Gelişim ve karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, endotel hücrelerinin fizyolojik olarak ilgili makaslama akışı altında büyümesine olanak tanıyan bir mikroakışkan cihaz geliştirmek ve agonist tarafından tetiklenen kalsiyum ile nitrik oksit üretimindeki değişiklikleri ölçmektir. Bu çalışma, in vitro mikrodamar modelini doğrulayarak ve in vivo ile in vitro çalışmalar arasındaki boşlukları doldurarak mikrodamar araştırmalarının geleceğini ilerletmeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, çeşitli damar yapılarını taklit etmek için mikrokanalların çok yönlü tasarımıdır ve hücre kültür ortamını, orijinal kültürlerdeki durağan koşullara kıyasla in vivo durumuna daha yakın hale getirmeleridir.

Prosedürler, laboratuvarımdan Sulei ve Xiang tarafından gösterilecektir. Başlamadan önce, metin protokolünde açıklandığı gibi, bir ana kalıp oluşturmak için standart fotolitografi ve PDMS mikrokanal cihazlarını üretmek için yumuşak litografi kullanın. Mikrokanal cihazlarını hazırlamak için, önce girişi ve çıkışı ince bir PDMS parçasıyla kapatın ve cihazı ıslak bir mendil içeren Petri kabının içine yerleştirin.

Ardından, kabı Parafilm ile sarın ve cihazı UV ışığı altında en az üç saat boyunca sterilize edin. Sonraki adım fibronectin uygulamaktır. İlk olarak, girişe 30 ila 50 µL PBS damlatın.

Cihazı durulamak için çıkışta vakum oluşturun. Ardından, girişe 100 µg/mL fibronectin'ten bir damla yerleştirin. Fibronectin çözeltisini yüklemek için çıkışta vakum oluşturun.

Ardından, girişi ve çıkışı kapatın. Kabı tekrar Parafilm ile sarın ve cihazı dört derece Celsius'tale gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, cihazı manuel olarak üç kez PBS ile durulayın.

Ardından, cihazı 30 ila 50 µL hücre kültürü medyumu ile doldurun ve bir inkübatörde 37 °C'de en az 15 dakika boyunca ısıtın. HUVEC'leri, mililitrede iki ila dört milyon hücre olacak şekilde, yüzde sekiz Dekstran içeren HUVEC kültür medyumu ile karıştırarak başlayın. Dekstran, viskoziteyi artırmak ve böylece hücre ekimini iyileştirmek için gereklidir.

Ardından, giriş kısmının üzerine 10 ila 20 µL hücre koyun ve hücreleri yerçekimi yardımıyla veya çıkış kısmından cam bir pasteur pipetiyle kılcal hareket kullanarak aktarın. Daha sonra, cihazı 15 ila 20 dakika inkübe edin. Sonrasında, ekim durumunu bir mikroskop altında kontrol edin.

Gerektiğinde, istenen hücre yoğunluğuna ulaşmak için daha fazla hücre yükleyin. Yeterli miktarda hücre yüklendikten sonra, Dekstran'ı uzaklaştırmak için cihazı normal, ılık hücre kültürü ortamı ile nazikçe durulayın. Ardından, cihazı herhangi bir ortam perfüzyonu olmadan altı saat boyunca kültüre edin.

Ardından, uzun süreli perfüzyon için boru bağlantılarını kurun. Cihazı bir Petri kabına bantla sabitleyin ve ardından giriş borusunu iğneli bir şırıngaya bağlayın. Boruları cihazın hem giriş hem de çıkış kısımlarına yerleştirin.

Çıkış borusunu bir atık toplayıcıya bağlayın. Şimdi, kabı ve atık konteynerini bir inkübatöre yerleştirin. Uzun bir giriş borusu olan şırıngayı, inkübatör kapısından geçen harici bir perfüzyon pompasına bağlayın.

Ardından, perfüzyon hızını deneysel tasarıma göre ayarlayın. İyi kontrol edilen bir perfüzyon ile mikrodamar ağındaki kültür iki haftaya kadar sürdürülebilir. Bu nedenle, çalışma, farklı fizyolojik ve patolojik durumlar altındaki hücresel ve hemodinamik ortamı taklit eden daha uzun süreli çalışmalara genişletilebilir.

VE-cadherin işaretlemesi gibi immün boyamaya başlamak için, önce hücreleri dört derece santigrat sıcaklıkta 30 dakika boyunca yüzde iki paraformaldehit ile perfüze ederek tespit edin. Bloklama, permeabilizasyon ve antikorlarla boyama için gerçekleştirilen bir dizi perfüzyondan sonra, hücreler görüntülenene kadar cihazı dört derece santigrat sıcaklıkta tutun. Hücrelerdeki kalsiyum konsantrasyonunu görüntülemek için cihazı 37 derece santigrat sıcaklıkta 15 dakika boyunca Ringer solüsyonu içinde 10 mg/mL albümin ile perfüze edin.

Ardından, cihazı 37 °C'de 40 dakika boyunca beş µM Fluo-4 AM ile perfüze edin. Daha sonra, lümene bağlanan Fluo-4 AM'yi 37 °C'de 15 dakika boyunca albumin Ringers ile yıkayarak uzaklaştırın. Sonra, Fluo-4 AM ile hücre içi kalsiyum seviyesi görüntüleme için konfokal sistemi çalıştırın. Fluo-4 yüklü mikrodamarların görüntülerini elde edin.

Bazal görüntüleri 10 dakika boyunca toplayın. Ardından, cihazı 10 micromolar ATP ile sürekli olarak perfüze edin ve floresan yoğunluğundaki değişimleri 20 dakika boyunca kaydedin. Hücrelerdeki nitrik oksit üretimini görüntülemek için, cihazı 37 degrees Celsius sıcaklıkta 15 dakika boyunca albümin Ringer çözeltisi ile perfüze edin.

Ardından, hücreleri 37 °C'de yaklaşık 35 ila 40 dakika boyunca 5 µM DAF-2 DA ile perfüze edin. Daha sonra, ATP ile uyarılmış nitrik oksit üretimini ölçmek için floresan görüntüleme sistemini kurun. 5 dakika boyunca bazal seviyeyi kaydedin, ardından cihazı 10 µM ATP ile perfüze edin ve bir dakikalık aralıklarla 30 dakika boyunca görüntüleri toplayın.

Hücre nitrik oksit ölçümü için, yoğunluk profili ayrıştırma adaptörünün zamanla kümülatif nitrik oksit üretimini temsil ettiğini, bir nitrik oksit konsantrasyonunu temsil etmediğini anlamak önemlidir. Toplanan görüntüler üzerinden tekil hücre düzeyindeki ilgi alanlarını manuel olarak seçin. Her bir ROI, floresan ana hattıyla belirtilebilen tek bir bireysel hücrenin alanını kapsar.

ATP tarafından indüklenen endotelyal kalsiyum ve nitrik oksit değişimlerini nicelleştirin. Fluo-4 floresan yoğunluğundaki değişimleri, doku arka planını çıkararak hesaplayın. DAF-2 floresan yoğunluğunun zamana göre birinci türev dönüşümünü gerçekleştirerek nitrik oksit üretim hızını nicelleştirin.

Cihazdaki mikrokanal deseni, üç seviyeli bir dallanma ağına sahiptir. 0,35 µL/dak akış hızı altında kayma gerilmesi dağılımlarını tahmin etmek için 3B sayısal simülasyon gerçekleştirilmiştir. Endotelyal hücreler, açıklandığı şekilde ağa ekilmiştir.

Ardından, F-aktin ve çekirdekler işaretlendi. Benzer şekilde, VE-kaderin boyaması da yapıldı. Sonuçlar, sağlam bir venüldeki VE-kaderin ekspresyonu ile benzerdi.

Ardından, ATP tarafından indüklenen hücre içi kalsiyum artışları ve nitrik oksit üretimi incelendi. Kalsiyum seviyeleri, protokol bölümünde açıklandığı üzere Fluo-4 AM kullanılarak incelendi. Nitrik oksit üretimi, protokol bölümünde açıklandığı üzere DAF-2 DA kullanılarak izlendi.

Sonuçlar, bireysel olarak perfüze edilmiş sağlam venüllerden elde edilenlerle karşılaştırılabilir düzeydeydi. Geliştirilen yöntem, geleneksel mikrocerrahi teknikleriyle mümkün olmayacak şekilde, biyolojik koşullar ve dinamik sıvı ortamlarında kolayca ve sıkı bir şekilde kontrol edildi. Bu videoyu izledikten sonra, cihazın nasıl üretileceği ile kalsiyum ve nitrik oksit ölçümlerinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu teknik, araştırmacıların yolunu açarak yalnızca agonist kaynaklı temel mekanizmaları incelemelerine olanak sağlamakla kalmamış, aynı zamanda biyomedikal araştırmalar için daha geniş uygulama alanları oluşturmuştur.