Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Bu yöntem, alternatif pre-mRNA birleştirme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Spesifik olarak, doku dilimlerinde yerinde alternatif birleştirme modellerini incelemek için sağlam, hassas bir test sistemi sağlar. Bu yöntemle, alternatif ekleme, fare beyni gibi karmaşık biyolojik yapılarda bulunan birçok alt tipte aynı anda analiz edilebilir.

Bu tekniğin ana avantajı, izoforma özgü hibridizasyon sinyalleri üretmek için mRNA in situ hibridizasyonda şok anti-statik ekzon bağlantı probları kullanmasıdır. Bina sinyali amplifikasyon teknolojisi, sağlam hibridizasyon sinyalleri sağlamak için algılamanın hassasiyetini artırır. Tespit edilen sinyaller, bir fare beyninin farklı anatomik bölgelerindeki hayati değerlerdeki ek yüzdesini hesaplamak için kullanılan spesifik problardan kaçan ekzon inklüzyon idi.

Bu çalışmada, tahlil sisteminin kullanımını göstermek için NF1 ekzon 23a örnek olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, sistem birçok alternatif ekzonun ifade modellerini analiz etmek için uyarlanabilir. Fare beyni bölüm D parafinizasyonunu başlatmak için, iki yıkama kabını 250 mililitre ksilen ile doldurun.

Ve çeker ocak içinde 250 mililitre %100 etanol içeren iki tane daha. Mendil slaytlarını bir yıkama rafına yerleştirin. Ardından, yıkama rafını ksilen içeren bir kaba yerleştirin ve rafı en az üç kez yukarı ve aşağı hareket ettirirken beş dakika inkübe edin ve ikinci ksilen kabı ile tekrarlayın.

Daha sonra rafı etanol içeren bir tabağa yerleştirin ve aynı yukarı ve aşağı hareketlerle iki dakika inkübe edin ve ardından ikinci etanol kabı ile tekrarlayın. Slaytları kurutmak için, rafı ikinci etanol kabından hareket ettirin ve beş dakika boyunca 60 santigrat derecede bir inkübatörün içine yerleştirin. Doku bölümünün etrafına 0,75 inç x 0,75 inçlik bir bariyer çizmek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın ve oda sıcaklığında üç dakika havayla kurutun.

Hibridizasyon fırınını açın ve sıcaklığı 40 santigrat dereceye ayarlayın. Nemlendirme kağıdını damıtılmış suyla tamamen ıslattıktan sonra, bir nem kontrol tepsisine yerleştirin. Ardından nem kontrol tepsisini hibridizasyon fırınına yerleştirin.

Kurutulmuş slaytları bir tezgah üzerine yerleştirdikten sonra, her slayttaki doku bölümlerini beş ila sekiz damla hidrojen peroksit çözeltisi ile tamamen örtün. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Hidrojen peroksit solüsyonunu çıkarmak için slaytları emici bir kağıda birer birer hafifçe vurun ve slaytları bir yıkama rafına yerleştirin.

Slaytları yıkamak için rafı su içeren bir yıkama kabına daldırın ve üç ila beş kez yukarı ve aşağı hareket ettirin. Sıcak bir plaka üzerine yerleştirilmiş bir litrelik cam kabı 700 mililitre 1X hedef çıkarma işlemi ile doldurun ve folyo ile örtün. Folyo kapağın içinden bir termometre yerleştirin ve sıcak plakayı açın, 10 ila 15 dakika boyunca yüksek sıcaklığa ayarlayın.

Geri alma reaktifinin sıcaklığı 98 santigrat dereceye ulaştığında, hafif bir kaynama durumunu korumak için sıcak plakayı düşük sıcaklığa ayarlayın. Ardından, folyoyu dikkatlice çıkarın ve rafı beherin içine yerleştirin. Beheri folyo ile örtün ve 15 dakika inkübe edin.

Rafı beherden 200 mililitre damıtılmış su içeren bir yıkama kabına aktarmak için forseps kullanın ve 15 saniye inkübe edin. 15 saniye sonra, rafı% 100 etanol içeren bir yıkama kabına yerleştirin ve üç dakika inkübe edin. Rafı tabaktan çıkarın ve 60 derecede 10 dakika kurutun.

Slaytları bir leke rafına yerleştirdikten sonra, doku bölümlerini slayt başına beş damla proteaz 3 ile kaplayın. Rafı dikkatlice nem kontrol tepsisine yerleştirin ve tepsiyi hibridizasyon fırınına yerleştirin ve 40 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Rafı tepsiden çıkardıktan sonra, fazla sıvıyı çıkarmak için kızaklara hafifçe vurun ve bunları bir yıkama rafına yerleştirin.

Rafı damıtılmış su içeren bir yıkama kabına yerleştirin ve slaytları yıkamak için rafı üç ila beş kez yukarı ve aşağı hareket ettirin. Yerinde hibridizasyona hazırlanmak için, probları ve AMP reaktiflerini oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Nem kontrol tepsisini hibridizasyon fırınına yerleştirin ve 40 santigrat dereceye ayarlayın.

Prob hibridizasyonu için, kızakları yıkama rafından çıkarın ve fazla sıvıyı çıkarmak için üzerlerine hafifçe vurun. Slaytları bir leke rafına yerleştirin. Slaytları prob adıyla etiketlemek için bir kalem kullanın.

Üç farklı nöral lif mitoz tip bir prob ile hibritlenecek şekilde bitişik olarak kesilmiş üç beyin dokusu slaytını yerleştirin. Çok farklı izoforma özgü problar olduğu için bitişik kesilmiş doku kesitleri kullanıyorum. Hesaplamada yüzde ekinin doğruluğunu sağlamak için bu bölümlerin hibridizasyon, amplifikasyon ve sinyal algılama adımlarında tamamen aynı şekilde ele alınması çok önemlidir.

Doku bölümlerini, bölümlerin kurumasını önlemek için her seferinde bir slayt olmak üzere, bölüm başına dört damla prob ile örtün. Ardından leke rafını nem kontrol tepsisine yerleştirin ve iki saat boyunca 40 santigrat derece fırına koyun. Ardından, 200 mililitre 1X yıkama tamponu ile doldurulmuş bir yıkama kabına bir yıkama rafı yerleştirin.

Ardından, fazla sıvıyı çıkarmak için her slaytı birer birer kağıt havluya hafifçe vurun. Ve her bir sürgüyü hemen yıkama rafına yerleştirin. Rafı üç ila beş kez yukarı ve aşağı hareket ettirirken taze yıkama tamponu ile doldurulmuş bir tabakta oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin ve ardından yıkamayı yeni bir kapta tekrarlayın.

Sinyal amplifikasyonu için, fazla yıkama tamponunu çıkarmak için her bir sürgüye dokunun ve bunları bir leke rafına yerleştirin. Her slayttaki doku bölümünü dört damla AMP sıfır reaktif ile kaplayın. Ardından, rafı nem kontrol tepsisine yerleştirin, tepsiyi fırına yerleştirin ve 40 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Bu deneyde daha önce yapıldığı gibi slaytı yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Sinyal amplifikasyon adımını, metin protokolünde açıklandığı gibi bir ila altı AMP reaktifleri ile tekrarlayın ve her adımdan sonra slaytları yıkayın. Sinyal algılama için, kızaklardaki fazla yıkama tamponunu hafifçe vurarak çıkarın ve bir leke rafına yerleştirin.

Daha sonra, iki mikrolitre hızlı kırmızı B ile 120 mikrolitre hızlı kırmızı A'yı bir mikro santrifüj tüpünde karıştırın. Solüsyonu, tamamen kaplamak için her slayttaki doku bölümlerine ekleyin. Leke rafını nem kontrol tepsisine yerleştirin, tepsiyi örtün ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Ardından solüsyonu çıkarın ve slaytları bir yıkama rafına yerleştirin. Slaytları yıkamak için rafı musluk suyu içeren bir yıkama kabına yerleştirin ve yıkamayı tekrarlayın. İkinci yıkamadan sonra, fazla suyu çıkarmak için emici bir kağıda hafifçe vurun.

Ardından, rafı% 50 hematoksilen boyama çözeltisi içeren bir kaba yerleştirin. Rafı birkaç kez yukarı ve aşağı hareket ettirin. Ve oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin.

Rafı musluk suyu içeren bir yıkama kabına aktarın. Rafı beş kez yukarı ve aşağı hareket ettirin ve kağıt mendil bölümleri mor kalırken slaytlar netleşene kadar yıkamayı tekrarlayın. Ardından rafı% 0.02 amonyak suyu içeren bir kaba aktarın.

Bölümler maviye dönene kadar rafı iki ila dört kez yukarı ve aşağı hareket ettirin. Slaytları boyama kabında üç ila beş kez musluk suyuyla yıkayın. Ardından, rafı bir inkübatörün içine yerleştirin ve slaytları kurutmak için 60 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Tamamen kuruduğunda, dilimi kaplamak için her slayta bir damla montaj ortamı ekleyin. Ardından, her slayttaki doku bölümlerinin üzerine dikkatlice 24 x 50 milimetrelik bir lamel yerleştirin. Slaytları oda sıcaklığında 30 dakika havayla kuruttuktan sonra veri toplamaya devam edin.

Ekzon 23a için eklenen yüzdeyi veya PSI değerini hesaplamak için, korteksin üç alt bölgesindeki hücre ve nokta sayısı ve hipokampus CA3 sayılır. RNA in situ hibridizasyon testi, CD1 vahşi tip farelerin beyin bölümlerinde üç farklı NF1 spesifik prob kullanılarak gerçekleştirilir. Korteks ve hipokampus bölümlerinde gözlenen kırmızı noktasal noktalar, NF1 toplamı, inklüzyona özgü ve spesifik probların atlanması ile pozitif sinyalleri gösterir.

Üç probdan gelen ISH sinyalleri daha sonra sayılır ve PSI'yi hesaplamak için kullanılır. RNA in situ hibridizasyon testi, ekzon 23a'nın tüm hücre tiplerinde yer aldığı C57 siyah 6J vahşi tip fareler ve C57 siyah 6J mutant farelerin korteksinde gerçekleştirilir. C57 siyah 6J vahşi tip farelerin korteksinde gözlenen kırmızı noktasal noktalar, NF1 toplamı, inklüzyona özgü ve spesifik probları atlama ile pozitif sinyalleri gösterir.

C57 siyah 6J mutant farelerde, NF1 toplam ve inklüzyona özgü problar ile benzer sinyaller elde edilir. Bununla birlikte, belirli bir probun atlanması kullanıldığında hiçbir sinyal algılanmaz, bu da ekzon inklüzyonu veya atlamayı hedefleyen iki probun oldukça spesifik olduğunu gösterir. Aynı doku slaytları üzerinde çok renkli etiketleme bu prosedür için henüz mevcut olmadığından, farklı doku slaytları üzerinde farklı problar kullanılır.

Doğru yüzde ekleme değerlerini elde etmek için, bu prosedür boyunca bitişik olarak kesilmiş slaytları kullanmak ve slaytları tam olarak aynı şekilde işlemek önemlidir. Bu prosedürü tamamlayan, immünohistokimya gibi ölçümlerdir, diferansiyel olarak ifade edilen splicing izoformlarının lokalizasyonu ve fonksiyonu ile ilgili ek soruları yanıtlamak için yapılabilir.