Name: Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Öğrenin fare beyin kesitlerinde alternatif pre-mRNA uçbirleştirme desenlerini in situ hibridizasyonla nicel olarak analiz etme yöntemini. Bu hassas teknik sinirbilim araştırmalarında protein çeşitliliğini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser [Grant-in-Aid 0365274B H.L. için], Amerikan Kalp Derneği tarafından desteklenen Ulusal Kanser Enstitüsü [GI SPORE P50CA150964] Z.W. için Ulusal Sağlık Enstitüleri [Office of araştırma altyapı paylaşılan araçları Grant S10RR031845 için Işık mikroskobu] Case Western Reserve Üniversitesi tesisinde görüntüleme ve Çin burs Konseyi'ne [X.G.]. Yazarlar ile slayt tarama ışık mikroskobu Imaging Core için onun yardım etmek içinde Richard Lee teşekkür ederiz.

Tüm fareler ilgili deneyler burada açıklanan Case Western Reserve Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış olması. Başlık 2016-0068 protokolünün (PI: Hua Lou) "alternatif pre-mRNA'ın porno versiyonunu omurgalı gelişiminde rolü" olduğunu.
Not: Bilgiler, tüm ekipman, reaktifler ve bu protokol için kullanılan malzemeleri Malzemeler tablovardır.
1. Formalin hazırlayın sabit parafin gömülü (FFPE) bölümleri
<ol><li>
1 CD1 fare ve 1 C57BL/6J fare tarafından servikal çıkığı ötenazi. Dikkatle cerrahi makas ve forseps ile kafatası kesmiş. Beyin bir kepçe ile kaldırın. Not: 5 aylık CD1 erkek fare ve 3 aylık C57BL/6J erkek fare kullanılan ve benzer sonuçlar ortaya koydu.<ol>
<li>PBS ile beyin yıkama. Tüm beyin % 10 formalin, oda sıcaklığında (RT) içeren bir çözüm ile 50 mL formalin çözüm tüm beyin koyarak için 30 h düzeltmek.</li>
		<li>Sabitleme çözüm değiştirin PBS'ye ve PBS beyin gecede 4 ° C'de kuluçkaya Kurutmak ve Ksilen ve standart prosedürler18kullanarak parafin ile beyin embed.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bir microtome katıştırılmış doku 5 µm bölümler halinde kesmek için kullanın. Parafin kurdele bir RT su banyosunda önce ve sonra şerit i yaymak için bir 45 ° C su banyosunda koyun.
	<ol>
<li>Hemen kırışıklıklar ve kıvrımlar Şerit'teki yok zaman bölümler cam slaytlarda bağlayın. Gecede RT. Bake slaytlar için kullanmadan önce 60 ° C'de 1 h, Kuru slaytlar hava.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. örnek Önarıtma
<ol><li>
Doku bölümleri deparaffinize. Bir duman başlık olarak bu adımları uygulayın.
	<ol>
<li>İki bulaşık (Şekil 1A) 250 mL taze ksilen ve iki ile 250 mL % 100 etanol doldurmak. Doku slaytlar çamaşır raf içinde Tablo 1' de belirtilen sipariş ve kuluçka zaman aşağıdaki bulaşık yıkama raf (Şekil 1A) ve yer ekleyin.</li>
		<li>Her kuluçka sırasında çamaşır raf daha--dan 3 kere yukarı ve aşağı çamaşır bulaşık kaldır. Her kuluçka sonra hızlı bir şekilde doku bölümleri kurumasını önlemek için sonraki çamaşır bulaşık yıkama raf taşıyın.</li>
		<li>Kuluçka adımları tamamladıktan sonra çamaşır bulaşık yıkama raf slaytlar ile kaldırın. Raf 5 min için veya slaytları tamamen kuru olana 60 ° C kuluçka makinesine koyun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Doku bölümü hidrofobik bariyer kalemle çevreleyen bir 0,75 '' x 0,75 '' bariyer çizin. Hava kuru 3 dk RT. az için bariyer</li>
	<li>
Dilim pretreat
	<ol>
<li>Reaktifler ve donanımları hazırlamak<ol>
<li>Hibridizasyon fırını (Şekil 1B) ve sıcaklık 40 ° c 30 dk kullanmadan önce ayarlayın.</li>
			<li>Distile su ile tamamen ıslak nemlendirici kağıt (Şekil 1E) ve nem kontrolü tepsi (Şekil 1 d, sol) koydu. Nem kontrol tepsiyi hibridizasyon fırında tutun.</li>
			<li>Taze 1 x hedef alma reaktifler 700 mL 10 x hedef alma reaktifler 70 mL için dH2O 630 mL ekleyerek hazırlayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Hidrojen peroksit uygulanır.<ol>
<li>Deparaffinized slaytlar bankta koymak. Hidrojen peroksit 5 – 8 damla doku tamamen kapsayacak bir bölümüne ekleyin. 10 dakika dik, kuluçkaya</li>
			<li>Hidrojen peroksit çözümü, bir defada bir slayt kaldırmak için emici kağıt parçası üzerinde slaytlar dokunun. Hemen bir çamaşır askısı slaytı eklemeden ve raf dH2ile O. dolu bir çamaşır bulaşık gitme</li>
			<li>Yukarı ve aşağı distile su içinde raf taşıyarak slaytları yıkama 3 – 5 kez. Distile su ve yıkama slaytlar ile bir kez daha dolu bir çamaşır bulaşık yıkama raf taşıyın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Hedef alma gerçekleştirmek<ol>
<li>1000 mL Cam kabı sıcak bir tabağa yerleştirin. Taze 1 x hedef alma reaktifler 700 mL kabı ekleyin ve folyo ile kapatın. Ölçek folyo kapak (Şekil 1 c) aracılığıyla bir termometre yerleştirin. Sıcak plaka üzerinde açın ve 10-15 dk yüksek ayarlayın.</li>
			<li>Alma reaktifler sıcaklığını 98 ° C ulaştığında, sıcak plaka sıcaklık kontrolünü hafif çıban korumak için düşük yüksek geçin. 15 dk daha kaynatın değil.</li>
			<li>Bu arada, dikkatli bir şekilde folyo aç ve çamaşır raf içinde alma regent dilimlerle koy. Kabı tekrar kapak ve 15dk için kuluçkaya.</li>
			<li>DH2O ve durulama 15 için 200 mL ile raf bir çamaşır yemek kabı kaldırmak için kullanım forseps dolu s.</li>
			<li>Raf % 100 taze etanol içeren bir çamaşır bulaşık taşımak ve 3 dk. slaytlar kaldırmak ve onları 10 dk 60 ° C Kuluçka Makinası için oturup bekleyin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Proteaz III uygulamak<ol>
<li>Slaytları leke raf (Şekil 1 d, sağ) yerleştirin. Proteaz doku kapsayacak şekilde III 5 damla ekleyin. Dikkatle raf nem kontrol tepsi (Şekil 1 d, sol) yerleştirebilir ve tepsiyi 40 ° C hibridizasyon fırın içine takabilirsiniz. 30 dk için kuluçkaya.</li>
			<li>Slayt rafa kaldırmak ve tepsiyi fırına koy. Aşırı sıvı, bir defada bir slayt kaldırmak için slaytlar dokunun. Bir çamaşır rafa slaytı eklemeden ve yer çamaşır bulaşık içinde raf raf slaytlar için yukarı ve aşağı yıkamak için dH2ile O. hareket dolu 3 - 5 kez.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ISH tahlil
<ol><li>
Malzemeleri hazırlamak
	<ol>
<li>50 x 40 ° C kuluçka 20 dk. Mix 2.94 L dH2O ve 50 60 mL x 1 x yıkama tampon yapmak için yıkama arabellek için yıkama arabellek önceden ısıtmak.</li>
		<li>% 50 hematoksilen boyama çözüm Gill'in hematoksilen dH21 N amonyum hidroksit 1,43 mL 250 mL dH2O. karışımı ekleyerek O. Prepare %0.02 (w/v) Amonyaklı su 100 mL için bir kap içinde iyi 100 mL ekleyerek hazırlayın.</li>
		<li>Sonda ve AMP 0-6 koymak reaktifler RT 30 dk kullanmadan önce. Nem kontrol tepsiyi 40 ° C hibridizasyon fırında tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ISH yordamı Not: izoformlarının Uçbirleştirme Nf1 ifade inceleyin ve hesaplamak için exon 23a, exon izoformu 23a dahil, hedef üç farklı ISH problar (PSI) değerindeki spliced yüzde exon 23a hariç izoformu veya her iki izoformlarının kullanılan (Şekil 2 üzeresiniz ). Sondalar adjacently kesilmiş doku bölümler üzerinde kullanılır. Kritik üç doku bölümleri kabul edilir hesaplama doğruluğunu sağlamak için tam olarak aynı hibridizasyon, güçlendirme ve sinyal algılama adımda.<ol>
<li>Hibridizasyon sonda.<ol>
<li>Slaytları çamaşır rafa kaldırmak ve slaytlardan aşırı sıvı dokunun. Slaytları leke rafa yerleştirin.</li>
			<li>Sonda adı ile slaytlar etiketlemek için bir kalem kullanın. Üç farklı Nf1 problar (Şekil 2) ile birlikte melezleşmiştir için üç adjacently kesilmiş beyin doku slayt koymak. Slaytların aynı sırada sonraki adımları uygulayın.</li>
			<li>Sonda doku kapsayacak şekilde 4 damla ekleyin. Bu bir slayt bölümleri kurumasını önlemek için bir anda yapmak. Leke raf içinde nem kontrol tepsi ve 2 h 40 ° C fırında içine yerleştirin.</li>
			<li>Slaytları iki kez arabellek yıkama ile yıkayın. Her yıkama için boyama bulaşık yıkama arabellek x 1 200 mL ile doldurun ve bir çamaşır rafa yerleştirin. Kağıt havlu bir slayt üzerindeki aşırı sıvı teker teker dokunun ve hızlı bir şekilde çamaşır raf ekleyebilirsiniz. Slayt raf yemek için yukarı ve aşağı hareket 3-5 defa için 2 dk az RT.</li>
			<li>İkinci yıkama için taze yıkama arabellek kullanın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sinyal güçlendirme.<ol>
<li>Slaytları fazla yıkama arabelleğinden dokunun ve leke rafa koyun. Doku kapsayacak şekilde AMP 0 4 damla ekleyin. Leke raf içinde nem kontrol tepsi ve 40 ° C'de 30 dk fırında yerleştirin</li>
			<li>Slaytları iki kez arabellek yukarıda açıklandığı gibi yıkama ile yıkayın.</li>
			<li>1-6 takip sipariş ve Tablo 2durumunu AMP ile bu adımı yineleyin. Slaytları iki kez her hibridizasyon adımdan sonra yıkayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sinyal algılama<ol>
<li>Slaytları fazla yıkama arabelleğinden dokunun ve leke rafa koyun. Hızlı kırmızı b 2 µL hızlı kırmızı 120 µL için ekleyin microcentrifuge tüp içinde (1:60 oranı). Mix iyi ve tam olarak doku bölümü kapsayacak şekilde ekleyin. Not: Kırmızı a toplam hacim / B karışımı numarası ve doku bölümün boyutunu temel alır. 0,75 '' x 0,75 '' alan, 120 µL bir bölümü için yeterli. 5 dakika içinde karışımı kullanın ve mix doğrudan güneş ışığı veya UV ışık yay.</li>
			<li>Kapatmak belgili tanımlık tepsi ve RT. Kaldır, 10 min için atık konteyner çözüm kuluçkaya ve hemen bir çamaşır raf slaytlar eklemek ve musluk suyu ile dolu bir çamaşır bulaşık raf yer. Tekrar taze musluk suyuyla durulayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Slayt counterstaining
	<ol>
<li>Musluk suyundan çamaşır rafa kaldırmak ve hızlı bir şekilde ilave su kaldırmak için emici kağıt üzerine dokunun. Raf çözüm boyama % 50 hematoksilen koymak ve hemen raf birkaç kez yukarı ve aşağı hareket ettirin. Dik, 2 min için kuluçkaya</li>
		<li>Slayt raf musluk suyu tabak içine aktarın. 3-5 kat raf yukarı ve aşağı hareket ve slaytları beyin dokuları mor kalırken, netlik kadar taze musluk suyu değiştirilerek yıkayın.</li>
		<li>Raf %0.02 Amonyaklı su içeren bir yemek için hareket. Dokular maviye kadar raf 2-3 kez yukarı ve aşağı hareket ettirin. Slaytlar 3-5 kat boyama bir tabak taze musluk suyu ile yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montaj örnekleri
	<ol>
<li>Slayt raf boyama yemek 60 ° C kuluçka taşımak ve slaytları tamamen kuru olana en az 15 dakikadır kuluçkaya.</li>
		<li>Orta slayt ve dikkatli bir şekilde montaj yer 40 µL 24 mm x 50 mm coverslip doku bölümünün üzerine yerleştirin. Hava kuru slaytlarını RT., 30 dk</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. veri toplama ve Analizi
Not: 40 X büyütmede görüntüleri taramak için bir slayt tarayıcı kullanın.
<ol><li>
Pozitif ve negatif denetimleri
	<ol>
<li>Her deneme için pozitif ve negatif denetimler (Şekil 3) içerir. İyi bir pozitif kontrol sinyal 20-40 X büyütme punctate noktalar olarak görünür olmalıdır.</li>
		<li>Kullanım fare (Mm) - PPIB - 1ZZ pozitif kontrol olarak. Bu sonda bir genel temizlik hizmetleri gen PPIB hedefler. Negatif kontrol için kabul edilebilir her 20 X mikroskop alanı boyama arka plan görüntüleme her 20 hücrelere bir nokta var.</li>
		<li>DapB-1ZZ sonda bir negatif kontrol kullanın. Bu sonda bakteri gen dapB hedefler. Bu denetim probları birçok ISH deneyleri19' kullanılmıştır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sinyal algılama ve Nf1 exon 23a ifade kalıpları olarak Analizi
	<ol>
<li>Hibridizasyon sinyalleri punctate noktalardan olarak gösterilmiş, noktalar elle saymak. Nokta sayısı belirli bir yoklama ile tespit tutanakları düzeyiyle ilişkilidir. Not nokta sayısı da ImageJ veya SpotStudio yazılım tarafından analiz edilebilir.</li>
		<li>Üç sondalar exon 23a-içeren, exon izoformlarının 23a eksik veya toplam Nf1 transkript (Şekil 2) melezlemek için kullanın. Üç sondalar aynı anda kullanılamaz gibi her sonda melezlemek için üç bitişik beyin doku bölümleri kullanın.<ol>
<li>(PSI) exon 23a spliced yüzdesini hesaplamak için hücreleri ve bazı beyin bölgelerinde nokta sayısını saymak. Faiz her bölge için Şekil 4' te gösterildiği gibi birden fazla alt bölge üzerinden 400'den fazla hücreleri saymak.</li>
			<li>Aynı alt bölgelerdeki her üç sondalar için veri toplama. PSI exon 23a dahil sonda ile hücre başına nokta sayısı olarak hesaplamak / (exon 23a dahil sonda + hücre exon23a ile sonda atlama başına nokta sayısı ile hücre başına nokta sayısı) x %100.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Cieply, B., Carstens, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+alternative+splicing+factors+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Functional roles of alternative splicing factors in human disease.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).</li>
<li>Xiong, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+splicing.+The+human+splicing+code+reveals+new+insights+into+the+genetic+determinants+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease.</a> Science. 347, 1254806(2015).</li>
<li>Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+splice+variants+in+the+5%27UTR+of+Gtf2i+expressed+in+the+rat+brain%3A+alternative+5%27UTRs+and+differential+expression+in+the+neuronal+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites.</a> Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).</li>
<li>Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+quantification%3A+in+situ+analysis+of+transcriptome+and+pre-mRNA+alternative+splicing+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li>
<li>Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamic+acid+decarboxylase+1+alternative+splicing+isoforms%3A+characterization%2C+expression+and+quantification+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain.</a> BMC Neuroscience. 15, 114(2014).</li>
<li>Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Are+Short+Exons+Flanked+by+Long+Introns+Defined+and+Committed+to+Splicing%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing?</a> Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).</li>
<li>Cassidy, A., Jones, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+in+situ+hybridisation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Developments in in situ hybridisation.</a> Methods. 70, 39-45 (2014).</li>
<li>Meshorer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+and+neuritic+mRNA+translocation+under+long-term+neuronal+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity.</a> Science. 295, 508-512 (2002).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope+for+in+situ+detection+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li>
<li>Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neuron-specific+alternative+splicing+of+neurofibromatosis+type+1+pre-mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).</li>
<li>Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras+signaling+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons.</a> Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).</li>
<li>Nguyen, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras%2FERK+signaling+and+learning+behaviors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice.</a> Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).</li>
<li>Zhou, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hu+proteins+regulate+alternative+splicing+by+inducing+localized+histone+hyperacetylation+in+an+RNA-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+histone+modifications+regulate+alternative+splicing+in+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).</li>
<li>Adzemovic, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+Analysis+in+the+Rat+Central+Nervous+System+and+Peripheral+Lymph+Node+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2016).</li>
<li>Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+In+Situ+Hybridization+using+Oligonucleotide+Probes+on+Paraformaldehyde-prefixed+Brain+of+Rats+with+Serotonin+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li>
<li>Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Ultrasensitive+In+Situ+Hybridization+Approach+to+Detect+Short+Sequences+and+Splice+Variants+with+Cellular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution.</a> Molecular Neurobiology. , (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim raporları BaseScope RNA ISH fare beyin bölümleri ifade desenleri olarak incelemek için kullanın. Bu anti-anlamda exon-exon junction 50 nukleotid exon içerme ve sağlam ve özellikle izoformlarının atlama hedefleyebilirsiniz daha kısa probları gösterilmiştir. Ayrıca, elde edilen sinyalleri bir alternatif exon PSI hesaplamak için kullanılabilir.
Birkaç varyasyon yordamda test edildi. Örneğin, donmuş doku bölümleri cryostat kesit tarafından oluşturulan test ve bu ISH iletişim kuralını k...

Alternatif dikişi (AS) pre-mRNA olgunlaşma sırasında oluşan ortak bir süreçtir. Bu süreçte bir exon differentially olgun mRNA dahil edilebilir. Böylece, AS ile bir gen birçok mRNA'ların farklı protein ürünleri için bu kodu oluşturabilirsiniz. Bu tahmin edilmektedir insan genlerinin % 92-94 alternatif dikişi1,2tabi. Anormal alternatif uçbirleştirme desenleri sonuçlandı genetik mutasyonlar hastalıklar, amyotrofik lateral skleroz, miyotonik distrofi ve kanser3,4de dahil olmak üzere çok sayıda bağlantılı. Böylece araştırmak ve alternatif alışılageldik düzenleyici mekanizmaları insan hastalıkların yeni tedaviler bulmak için bir girişim daha iyi anlamak önemlidir.
GİBİ sık sık bir hücre türüne özgü biçimde düzenlenmiştir. Belirli bir biyolojik sisteminin belirli bir gen AS ifade desenini belirlemek önemlidir. Hücreleri, beyin veya kalp, gibi birçok farklı türde içeren karmaşık bir organ okudu ancak bu karmaşık olur. Bu durumda, ideal bir tahlil sisteminin belirli bir gen AS ifade desen birçok hücre tiplerinde aynı anda tespit edilebilir böylece RNA in situ hibridizasyon (ISH) doku kullanarak bölümleri seçimdir. Nitekim, exon özgü probları bir alternatif exon5,6,7' nin ifade düzeylerini değerlendirmek için kullanılmaktadır. Ancak, bu yaklaşım aşağıdaki nedenlerden dolayı iyi desen analiz için uygun değildir. İlk, geleneksel ISH yöntemleri genellikle probları 300'den daha uzun kullanın bp, omurgalı iç ekzonlar (değil ilk veya son exon) ortalama büyüklüğü 170 nükleotit8,9iken. Exon özgü sonda bir iç alternatif exon alışılageldik paterni incelemek için kullanıldığında, ikinci olarak, sondası tarafından algılanan tek mRNA izoformu exon tespit edilemez olmadan, mRNA izoformu ise exon içeren sıradır. Böylece, hesaplama için alternatif exon (PSI) değerindeki spliced yüzde karmaşıktır. Ayrıca, geleneksel floresan ISH kez ISH algılama verimliliği ve sağlamlık azaltan immunostaining ile bir araya getirir. Örneğin, stres kaynaklı araştırıldı bir çalışmada izoformu asetilkolinesteraz (ağrı) geçiş Uçbirleştirme mRNA, digoxigenin ISH sondayı dahil oldu ve anti-digoxigenin antikor kullanarak algılandı. Alternatif olarak, biotin etiketli sonda bir alkali fosfataz/streptavidin eşlenik ve alkalen fosfataz10için bir substrat tarafından tespit edildi. Ben de yöntemi herhangi bir güçlendirme stratejisi algılama hassasiyeti artırmak için kullanılır. Sonuç olarak, düşük seviyelerde ifade edilir mRNA transkript algılamak için meydan okuyor. Böylece, daha basit ve daha sağlam bir ISH tahlil sistem ifade desenleri in situanaliz etmek için gereklidir.
BaseScope son zamanlarda RNAscope, köklü bir platformda temel alınarak geliştirilmiş ve yaygın kullanılan ISH tahlil sistemi. Her iki tahlil sistemleri algılama11,12hassasiyeti artar bir hedef özgü güçlendirme teknolojisi kullanır. Birini diğerinden ayırt eder gibi kısa BaseScope için 50 nukleotid ve 300-1000 nükleotit RNAscope için hedef sırası uzunluğudur. Böylece, belirli alternatif mRNA izoformlarının algılamaya exon exon kavşak hedef tasarım probları mümkündür. Mevcut çalışmada, ifade desenleri nörofibromatozis 1 (Nf1) exon 23a, kapsamlı bir şekilde aynı laboratuvar13,14,15 ' te okudu bir alternatif exon yazarken incelemek için bir yordam kuruldu , 16 , 17, fare beyin bölümlerde. Sonuçları BaseScope Nf1 exon 23a içinde in situifade desen çalışması için ideal bir sistem olduğunu ispat. Bu tahlil sistemi gibi birçok alternatif ekzonlar ifade desenleri analiz etmek için adapte edilebilir gibi güçlü bir yeni araç as çalışmalarda temsil eder

<table><tbody><tr><td><güçlü > Ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Hibridizasyon Fırını</td><td>Gelişmiş Hücre Teşhisi</td><td>241000ACD</td><td></td></tr><tr><td>Nem Kontrol Tepsisi (kapaklı)</td><td>Gelişmiş Hücre</td><td>Teşhisi 310012</td><td></td></tr><tr><td>Leke Rafı</td><td>Gelişmiş Hücre Teşhisi</td><td>310017</td><td></td></tr><tr><td>Sıcak plaka</td><td>Fisher Scientific</td><td>1160049SH</td><td></td></tr><tr><td>Imperial III Genel Amaçlı İnkübatör</td><td>Lab-Line</td><td>302</td><td></td></tr><tr><td>Slayt Tarayıcı</td><td>Leica</td><td>SCN400</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>< güçlü>Ön tedavi kiti</güçlü></td> <td>Hidrojen</td><td></td> Peroksit 322381 <td></td></tr><tr><td></td><td>Gelişmiş Hücre Teşhisi 2000899</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteaz III*</td><td></td>10x Hedef Alma 2000901 <td>Gelişmiş Hücre Teşhisi</td> 2002555 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>BaseScope</td></tr><tr><td>Algılama Reaktif Kiti</td><td>Gelişmiş Hücre Teşhisi</td><td>332910</td><td></td></tr><tr><td>AMP 0</td><td>Gelişmiş Hücre Tanılama</td><td>2001814</td><td></td></tr><tr><td>AMP 1</td><td>Gelişmiş Hücre Tanılama</td><td>2001815</td><td></td></tr><tr><td>AMP 2</td><td>Gelişmiş Hücre Tanılama</td><td>2001816</td><td></td></tr><tr><td>AMP 3</td><td>Gelişmiş Hücre Tanılama</td><td>2001817</td><td></td></tr><tr><td>AMP 4</td><td>Gelişmiş Hücre Tanılama</td><td>16229B</td><td></td></tr><tr><td>AMP 5-KIRMIZI</td><td>Gelişmiş Hücre Teşhisi</td><td>16229C</td><td></td></tr><tr><td>AMP 6-RED</td> Hızlı <td>2001820</td><td></td>Gelişmiş <td>Hücre Teşhisi</td></tr> Hızlı <tr><td>RED-B</td> Gelişmiş <td>Hücre Teşhisi</td><td>2001821</td><td></td></tr><tr><td>RED-B</td><td>Gelişmiş Hücre Teşhisi</td><td>16230F</td><td></td></tr><tr><td>50x Yıkama Tamponu</td><td>Gelişmiş Hücre Teşhisi</td><td>310091</td><td></td></tr><tr><td>Negatif Kontrol Probu- Fare DapB-1ZZ</td><td>Gelişmiş Hücre Teşhisi</td><td>701021</td><td></td></tr><tr><td>Pozitif Kontrol Probu- Fare (mm)-PPIB-1ZZ</td><td>Gelişmiş Hücre Teşhisi</td><td>701081</td><td></td></tr><tr><td>Kontrolü slayt fare 3T3 hücre peleti</td><td>Gelişmiş Hücre Teşhisi</td><td>310045</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</ güçlü</td></tr><tr><td>><güçlü>Diğer malzemeler< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nemlendirici Kağıt</td><td>Gelişmiş Hücre Teşhisi</td><td>310015</td><td></td></tr><tr><td>Yıkama Rafı</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>9837976</td><td></td></tr><tr><td>Yıkama Bulaşıkları</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>LWS20WH</td><td></td></tr><tr><td>Hidrofobik Bariyer</td><td>Kalem Vektör Laboratuvarı</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Cam Slaytlar</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Kapak Camı, 24 mm x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12--545-F</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amonyum hidroksit</td><td>Fisher Scientific</td><td>002689</td><td></td></tr><tr><td>%100 etanol (EtOH)</td><td>Decon Labs</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>formalde çözeltisi</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF94-4</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksilen I</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>17012359</td><td></td></tr><tr><td>Montaj Ortamı Vektör</td><td>Laboratuvarları</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>173942</td><td></td></tr></tbody></table>

kantitatif analiz alternatif pre-mrna rna in situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde uçbirleştirme

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternatif dikişi (AS) insan genlerinin fazla % 90 oluşur. Bir alternatif olarak spliced exon ifade desenini kez bir hücre türüne özgü biçimde düzenlenmiştir. Kalıpları genellikle RT-PCR ve RNA-seq tarafından incelenir ifadesi olarak hücreleri bir popülasyondan RNA numuneleri kullanılarak izole. İn situ incelenmesi belirli bir biyolojik yapısı için ifade desen olarak kullanarak exon özgü probları RNA in situ hibridizasyon tarafından (ISH) yapılabilir. Ancak, alternatif ekzonlar genellikle exon özgü probları tasarlamak için çok kısa olduğu için ISH belirli bu kullanımı sınırlı olmuştur. Bu raporda, BaseScope, RNA ISH, kısa antianlamlı oligonucleotides istihdam son zamanlarda gelişmiş bir teknoloji kullanımı olarak fare beyin bölümleri ifade desenleri analiz etmek için tanımlanır. EXoN 23a nörofibromatozis tip 1 (Nf1) örnek olarak kısa exon-exon junction probları RNA ISH analiz fare beyin bölümlerinde yüksek özgüllük ile sağlam hibridizasyon sinyalleri sergi göstermek için kullanılır. Daha da önemlisi, exon eklenmesi ve atlama-özel probları ile tespit sinyalleri güvenilir değerlerde Nf1 exon 23a ifade bir fare beynin farklı anatomik bölgelerde spliced yüzdesini hesaplamak için kullanılabilir. Deneysel protokol ve hesaplama yöntemi için analiz olarak sunulmaktadır. Sonuçlar BaseScope ifade desenleri in situdeğerlendirmek için güçlü bir yeni araç sağlar gösterir.

BaseScope ISH üç fare suşları kullanılarak gerçekleştirildi: CD1 vahşi türü fareler, C57BL/6J vahşi türü fare ve hangi exon 23a bir sonucu olarak tüm hücre tipleri içinde dahil C57BL/6J arka plan Nf123aIN/23aIN mutant farelerde mühendislik splice sitesi mutasyonlar14,15.
İlk adım olarak, sağlanan şirket reaktifler kullanarak ISH tahlil sistem test ed...

Kısa antianlamlı oligonucleotides fare beyin bölümlerde alternatif pre-mRNA yapıştırma desenleri algılamak için kullandığı bir in situ hibridizasyon (ISH) protokolü tanımlanır.

Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Bu yöntem, alternatif pre-mRNA birleştirme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Spesifik olarak, doku dilimlerinde yerinde alternatif birleştirme modellerini incelemek için sağlam, hassas bir test sistemi sağlar. Bu yöntemle, alternatif ekleme, fare beyni gibi karmaşık biyolojik yapılarda bulunan birçok alt tipte aynı anda analiz edilebilir.Bu tekniğin ana avantajı, izoforma özgü hibridizasyon sinyalleri üretmek için mRNA in situ hibridizasyonda şok anti-statik ekzon bağlantı probları kullanmasıdır. Bina sinyali amplifikasyon teknolojisi, sağlam hibridizasyon sinyalleri sağlamak için algılamanın hassasiyetini artırır. Tespit edilen sinyaller, bir fare beyninin farklı anatomik bölgelerindeki hayati değerlerdeki ek yüzdesini hesaplamak için kullanılan spesifik problardan kaçan ekzon inklüzyon idi.Bu çalışmada, tahlil sisteminin kullanımını göstermek için NF1 ekzon 23a örnek olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, sistem birçok alternatif ekzonun ifade modellerini analiz etmek için uyarlanabilir. Fare beyni bölüm D parafinizasyonunu başlatmak için, iki yıkama kabını 250 mililitre ksilen ile doldurun.Ve çeker ocak içinde 250 mililitre %100 etanol içeren iki tan

quantitative-analysis-alternative-pre-mrna-splicing-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Pre-mRNA geçici doğası nedeniyle, izole etmek ve incelemek için zor...

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

Bu video, serotonin sendromundan etkilenen sıçan beyin dokusunda oligonükleotid probları kullanılarak serotonin reseptörü RNA sentezinin tespitini göstermektedir. Protokol, mikroskop altında serotonin reseptörü RNA ekspresyonunu görselleştirmek ve ölçmek için doku ön işlemi, prob hibridizasyonu, enzimatik tespiti içerir.

Sıçan Beyin Bölümlerinde RNA Ekspresyonunu İncelemek için Oligonükleotid Probları Kullanılarak Yerinde Hibridizasyon

Alternatif ekleme düzenlemesinin, çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde önemli bir hücresel program olan epitelyal-mezenkimal geçişe (EMT) katkıda bulunduğu gösterilmiştir. Burada, EMT sırasında alternatif eklemenin tespiti için indüklenebilir bir EMT modeli kullanan bir yöntemi açıklıyoruz.

Epitel-Mezenkimal Geçiş sırasında alternatif birleştirme Algılama

RNA in situ hibridizasyon (ISH), hücre ve dokulardaki RNA'ların görselleştirilmesini sağlar. Burada, RNAscope ISH'nin immünohistokimya veya histolojik boyalarla kombinasyonunun, fare ve insan beyninin bölümlerinde aksonlara lokalize mRNA'ları tespit etmek için nasıl başarılı bir şekilde kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Yüksek Çözünürlük kullanma Beyin bölümlerde Axonally Lokalize mRNA&#39;larının Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme

Gen ekspresyonunu spesifik hücre tiplerine lokalize etmek, spesifik antikorların eksikliği nedeniyle zor olabilir. Burada, çift floresan RNA'nın yerinde hibridizasyonunun immün boyama ile birleştirilmesiyle gen ekspresyonunun eşzamanlı üçlü tespiti için bir protokol açıklıyoruz.

Çift Floresan birleştiren<em&gt; In Situ</em&gt; Fare Beyin Bölüm Üç Genlerin İfade tespiti için immünoişaretleme ile Hibridizasyon

Burada katı tümörler ve hematolojik malignitelerde ilaç direnci üzerinde anormal yapıştırma etkisini araştıran amaçlayan bir protokol açıklar. Bu hedefe, biz RNA seq ile ebeveyn ve in vitro dirençli modellerin transkriptomik profillerini analiz ve aday genler doğrulamak için bir QRT-PCR tabanlı bir yöntem kurdu.

İlaç Direnci İlgili Roman Splice türevlerini algılamak için RNA sıralamayı kullanarak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Kanser Modelleri

Alternatif ekleme (AS) ve alternatif poliadenilasyon (APA), transkript izoformlarının ve ürünlerinin çeşitliliğini genişletir. Burada, deneysel koşullar arasında değişen AS ve APA'yı tespit etmek ve görselleştirmek için toplu RNA-seq ve 3' uç dizileme testlerini analiz etmek için biyoinformatik protokolleri açıklıyoruz.

RNA-seq Verilerinde Alternatif Ekleme ve Poliadenilasyonun Tanımlanması

Murin koroid pleksusunda insülin reseptör izoformları IR-A ve IR-B'yi haritalamak için bir Dubleks in situ hibridizasyon testi oluşturduk ve geleneksel yöntemlerin sınırlamalarının üstesinden geldik. Bu yüksek çözünürlüklü yaklaşım, beyin insülin sinyalizasyonu ve nörolojik bozukluklar için potansiyel izoform hedefli tedaviler hakkında yeni bilgiler sunan izoforma özgü ifadeyi ortaya çıkarır.

Murin Beyninde İnsülin Reseptörleri A ve B'nin RNA In Situ Hibridizasyon Testi ile Hassas Görselleştirilmesi

Bu protokol, yeni ortaya çıkan geliştirici transkriptleri ölçmek için kolaylaştırılmış bir hesaplama hattı sağlar. Kromatin erişilebilirliğini, kromatin özelliğini ve transkripsiyonel verileri entegre ederek, karmaşık intragenik bölgelerdeki güçlendirici aktivitenin doğru tespitine ve ipliğe özgü analizine olanak tanırken, kapsamlı biyoinformatik eğitimi olmayan araştırmacılar için de erişilebilir olmaya devam eder.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerinde İntergenik/İntojenik Güçlendirici RNA Miktar Tayini için Hesaplamalı Bir Boru Hattı

Bu rapor, özellikle memeli hücrelerinde hedef genlerin eklenmesini düzenleyen yeni Yapay Ekleme faktörler (ASFS) tasarım ve yapı için biyoteknolojik yöntemi tarif etmektedir. Bu yöntem ayrıca, RNA metabolizması diğer yönlerini işlemek için çeşitli yapay faktörleri mühendisi genişletilebilir.

Yapay Faktörler Mühendislik Özellikle İnsan Hücreleri alternatif bağlantı işleyin için

Öğrenin fare beyin kesitlerinde alternatif pre-mRNA uçbirleştirme desenlerini in situ hibridizasyonla nicel olarak analiz etme yöntemini. Bu hassas teknik sinirbilim araştırmalarında protein çeşitliliğini anlamaya yardımcı olur.

Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Daha fazla video keşfet