+within+extracellular+matrix+to+define+vascular+architectures+and+pattern+diffusive+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients.</a> Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir rakip çıkarları veya çakışan çıkarları var.

<html> Bu yazıda, kültürlü mikrovasküler ağının geliştirilmesi için ayrıntılı protokoller mevcut, AK kavşak ve F-aktin dağıtım hücre iskeleti karakterizasyonu ve AT&#39;nin kantitatif ölçümler [Ca2 +] i ve bir mikroakışkan cihaz kullanarak NO üretimi. Perfüze mikroakışkan cihaz in vivo mikrovasküler geometri ve kayma akış koşulları yakın simülasyon sağlayan bir in vitro model sağlar. kültürlü mikrovasküler ağ birincil insan EC tarafından oluşturulabilir, bu yaklaşım hasta örnekleri...

In vivo olarak, kan damarı duvarlarını oluşturan endothelial hücreleri (EC), sürekli akıma maruz kalması ama kültür EC, genellikle statik koşullar altında yetiştirilen ve pro-enflamatuar bir fenotip 1,2 sergilemektedir. Mikroakiskan teknolojisi, istenen akış koşulları altında büyümek, özellikle damar EC&#39;ler için, kültürlenmiş hücreler için bir fırsat sağlar geometrik kısıtlı mikro (alt milimetre) kanallar 3 ile hassas bir şekilde kontrol sıvısı sağlar. Bu özellikler, geleneksel statik 2B hücre kültürlerinde daha etkin in vivo hücre kültürü koşulları daha yakın hale. Onlar mikroakışkan cihazlar vaskülatürlerden farklı modellemek için kullanılır ve mekanik ve / veya kimyasal uyarılara AT yanıtları incelemek için zaman son derece önemlidir. statik hücre kültürü, biyomedikal f adaptasyon ve Mikroakiskan uygulama üzerinde mikro ağı gösterdiği avantajlara rağmenield sınırlı kalır. Son gözden tarafından bildirilen bu alanda (% 85) yayınların çoğunluğu mühendislik dergilerinde 4 hala. mikroakışkan cihazların performansı çoğu biyolog gibi Transwell tahlil ve bu minyatürize cihaza makro ölçekli kültür çanak / cam slayt olarak mevcut tekniklerle geçiş için yeterli inandırıcı olmamıştır. Mikroakiskan ileriye bu alanı taşımak için disiplinler arası işbirliklerini gerektiren multidisipliner bir alandır. Bu teknik makalenin amacı, biyolojik uygulama ve mikroakışkan mikrodamarlar işlevsel doğrulama sağlarken, disiplinler arasındaki bilgi farkının azaltılması ve biyologlar tarafından fabrikasyon prosedürleri anlaşılır hale getirmektir. görüntülenmiştir deneysel protokoller mikroakışkan cihazlar ve mühendis ve biyolog arasında yakın bir işbirliğini temsil biyolojik yarar, hem de imalat içerir. Biz son zamanlarda bazı bildirildiMikroakışkan cihaz 5 ile in vitro mikrovasküler ağını kullanarak biyolojik uygulamalar. uygun istenilen kayma gerilmesini mikrokanal ağı boyutlarını tasarım ve uygulamak için, bir sayısal model yakından akış profili tahmin etmek bilgisayarlı akışkan dinamik yazılımı ile inşa edilmiştir. Örneğin, bir araya gelerek konfluens mikro serpildi Primer insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC&#39;ler), sürekli perfüzyonla 3-4 gün içinde, mikrokanalın tüm iç yüzeylere sahiptir. Uygun bir bariyer oluşturulması, statik hücre kültürü koşulları altında ve bozulmamış mikrodamarlar oluşan kıyasla VE-cadherin boyamasıyla gösterilmiştir ve daha. Bireysel perfüze sağlam mikrodamarlar 6-8 geliştirilen deneysel protokolleri uygulayarak, kantitatif EC değişiklikleri ölçülen [Ca2 +] i ve nitrik oksit (NO) floresan içinde olan adenozin trifosfat (ATP) cevaben üretimigöstergeleri ve konfokal ve konvansiyonel floresan mikroskobu. EC agonist kaynaklı artışlar [Ca2 +] i ve NO üretimi mikrodamar geçirgenliği 6-15 inflamatuar medyatör ile endüklenmiş artışından kaynaklandığını için gerekli olan hücre içi sinyaller olarak bildirilmiştir. Önceki bazı çalışmalarda DAF-2 DA yüklü mikroakışkan cihazlar 16,17 görüntülerini gösterdi rağmen, uygun çözünürlük ve veri analizi henüz 18 elde etmemişti. Bildiğimiz kadarıyla, bu çalışma endotelyal agonist kaynaklı dinamik değişim [Ca2 +] i ve NO üretimi kullanan mikroakışkan tabanlı sistem ilk nicel ölçümlerini göstermektedir. Imalat teknikleri birkaç mikron mikrokanallar aşağı imal ve in vivo mikrovasküler geometrileri taklit etmek karmaşık desenleri gelişmesini sağlamak için esnekliğe sahip. Burada dallanma üç seviyeleri ile tipik bir mikrokanal ağı sundu. Buağ mikroimalat temiz oda ve yumuşak litografi gerçekleştirilir fotolitografi kombinasyonu ile imal edilmektedir.

<table><tbody><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929</td><td></td></tr><tr><td>Biyopsi yumruğu</td><td>Miltex</td><td>33-31 AA</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Albümini</td><td>MP Biyomedikaller</td><td>810014</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Beyin Özü (BBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-4098</td><td></td></tr><tr><td>Örtü</td><td>Slip Fisher Scientific</td><td>12-542C</td><td></td></tr><tr><td>DAF-2 DA</td><td>Calbiochem</td><td>251505</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti-Keçi IgG (H + L) İkincil Antikor</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5 (çekirdek boyama)&nbsp;</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>4084</td><td></td></tr><tr><td>Endotel Hücre Büyüme Takviyesi (EKGS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E2759-15MG</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Gibco</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Domuz derisinden elde edilen jelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin (50 mg / ml)</td> <td>Gibco</td><td>15750-078</td><td></td></tr><tr><td>Cam lamel</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548B</td><td></td></tr><tr><td>Cam Pasteur pippette</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>Domuz bağırsak mukozasından heparin sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Tamponlu Tuzlu Su Çözeltisi</td><td>Lonza</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>İnsan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler)</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil alkol (IPA)</td><td>VWR</td><td>89125</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Memeli Zil Çözeltisi Bileşeni</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl (132 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl (4.6 mM)</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl<alt>2</alt> ve orta nokta; 2H<alt>2</alt>O (2,0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO<alt>4</alt> ve orta nokta; 7H2O (1.2 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz (5.5 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO<alt>3</alt> (5.0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Tuzu (9.1 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6007H</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Acid (10.9 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6003H</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 Kültür Ortamı</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin (F-aktin boyama)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin&nbsp;</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloksan (PDMS)</td> <td>Dow Corning Corporation</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Neşter</td><td>Exel Int</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>Scotch bant</td><td>3M</td><td>34-8711-3070-3</td><td></td></tr><tr><td>Silikon gofret</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 fotorezist</td><td>MicroChem</td><td>SU-8 2050 Y111072</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 geliştirici</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>doku kültürü şişeleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707503-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Kimya Kitabı</td><td>T6878</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin Nötrleştirici çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin/EDTA Çözeltisi (TE)</td><td>Gibco</td><td>R-001-100</td><td></td></tr><tr><td>Boru</td><td>Cole-Parmer</td><td>PTFE mikro delikli boru, 0.012 "ID x 0.030" OD</td><td></td></tr><tr><td>VE-cadherin</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-6458</td><td></td></tr><tr><td>Ekipmanın Adı<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar/Açıklama</td></tr><tr><td>Biosafety Laminer başlık</td><td>NuAire</td><td>NU-425 Sınıf II, Tip A2</td><td></td></tr><tr><td>CCD kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Leica</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>Kurutucu</td><td>Bel-Art</td><td>F42022</td><td></td></tr><tr><td>Ocak Gözü</td><td>Wenesco</td><td>HP-1212</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp fırın</td><td>Barnstead</td><td>3608-5</td><td></td></tr><tr><td>Litografi tezgah</td><td>Karl Suss</td><td>MA6 Kontakt Litografi</td><td></td></tr><tr><td>Optik mikroskop</td><td>Nikon</td><td>L200 ND & CCD kamera için Diaphod 300</td><td></td></tr><tr><td>Deklanşör</td><td>Sutter Instrument</td><td>Lambda 10-2</td><td></td></tr><tr><td>Plazma temizleyici</td><td>PVA TePla/Harrick plazma</td><td>M4L/PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Spin kaplayıcı</td><td>Brewer Science</td><td>Cee 200X</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga pompa sistemi</td><td>Harvard Aparatı</td><td>703005</td><td></td></tr><tr><td>Yazılımın adı</td><td> Şirket</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar/Açıklama</td></tr><tr><td>CAD yazılımı</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD 2015</td><td></td></tr><tr><td>CFD simülasyon yazılımı</td><td>COMSOL</td><td>COMSOL Multiphysics 4.0.0.982</td><td></td></tr><tr><td>Görüntüler NO üretimi için elde edilir ve analiz edilir&nbsp;</td><td>Üniversal Görüntüleme</td><td>Metafloru</td><td></td></tr></tbody></table>

gelişim ve karakterizasyonu<em&gt; İn vitro</em&gt; mikrodamar ağ ve endotel kantitatif ölçümleri [ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; ve nitrik oksit Üretimi

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

In vivo olarak, kan damarı duvarlarını oluşturan endothelial hücreleri (EC), sürekli akıma maruz kalması ama kültür EC, genellikle statik koşullar altında yetiştirilen ve pro-enflamatuar bir fenotip sergiler. mikroakışkan cihazların geliştirilmesi iki yılda mühendis tarafından benimsemiş olmasına rağmen, onların biyolojik uygulamalar sınırlı kalır. Biyolojik uygulamalar tarafından onaylanmış bir daha fizyolojik ilgili in vitro mikrovasküler modeli alanını ilerletmek ve in vivo ve in vitro çalışmalar arasında boşlukları doldurmak için önemlidir. Burada, uzun vadeli bir perfüzyon yeteneğine sahip bir mikroakışkan cihaz kullanarak kültürlü mikrovasküler ağının geliştirilmesi için ayrıntılı prosedürler mevcut. Ayrıca konfokal ve konvansiyonel floresan mikroskobu kullanarak gerçek zamanlı olarak AT [Ca2 +] i ve nitrik oksit (NO) üretiminin, agonist ile uyarılan değişiklikleri nicelik uygulamaları göstermektedir. oluşan mikrovasküler netSürekli perfüzyon ile iş EC arasında iyi gelişmiş kavşaklar gösterdi. dağıtım-cadherin VE statik kültürlü AK mono tabakaları daha sağlam mikrodamarlar gözlenen yakın oldu. EC geçici bir artış ATP&#39;ye bağlı [Ca2 +] i ve NO üretimi kantitatif kültürlenmiş mikro damarların özelliğe geçerli bir hücre seviyeleri ölçülmüştür. Bu mikroakışkan cihaz EC, geleneksel statik 2B kültürlerinde daha vivo hücre kültürü ortamı daha yakın hale getirir, iyi kontrol edilen, fizyolojik olarak uygun akış altında büyümesine izin verir. Mikrokanal ağ tasarımı çok yönlü ve üretim süreci basit ve tekrarlanabilir. Cihaz kolayca yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlayan konfokal ya da geleneksel mikroskopik sisteme entegre edilebilir. kültürlü mikrovasküler ağ birincil insan EC tarafından oluşturulan çünkü En önemlisi, bu yaklaşım nasıl araştırmak için yararlı bir araç olarak hizmet verecekpatolojik hasta örneklerinden değişmiş kan bileşenleri insan ECS etkileyen ve klinik konularda bilgi sağlar. Aynı zamanda ilaç taraması için bir platform olarak geliştirilebilir.

Bu bölümde, bu protokol ile geliştirilen kültür mikrovasküler ağı ile elde edilen sonuçların bazılarını gösterir. Mikrokanal deseni üç seviyeli dallanma ağı (Şekil 1A) &#39;dir. Bu tasarımda, dört 100 mikron genişliğinde kızı kanallarına yine iki 126 mikron genişliğinde kanallar ve dalları içine 159 mikron genişliğinde anne kanal dalları. 3D sayısal simülasyon Bu mikro ağı içinde kesme stresi üç farklı seviyede gösterir 0.35 ul / dak akış hızı (Şekil 1B),</strong...

Birincil insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler), bir mikroakışkan ağ cihazı içinde birleşecek şekilde büyütüldü. Endotel hücre bağlantısı ve F-aktin dağılımları gösterildi ve adenozin trifosfata (ATP) yanıt olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve nitrik oksit üretimindeki değişiklikler, bireysel hücre seviyelerinde gerçek zamanlı olarak ölçüldü.

Gelişim ve karakterizasyonu<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikrodamar Ağ ve Endotel kantitatif ölçümleri [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; I</sub&gt; Ve Nitrik Oksit Üretimi

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Bu prosedürün genel amacı, endotel hücrelerinin fizyolojik olarak ilgili makaslama akışı altında büyümesine olanak tanıyan bir mikroakışkan cihaz geliştirmek ve agonist tarafından tetiklenen kalsiyum ile nitrik oksit üretimindeki değişiklikleri ölçmektir. Bu çalışma, in vitro mikrodamar modelini doğrulayarak ve in vivo ile in vitro çalışmalar arasındaki boşlukları doldurarak mikrodamar araştırmalarının geleceğini ilerletmeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, çeşitli damar yapılarını taklit etmek için mikrokanalların çok yönlü tasarımıdır ve hücre kültür ortamını, orijinal kültürlerdeki durağan koşullara kıyasla in vivo durumuna daha yakın hale getirmeleridir.Prosedürler, laboratuvarımdan Sulei ve Xiang tarafından gösterilecektir. Başlamadan önce, metin protokolünde açıklandığı gibi, bir ana kalıp oluşturmak için standart fotolitografi ve PDMS mikrokanal cihazlarını üretmek için yumuşak litografi kullanın. Mikrokanal cihazlarını hazırlamak için, önce girişi ve çıkışı ince bir PDMS parçasıyla kapatın ve cihazı ıslak bir mendil içeren Petri kabının içine yerleştirin.Ardından, kabı Parafilm ile sarın ve cihazı UV ışığı altında en az üç saat boyunca sterilize edin. Sonraki adım fibronectin uygulamaktır. İlk olarak, girişe 30 ila 50 µL PBS damlatın.Cihazı durulamak için çıkışta vakum oluşturun. Ardından, girişe 100 µg/mL fibronectin'ten bir damla yerleştirin. Fibronectin çözeltisini yüklemek için çıkışta vakum oluşturun.Ardından, girişi ve çıkışı kapatın. Kabı tekrar Parafilm ile sarın ve cihazı dört derece Celsius'tale gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, cihazı manuel olarak üç kez PBS ile durulayın.Ardından, cihazı 30 ila 50 µL hücre kültürü medyumu ile doldurun ve bir inkübatörde 37 °C'de en az 15 dakika boyunca ısıtın. HUVEC'leri, mililitrede iki ila dört milyon hücre olacak şekilde, yüzde sekiz Dekstran içeren HUVEC kültür medyumu ile karıştırarak başlayın. Dekstran, viskoziteyi artırmak ve böylece hücre ekimini iyileştirmek için gereklidir.Ardından, giriş kısmının üzerine 10 ila 20 µL hücre koyun ve hücreleri yerçekimi yardımıyla veya çıkış kısmından cam bir pasteur pipetiyle kılcal hareket kullanarak aktarın. Daha sonra, cihazı 15 ila 20 dakika inkübe edin. Sonrasında, ekim durumunu bir mikroskop altında kontrol edin.Gerektiğinde, istenen hücre yoğunluğuna ulaşmak için daha fazla hücre yükleyin. Yeterli miktarda hücre yüklendikten sonra, Dekstran'ı uzaklaştırmak için cihazı normal, ılık hücre kültürü ortamı ile nazikçe durulayın. Ardından, cihazı herhangi bir ortam perfüzyonu olmadan altı saat boyunca kültüre edin.Ardından, uzun süreli perfüzyon için boru bağlantılarını kurun. Cihazı bir Petri kabına bantla sabitleyin ve ardından giriş borusunu iğneli bir şırıngaya bağlayın. Boruları cihazın hem giriş hem de çıkış kısımlarına yerleştirin.Çıkış borusunu bir atık toplayıcıya bağlayın. Şimdi, kabı ve atık konteynerini bir inkübatöre yerleştirin. Uzun bir giriş borusu olan şırıngayı, inkübatör kapısından geçen harici bir perfüzyon pompasına bağlayın.Ardından, perfüzyon hızını deneysel tasarıma göre ayarlayın. İyi kontrol edilen bir perfüzyon ile mikrodamar ağındaki kültür iki haftaya kadar sürdürülebilir. Bu nedenle, çalışma, farklı fizyolojik ve patolojik durumlar altındaki hücresel ve hemodinamik ortamı taklit eden daha uzun süreli çalışmalara genişletilebilir.VE-cadherin işaretlemesi gibi immün boyamaya başlamak için, önce hücreleri dört derece santigrat sıcaklıkta 30 dakika boyunca yüzde iki paraformaldehit ile perfüze ederek tespit edin. Bloklama, permeabilizasyon ve antikorlarla boyama için gerçekleştirilen bir dizi perfüzyondan sonra, hücreler görüntülenene kadar cihazı dört derece santigrat sıcaklıkta tutun. Hücrelerdeki kalsiyum konsantrasyonunu görüntülemek için cihazı 37 derece santigrat sıcaklıkta 15 dakika boyunca Ringer solüsyonu içinde 10 mg/mL albümin ile perfüze edin.Ardından, cihazı 37 °C'de 40 dakika boyunca beş µM Fluo-4 AM ile perfüze edin. Daha sonra, lümene bağlanan Fluo-4 AM'yi 37 °C'de 15 dakika boyunca albumin Ringers ile yıkayarak uzaklaştırın. Sonra, Fluo-4 AM ile hücre içi kalsiyum seviyesi görüntüleme için konfokal sistemi çalıştırın. Fluo-4 yüklü mikrodamarların görüntülerini elde edin.Bazal görüntüleri 10 dakika boyunca toplayın. Ardından, cihazı 10 micromolar ATP ile sürekli olarak perfüze edin ve floresan yoğunluğundaki değişimleri 20 dakika boyunca kaydedin. Hücrelerdeki nitrik oksit üretimini görüntülemek için, cihazı 37 degrees Celsius sıcaklıkta 15 dakika boyunca albümin Ringer çözeltisi ile perfüze edin.Ardından, hücreleri 37 °C'de yaklaşık 35 ila 40 dakika boyunca 5 µM DAF-2 DA ile perfüze edin. Daha sonra, ATP ile uyarılmış nitrik oksit üretimini ölçmek için floresan görüntüleme sistemini kurun. 5 dakika boyunca bazal seviyeyi kaydedin, ardından cihazı 10 µM ATP ile perfüze edin ve bir dakikalık aralıklarla 30 dakika boyunca görüntüleri toplayın.Hücre nitrik oksit ölçümü için, yoğunluk profili ayrıştırma adaptörünün zamanla kümülatif nitrik oksit üretimini temsil ettiğini, bir nitrik oksit konsantrasyonunu temsil etmediğini anlamak önemlidir. Toplanan görüntüler üzerinden tekil hücre düzeyindeki ilgi alanlarını manuel olarak seçin. Her bir ROI, floresan ana hattıyla belirtilebilen tek bir bireysel hücrenin alanını kapsar.ATP tarafından indüklenen endotelyal kalsiyum ve nitrik oksit değişimlerini nicelleştirin. Fluo-4 floresan yoğunluğundaki değişimleri, doku arka planını çıkararak hesaplayın. DAF-2 floresan yoğunluğunun zamana göre birinci türev dönüşümünü gerçekleştirerek nitrik oksit üretim hızını nicelleştirin.Cihazdaki mikrokanal deseni, üç seviyeli bir dallanma ağına sahiptir. 0,35 µL/dak akış hızı altında kayma gerilmesi dağılımlarını tahmin etmek için 3B sayısal simülasyon gerçekleştirilmiştir. Endotelyal hücreler, açıklandığı şekilde ağa ekilmiştir.Ardından, F-aktin ve çekirdekler işaretlendi. Benzer şekilde, VE-kaderin boyaması da yapıldı. Sonuçlar, sağlam bir venüldeki VE-kaderin ekspresyonu ile benzerdi.Ardından, ATP tarafından indüklenen hücre içi kalsiyum artışları ve nitrik oksit üretimi incelendi. Kalsiyum seviyeleri, protokol bölümünde açıklandığı üzere Fluo-4 AM kullanılarak incelendi. Nitrik oksit üretimi, protokol bölümünde açıklandığı üzere DAF-2 DA kullanılarak izlendi.Sonuçlar, bireysel olarak perfüze edilmiş sağlam venüllerden elde edilenlerle karşılaştırılabilir düzeydeydi. Geliştirilen yöntem, geleneksel mikrocerrahi teknikleriyle mümkün olmayacak şekilde, biyolojik koşullar ve dinamik sıvı ortamlarında kolayca ve sıkı bir şekilde kontrol edildi. Bu videoyu izledikten sonra, cihazın nasıl üretileceği ile kalsiyum ve nitrik oksit ölçümlerinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu teknik, araştırmacıların yolunu açarak yalnızca agonist kaynaklı temel mekanizmaları incelemelerine olanak sağlamakla kalmamış, aynı zamanda biyomedikal araştırmalar için daha geniş uygulama alanları oluşturmuştur.

development-characterization-vitro-microvessel-network-quantitative

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yenidoğan fare retina bir anjiyogenez modüle farklı genler ya da uyuşturucu rolleri soruşturma izin anjiyogenez bir iyi karakterize fizyolojik modeli...

Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama<em&gt; In vivo</em

Bir mikro-on-a-chip platformu fotolitografik reflowable ışığa tekniği, yumuşak litografi ve Mikroakiskan kombinasyonu tarafından geliştirilmiştir. Endothelialized mikro platformu, in vivo mikrodamar içinde üç boyutlu (3D) geometrisi ile taklit eden sürekli perfüzyon kontrollü akış altında çalışan, yüksek kaliteli ve gerçek zamanlı görüntü sağlar ve mikrovasküler araştırma için uygulanabilir.

Çok derinlemesine Dairesel kesit Endothelialized mikro kanallar-on-a-chip Geliştirme Prosedürü

Tüp formasyonu deneyi in vitro olarak anjiyojenezi ölçmek için bir hızlı, ölçülebilir bir yöntemdir. Endotel hücreler, koşullu ortam ile bir araya yerleşen ve bazal zar özü ekilir. Tüp oluşumu saat içinde meydana gelir ve yeni oluşan tübülleri kolayca ölçülebilir.

Endotel Hücre için Tüp Deneyi birleşimi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Anjiyogenezin Çalışması

Vasküler hücre fonksiyonu, hücre içi habercilerin aktivitesine bağlıdır.  Burada tarif edilen, izole bir aortun bireysel endotel ve düz kas hücrelerinde fizyolojik ve farmakolojik uyaranlara yanıt olarak hücre içi kalsiyum ve nitrik oksit seviyelerinin ölçülmesine izin veren bir ex vivo iki foton görüntüleme yöntemidir.

Hücre içi Ca İki foton Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Bir İzole Sıçan Aort Kullanım ve Endotel Nitrik Oksit Üretimi ve düz kas hücreleri

Burada gösterdi (1) taze olduğu gibi beyin endotel "boru" ve endotel kalsiyum ve membran endotel kaynaklı hyperpolarization sırasında potansiyel (2) eşzamanlı ölçümler sorunlarının yalıtılması iletişim kurallarıdır. Ayrıca, bu yöntemler farmakolojik endotel hücre kalsiyum ve bireysel veya etkileşimli deneysel değişkenler olarak elektrik sinyali ayarlamak için izin verir.

Hücre içi kalsiyum ve taze izole ve olduğu gibi fare serebral endotel membran potansiyeli eşzamanlı ölçümler

İndüklenen pluripotent kök hücrelerinden (IPSC-EPs) elde edilen endotel progenatörler, kardiyovasküler hastalık tedavilerinin devrimleştirilmesi ve daha sadık kardiyovasküler hastalık modellerinin oluşturulmasını sağlamak için potansiyele sahiptir. Burada, üç boyutlu (3D) kollajen mikroortamlarda IPSC-EPs kapsülleme ve bu hücrelerin vasculogenik potansiyelinin nicel Analizi açıklanmıştır.

Bir In vitro 3D model ve hesaplamalı boru hattı PSC-türetilen endotel progenitors Vazculogenik potansiyelini ölçmek için

Burada, bir mikroakışkan çip ve neovaskülarizasyonun ilk mikroçevresini yeniden sağlayan, endotel hücrelerinin (VC' ler) yüksek luminal kesme stresi, fizyolojik transendotelyal akış seviyesi ve çeşitli vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) dağılımı ile aynı anda uyarılmasını sağlayan otomatik olarak kontrol edilen, yüksek verimli bir sirkülasyon mikroakışkan sistemi sağlıyoruz.

Neovaskülarizasyonun İlk Olayını Taklit Etmek için Mikroakışkan Model

Bu tahlil, filizlenen anjiyogenezi in vitro olarak kontrol eden biyolojik süreçleri analiz etmek için 3D-kollajen jel içinde kültürlenmiş embriyoid cisimlere farklılaştırılmış fare embriyonik kök hücrelerini kullanır. Bu teknik, ilaçları test etmek, hastalıkları modellemek ve embriyonik olarak ölümcül olan delesyonlar bağlamında spesifik genleri incelemek için uygulanabilir.

In Vitro Vasküler Hastalık Modellemesi ve İlaç Testi için Fare Embriyonik Kök Hücreleri Kullanılarak Anjiyogenezin Üç Boyutlu Filizlenme Testi

Serebral parankimal arteriollerden sağlam fare serebral endotelyal "tüplerinin" yoğun bir şekilde hazırlanması, serebral kan akışı regülasyonunu incelemek için gösterilmiştir. Ayrıca, bu endotel çalışma modelinin floresan görüntüleme ve anahtar hücresel sinyal yollarının elektrofizyoloji ölçümü için, hücre içi [Ca2+] ve membran potansiyelindeki değişiklikler de dahil olmak üzere deneysel güçlerini gösteriyoruz.

Fare Beyin Parankiminin Arteriyolar Endotelinin İzolasyonu ve Fonksiyonel Analizi

Bu protokol, uzun zincirli ve çok uzun zincirli doymuş yağ asitlerinin BODIPY-C12 ve BODIPY-C16 floresan analogları ile stimülasyon üzerine endotel hücrelerinde hücresel lipid alımını ölçmek için bir in vitro testi detaylandırır. Bu yöntem verimlidir ve diğer hücre tiplerine uyarlanabilir ve lipid metabolizmasını incelemek için yararlı bir yaklaşım sunar.

Floresan Yağ Asidi Analogları Kullanılarak Endotelyal Yağ Asidi Alımının Miktar Tayini

Öğrenin, mikroakışkan cihazlar kullanarak endotelyal hücrelerde kalsiyum ve nitrik oksit üretimini nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, mikrodamar araştırmaları için fizyolojik koşulları taklit eder.

Gelişim ve karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet