Tarafından indüklenen Exon dahil değerlendirilmesi Splice SMA hasta fibroblastlar anahtarlama antianlamlı Oligonucleotides

Bu lipotransfeksiyon protokolünün genel amacı, antisens oligonükleotidleri hücrelere sokmak ve bu ilaçların SMA hücrelerinde ekzon inklüzyonu üzerindeki etkinliğini değerlendirmektir. Bu yöntem, antisens terapi alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Örneğin, hastalara tedavi sağlamak için yeni antisens oligoların etkinliği gibi.

Bu tekniğin temel avantajı, çeşitli antisens oligonükleotid kimyalarının test edilmesi için yeterince hızlı, kolay ve hassas olmasıdır. Bu yöntem, antisens oligoların fibroblastlara transfeksiyonu için kullanılabilse de, primer miyoblastlar ve diğer çeşitli hücre hatları gibi diğer hücre tiplerine de uygulanabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Aleks olacak.

İlk olarak, 10 mikromolar LNA / DNA karıştırıcı çözeltisini buz üzerinde çözdürün. Karıştırıcı çözeltisini serumdan yoksun ortamda, 1.5 mililitrelik bir tüpte gerekli konsantrasyona seyreltin. Daha sonra, transfeksiyon reaktifini seyreltin ve seyreltilmiş transfeksiyon reaktifini bire bir oranında karıştırıcıya ekleyin.

Transfeksiyon yapılırken hücre birleşmesinin %65 ila 80 civarında olması kritik öneme sahiptir. Birleşme %80'in üzerindeyse, transfeksiyon verimliliği azalacaktır. Ardından, transfeksiyon reaktif karışımını oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

10 dakika sonra, 900 mikrolitre serumdan yoksun besiyerini% 5 fetal sığır serumu ile tüpe pipetleyin. FBS'yi transfeksiyon reaktifi ve LNA/DNA karıştırıcıları ile inkübasyondan önce eklemeyin, çünkü transfeksiyon verimliliğini de etkiler. Ardından, eski ortamı kültür plakasından aspire edin.

Şimdi, LNA / DNA karıştırıcısını içeren ortamın bir mililitresini kültür plakasına ekleyin. Ardından, plakayı 24 ila 48 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübatörde bırakın. İnkübasyonun ardından, ortamı kültür plakasından aspire edin.

Ardından, hücrelere bir mililitre GPC reaktifi pipetleyin. Ardından, kuyuları GPC reaktifi ile birkaç kez yıkayın. Birkaç yıkamadan sonra, hücreleri 1,5 mililitrelik bir tüpte toplayın ve örnekleri buz üzerinde tutun.

Ardından, tüpü 30 saniye boyunca yüksek hızda girdaplayın. Ardından tüpü eksi 80 santigrat derecede bir saat saklayın. Şimdi, numuneyi oda sıcaklığında çözün ve hızlı bir şekilde girdaplayın.

Daha sonra, numuneye 200 mikrolitre kloroform ekleyin ve 15 saniye boyunca kuvvetlice çalkalayın. Ardından, tüpü oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin. Üç dakika sonra, numuneyi dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 12.000 g'da santrifüjleyin.

Santrifüjleme bittiğinde, sulu fazı santrifüj tüpünün üstünden toplayın. Ardından sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. Daha sonra, sulu faza 500 mikrolitre izopropanol ve mikrolitre RNA dereceli glikojen başına sekiz mikrogram bir mikrolitre ekleyin.

Numuneyi 10 saniye boyunca hızlı bir şekilde girdap haline getirin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, numuneyi dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 12.000 g'da santrifüjleyin. Koşu bittikten sonra süpernatanı boşaltın.

Bir mililitre soğuk% 75 etanol ekleyin ve elde edilen peleti yıkamak için kısaca girdaplayın. Yine, numuneyi 7500 g'da dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Ardından, tüm etanolü dışarı atın ve peleti oda sıcaklığında kurutun.

Pelet kuruduktan sonra 30 mikrolitre DNAse/RNAse içermeyen suda çözün. Ardından, numuneyi 60 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Ardından, spektrofotometrede 260 nanometrede RNA konsantrasyonunu okuyun ve mikrolitre başına 15 nanograma ayarlayın.

RT-PCR ana karışımını oluşturmak için, iki X RT-PCR reaksiyon tamponu, bir adım RT-PCR enzim karışımı, ileri ve geri primerler ve RNAse/DNAse içermeyen damıtılmış su ekleyin. Ana karışımı 0,2 milimetrelik PCR tüplerine dağıtın ve her bir numune için toplam RNA'yı ekleyin. Ardından PCR reaksiyonunu başlatın.

RT-PCR tamamlandıktan sonra, amplifiye edilmiş ürüne beş mikrolitre altı X yükleme boyası ekleyin. Ardından, karışımın beş mikrolitresini %2'lik bir agaroz jel üzerine yükleyin. Elektroforez ünitesini 40 dakika boyunca 100 voltta başlatın.

İlk olarak, farklı karıştırıcıların verimliliği incelenir. Bunu yapmak için, karıştırıcılarla transfekte edilen SMA fibroblastlarında SMN2 ekzon 7 ve GAPDH seviyelerinin dahil edilmesi analiz edilir. Jel görüntüsü, üst ve alt bantların ekzon 7'yi temsil ettiği ekzon 7'nin dahil edildiğini ve hariç tutulduğunu gösterir.2 RNA.

İnklüzyon verimliliği ayrıca, bir ila beş arasındaki karıştırıcılarla transfekte edildiğinde %78 ila 98 olarak ölçülür. Öte yandan, hasta SMA fibroblastlarını transfekte etmek için altı ila sekiz karıştırıcı kullanıldığında, kontrole kıyasla önemli bir sonuç elde edilmez. Deneyde kontrol olarak GAPDH kullanılmıştır.

Daha sonra, GAPDH'ye kıyasla tam uzunlukta SMN2'nin nispi ekspresyonunu analiz etmek için kantitatif PCR yapılır. Kontrole kıyasla bir ila üç ve beş numaralı karıştırıcılarla transfekte edildiğinde SMN2 transkript seviyesinin miktarında keskin bir artış gözlenir. SMN protein ekspresyon seviyesi de incelenir, bu da bir ila beş karıştırıcı ile transfekte edilen hasta fibroblastında SMN protein ekspresyon seviyesinde bir artış gösterir.

SMN protein seviyesinde 1,5 ila 1,9 kat keskin bir artış gözlenir. Burada kullanılan kontrol kofilindir. Aksine, altı ila sekiz karıştırıcı SMN protein ekspresyon seviyesini değiştirmez.

Bu videoyu izledikten sonra, antisens oligo'nun fibroblastlara nasıl transfekte edileceğini iyi anlamalı ve in vitro etkinliği değerlendirmelisiniz.