Name: mRNA Birleştirme Değişikliklerini incelemek için E1A Minigene Aracını Kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Keşfedin E1A minigen aracı ile mRNA birleştirme değişikliklerini incelemeyi. Bu hızlı ve ekonomik yöntem, kemoterapi sonrası alternatif birleştirme düzenlemesinde hedef proteinin işlevini değerlendirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo'ya (FAPESP, Grant Temático 2017/03489-1'den JK'ya ve FLB 2018/05350-3)'e burs ve bu araştırmayı finanse etmek için Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) aracılığıyla. PMTE1A plazmid ve Zerler ve meslektaşlarına E1A klonlama çalışmalarından dolayı teşekkür ederiz. Ayrıca Prof. Dr. Patrícia Moriel, Prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, Prof. Dr. Marcelo Lancellotti ve Prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller'e laboratuvar alan ve ekipmanlarını kullanmamızı sağlayan teşekkür ediyoruz.

1. Kaplama hücreleri
NOT: Bu açıklanan protokolde, daha önce Nek4'ün kararlı indüklensiz ekspresyörü için oluşturulan HEK293 kararlı hücre hatları21kullanıldı, ancak aynı protokol HEK293 22 , HeLa23 , 24 ,25,26,U-2 OS27,COS728, SH-SY5Y29gibi diğer birçok hücre hattı için uygundur. Bazal koşullar altında minigene E1A izoformlarının ekspresyon modeli bu hücreler arasında değişir ve her durum için karakterize edilmelidir. Bu protokol kararlı hücre hatlarıyla sınırlı değildir. Aday proteinin değerlendirilmesinde en yaygın yaklaşım, sabit miktarda minigene ile miktarının artırılmasının geçici olarak birlikte transfeksiyonlanmasıdır. Aynı protokol nakavt hücreleri için de uygundur.
<ol><li>Araç, virüssüz ve GFP kontrolleri göz önüne alındığında plaka hücreleri.</li>
	<li>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası'nda (DMEM) ilgi geninin kararlı ekspresyonuna sahip Kültür HEK293 hücreleri Fetal Sığır Serumunun (FBS) % 10'u ile desteklenmiştir, 4.5 g/L Glikoz, 4 mM L-Glutamin ve 100 μg/mL higromisin B ile, %5 CO2'de 37 °C'de doku kültürüyle işlenmiş plakalarda ve nemlendirilmiş bir atmosferde muhafaza edin.</li>
	<li>%0.25 tripsin-EDTA kullanarak hücreleri bölün. Plaka 3 x 10 5 hücreleri6 kuyulu plakalarda ve % 5 CO 2'de 37 °C'de24saat kuluçkaya yatırın. NOT: Transfeksiyon için transeksiyon sonrası hücre ölümünü azaltmak için hücrelerin %70-80 bir arada olması gerekir.</li>
</ol>2. Hücre nakli
NOT: Burada 1-2 μg pMTE1A minigene plazmid kullanılmıştır, ancak toksisiteyi önlemek için DNA miktarı ve ifade süresi minimumda tutulmalıdır. Örneğin, 1 μg pMTE1A DNA ile 30 saat transfeksiyondan sonra HeLa hücrelerinde yüksek toksisite gözlendi. Burada açıklanan transfeksiyon için lipid bazlı transfeksiyon reaktifi kullanılmıştır.
<ol><li>Hek293 stabil hücrelerini kapadıktan sonra hücre konfluansı 24 saat kontrol edin ve sadece% 70-80 birleştiğinde transfect.</li>
	<li>Vakum pompası sistemi kullanmak yerine, hücre kültürü ortamını bir pipetle dikkatlice çıkarın. Daha sonra antibiyotiksiz 2 mL tam DMEM ortamını dikkatlice ekleyin ve plakayı tekrar inkübatöre koyun.</li>
	<li>Transfeksiyon tamponu (200 μL/kuyu) ile bir tüp hazırlayın, 2 μg pMTE1A DNA, girdap ekleyin ve ardından 2 μL transfeksiyon reaktifi ekleyin. Tekrar girdap ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yaslanın.</li>
	<li>Plakaları inkübatörden çıkarın ve transfeksiyon karışımını damla yönünde dikkatlice ekleyin.</li>
	<li>HEK293 kararlı hücrelere, transfeksiyondan 6 saat sonra Nek4 ekspresyon indüksiyonu için tetrasiklin (0,5 μg/mL) ekleyin. Orta değişim gerekli değildir. NOT: Bu bölümde açıklanan hacimler/tutarlar bir kuyu içindir. Karışımı aynı tüpte deneyde kullanılan tüm kuyular için hazırlayın.</li>
	<li>Egfp ile transfect yapmak için bir kuyu veya transfeksiyon verimliliğini tahmin etmek için plazmid ifade eden başka bir florofor hazırlayın. En az %40'lı transfeksiyon verimliliği ile daha iyi sonuçlar gözlenebilir, ancak daha önce daha düşük transfeksiyon verimliliği ile iyi performanslar gözlenmiştir.</li>
	<li>Ko-transfeksiyon (faiz proteini ve minigene) kullanırken, endojen mRNA'dan sonuç almaktan kaçınmak için transknakt olmayan hücrelerle bir kuyu tutun. E1A durumunda, HEK293 hücreleri zaten E1A genini ifade30.</li>
</ol>3. İlaçların hazırlanması
NOT: Tedavi süresi ve konsantrasyonu, bazı genler için alternatif birleştirmedeki değişikliklere işaret eden literatür sonuçlarına göre seçilmiştır.
<ol><li>Hücre canlılığında hiçbir etkisi olmayan alternatif birleştirme indüksiyonuna minimum konsantrasyonu belirlemek için teste başlamadan önce bir doz-yanıt eğrisi gerçekleştirin.</li>
	<li>Etanolde 5 mM konsantrasyonda bir Paclitaxel stok çözeltisi hazırlayın. Son konsantrasyon 1 μM'dir. -20 °C'de tutun. Araç kontrolü olarak %0.02 etanol kullanın.</li>
	<li>Yaklaşık 0,5 mg/mL'de (1,66 mM) %0,9 NaCl seyrelterek bir cisplatin çözeltisi hazırlayın. Işıktan, girdaptan koruyun ve 30 dakika boyunca 37 °C termal banyoda kuluçkaya yat. Son konsantrasyon 30 μM'dir. Taze hazırlayın veya bir aya kadar 2-10 ° C'de saklayın. NOT: Tüm ilaçlar ışıktan korunmalıdır.</li>
</ol>4. Hücre tedavisi ve toplanması
NOT: HEK293 stabil hücreler transfeksiyondan 48 saat sonra toplanmış ve bunun için transeksiyondan 24 saat sonra tedavi edilmiştir çünkü en yüksek Nek4 ekspresyon seviyesi 48 saat içinde elde edilir. Bununla birlikte, şu anda yüksek düzeyde 13S izoform ekspresyoform ifadesi (%90'a kadar) gözlenmiştir. 13S izoform oranını azaltmak için, transfeksiyondan maksimum 30 saat sonra hücreleri tedavi etmeye ve toplamaya çalışın.
<ol><li>RNA/ DNase ücretsiz ipuçları ve tüpler kullanın. Üreticinin tavsiyesi üzerine fenol-kloroform reaktif ile toplam RNA ekstraksiyonu gerçekleştirin.</li>
	<li>Transfeksiyondan 24 saat sonra, floresan mikroskop kullanarak hücre morfolojisini ve transfeksiyon verimliliğini doğrulayın.</li>
	<li>Hücre kültürü ortamını, tercihen vakum pompası sistemi yerine pipet kullanarak çıkarın. Daha sonra daha önce açıklanan son konsantrasyonda kemoterapötiklerle hücre kültürü ortamı ekleyin.</li>
	<li>37 °C'de kuluçkaya yaslanın, 18 -24 saat boyunca% 5 CO 2.</li>
	<li>Hücre kültürü ortamını bir kaba atarak ve doğrudan kuyuya 0,5 - 1 mL RNA ekstraksiyon reaktifi ekleyerek RNA toplayın. Kuyular çok bir aradaysa, RNA kalitesini artırmak için 1 mL RNA ekstraksiyon reaktifi kullanın.</li>
	<li>Pipetle homojenize edin ve 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın. Bu noktada, protokol örnekleri -80 °C'de depolayarak duraklatılabilir veya hemen RNA ekstraksiyonuna devam edebilir. UYARI: Fenol bazlı RNA ekstraksiyon reaktifi toksiktir ve tüm prosedürler kimyasal bir duman kaputunda yapılmalı ve kalıntılar uygun şekilde atılmalıdır.</li>
</ol>5. RNA ekstraksiyonu ve cDNA sentezi
<ol><li>Duman kaputunda numuneleri çözün ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın. 0.1 -0.2 mL kloroform ekleyin ve kuvvetlice çalkalanın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkaya yatır.</li>
	<li>12.000 x g ve 4 °C'de 15 dakika santrifüj.</li>
	<li>Üst sulu fazı toplayın ve yeni bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın. Toplam hacmin yaklaşık% 60'ını toplayın; ancak, DNA'yı veya organik (alt) fazı toplamayın.</li>
	<li>0.25 - 0.5 mL izopropanol ekleyin ve 4 kez ters çevrilerek ajite edin. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatır.</li>
	<li>10 dakika boyunca 12.000 x g'da, 4 °C'de santrifüj ve süpernatantı atın.</li>
	<li>RNA peletini etanol ile iki kez yıkayın (dietilptirokarbonat (DEPC) arıtılmış suda% 75). 5 dakika boyunca 7.500 x g'da santrifüj ve etanol atın.</li>
	<li>Tüpü bir havlu kağıdına ters çevirerek fazla etanol çıkarın ve ardından peleti 5 - 10 dakika boyunca kısmen kurutmak için tüpü bir duman kaputunun içinde açık bırakın.</li>
	<li>RNA peletini 15 μL DEPC arıtıcı suda yeniden sunun.</li>
	<li>RNA kalitesini doğrulamak için 230 nm, 260 nm ve 280 nm'de emicilik kullanarak toplam RNA'yı ölçün.</li>
	<li>Toplam RNA kalitesini doğrulamak için, 30 dk 31 için% 2.5 sodyum hipoklorit çözeltisinin% 1.2'si (v / v) ile önceden işlenmiş% 1 agarose jelçalıştırın.</li>
	<li>Toplam RNA'nın 1-2 μg'ını kullanarak cDNA sentezi gerçekleştirin.<ol>
<li>Pipet RNA, 1 μL oligo-dT (50 μM), 1 μL dNTP (10 mM) ve ses seviyesini çekirdeksiz su ile 12 μL'ye kadar oluşturur. Termositte 65 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Reaksiyon karışımını soğutmak ve hazırlamak için termositlerden numuneleri çıkarın: 4 μL ters transkriptaz tamponu, 2 μL dithiothreitol (DTT) ve 1 μL ribononiklaaz inhibitörü. 2 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.</li>
		<li>1 μL termo-kararlı ters transkriptaz ekleyin. 37 °C'de 50 dakika kuluçkaya yatırın ve enzimi 70 °C'de 15 dakika inaktive edin. NOT: cDNA birkaç hafta boyunca -20 °C'de saklanabilir. Putatif intron-retansiyon olayları ayrımcılığından kaynaklanan genomik kontaminasyon için ters olmayan bir transkriptaz (NRT) kontrolü gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. pMTE1A minigene PCR
<ol><li>Aşağıdaki koşullarla reaksiyon bileşimi (1,5 mM MgCl2, 0,3 mM dNTP karışımı, her astarın 0,5 μM'si, sıcak başlangıçlı Taq Polymerase'nin 2,5 U'su ve 150 ng cDNA) ile PCR gerçekleştirin: 2 dakika için 94 °C, 29 döngü: 1 dakika için 94 °C, 2 dakika için 50 °C, 2 dakika için 72 °C, 10 dakika için 72 °C.</li>
	<li>PCR ürününün 20-25 μL'sini nükleik asit lekesi içeren% 3 agarose jeline yükleyin ve yaklaşık 1 saat boyunca 100 V'ta çalıştırın.</li>
</ol>7. Bir görüntü işleme ve analiz yazılımı kullanılarak jelin analizi32
<ol><li>Çalıştırdıktan sonra, herhangi bir bant doygunluğunu önleyen jeli (jel görüntüleme toplama sistemi kullanarak) fotoğraflayın ve bir görüntü işleme yazılımı kullanarak bantları ölçün.</li>
	<li>Niceleme için sırasıyla 13S, 12S ve 9S izoformlarına karşılık gelecek şekilde ~631 bp, ~493 bp ve ~156 bp bantlarını göz önünde bulundurun.</li>
	<li>Yazılımın Dosya menüsünden, görüntüleme alma sisteminden elde edilen görüntü dosyasını açın. Gri tonlamalı olarak dönüştürün, parlaklığı ve kontrastı ayarlayın ve gerekirse aykırı gürültüyü ortadan kaldırın.</li>
	<li>Dikdörtgen Seçimi aracıyla ilk şeridin etrafına bir dikdörtgen çizin ve Çözümle | Jeller | İlk Şerit komutunu seçin veya bunun için klavye kısayoluna basarak.</li>
	<li>İlk şeritteki dikdörtgenin ortasında tıklatıp tutmak ve bir sonraki şeride sürüklemek için fareyi kullanın. Analiz | Git Jeller | Sonraki Şerit'i seçin veya kullanılabilir kısayola basın. Bu adımı kalan tüm şeritlere tekrarlayın.</li>
	<li>Tüm şeritler vurgulandıktan ve numaralandıktan sonra Analiz | Jeller | Her şeridin bir profil arsa çizmek için Şeritler çizin.</li>
	<li>Düz çizgi seçim aracıyla, her bir tepenin tabanı boyunca her banda karşılık gelen bir çizgi çizerek arka plan gürültüsünü dışarıda bırakın. Tüm zirveler, her şeritten kapatıldıktan sonra, Asa aracını seçin ve her tepenin içini tıklayın. Vurgulanan her tepe için, görüntülenen Sonuçlar penceresinde ölçümler açılmalıdır.</li>
	<li>Her örnek için 3 bandın tümlerinden yoğunluğu toplayın ve her bir izoformun toplam yüzdesini hesaplayın.</li>
	<li>Her izoformun yüzdelerini veya tedavi edilmemiş örneklere göre yüzdedeki farkları çizin. NOT: Üç E1A çeşidinin toplamının %100'e eşit olması gerektiğinden emin olun.</li>
</ol>

<ol><li>Ule, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Splicing+Regulatory+Networks%3A+Functions%2C+Mechanisms%2C+and+Evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution.</a> Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).</li>
<li>Nilsen, T. W., Graveley, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+eukaryotic+proteome+by+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing.</a> Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).</li>
<li>Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+and+their+transduction+pathways+regulating+alternative+splicing%3A+a+new+dimension+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome.</a> Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).</li>
<li>Kornblihtt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing%3A+a+pivotal+step+between+eukaryotic+transcription+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).</li>
<li>Zhong, X. -Y., Ding, J. -H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+SR+protein+phosphorylation+and+alternative+splicing+by+modulating+kinetic+interactions+of+SRPK1+with+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones.</a> Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).</li>
<li>Misteli, T., Cáceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+Phosphorylation+of+SR+Proteins+Is+Required+for+Their+Recruitment+to+Sites+of+Transcription+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).</li>
<li>Kanopka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+adenovirus+alternative+RNA+splicing+by+dephosphorylation+of+SR+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins.</a> Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).</li>
<li>Anufrieva, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy-induced+stress+response+is+associated+with+downregulation+of+pre-mRNA+splicing+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells.</a> Genome Medicine. 10 (1), 49(2018).</li>
<li>Shultz, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRSF1+Regulates+the+Alternative+Splicing+of+Caspase+9+Via+A+Novel+Intronic+Splicing+Enhancer+Affecting+the+Chemotherapeutic+Sensitivity+of+Non-Small+Cell+Lung+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells.</a> Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).</li>
<li>Gabriel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+splicing+factor+SRSF4+in+cisplatin-induced+modifications+of+pre-mRNA+splicing+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis.</a> BMC Cancer. 15, (2015).</li>
<li>Lee, S. C. -W., Abdel-Wahab, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+splicing+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of splicing in cancer.</a> Nature Medicine. 22 (9), 976-986 (2016).</li>
<li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37 (4), 331-340 (2005).</li>
<li>Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+minigene+approach+to+analyze+tissue-specific+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing.</a> Brain Research Protocols. 4 (3), 383-394 (1999).</li>
<li>Zerler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+E1A+coding+sequences+that+enable+ras+and+pmt+oncogenes+to+transform+cultured+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Adenovirus E1A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 6 (3), 887-899 (1986).</li>
<li>Gattoni, R., Schmitt, P., Stevenin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+splicing+of+adenovirus+E1A+transcripts%3A+characterization+of+novel+reactions+and+of+multiple+branch+points+abnormally+far+from+the+3%27+splice+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro splicing of adenovirus E1A transcripts: characterization of novel reactions and of multiple branch points abnormally far from the 3' splice site.</a> Nucleic Acids Research. 16 (6), 2389-2409 (1988).</li>
<li>Stephens, C., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+splicing+yields+novel+adenovirus+5+E1A+mRNAs+that+encode+30+kd+and+35+kd+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Differential splicing yields novel adenovirus 5 E1A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins.</a> The EMBO journal. 6 (7), 2027-2035 (1987).</li>
<li>Ulfendahl, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+adenovirus-2+E1A+mRNA+encoding+a+protein+with+transcription+activation+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties.</a> The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).</li>
<li>Berk, A. J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+adenovirus+2+early+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of the adenovirus 2 early mRNAs.</a> Cell. 14 (3), 695-711 (1978).</li>
<li>Svensson, C., Pettersson, U., Akusjärvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+of+adenovirus+2+early+region+1A+mRNAs+is+non-sequential%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential.</a> Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).</li>
<li>Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. C., Kobarg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+interaction+partners+for+Nek4.1+and+Nek4.2+isoforms%3A+from+the+DNA+damage+response+to+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Science%22%5BJournal%5D)">New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing.</a> Proteome Science. 13 (1), 11(2015).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Akt-SRPK-SR+Axis+Constitutes+a+Major+Pathway+in+Transducing+EGF+Signaling+to+Regulate+Alternative+Splicing+in+the+Nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus.</a> Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).</li>
<li>Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+alternative+splicing+in+vivo+by+overexpression+of+antagonistic+splicing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors.</a> Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).</li>
<li>Zhong, X. -Y., Ding, J. -H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+SR+protein+phosphorylation+and+alternative+splicing+by+modulating+kinetic+interactions+of+SRPK1+with+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones.</a> Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).</li>
<li>Naro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosomal+kinase+NEK2+is+a+novel+splicing+factor+kinase+involved+in+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).</li>
<li>Lu, C. -C., Chen, T. -H., Wu, J. -R., Chen, H. -H., Yu, H. -Y., Tarn, W. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+and+Molecular+Characterization+of+the+Splicing+Factor+RBM4%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4.</a> PLoS ONE. 8 (3), 59092(2013).</li>
<li>Jarnæss, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+Factor+Arginine%2FSerine-rich+17A+%28SFRS17A%29+Is+an+A-kinase+Anchoring+Protein+That+Targets+Protein+Kinase+A+to+Splicing+Factor+Compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).</li>
<li>Bressan, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+association+of+human+Ki-1%2F57+with+pre-mRNA+splicing+events%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events.</a> FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).</li>
<li>Vivarelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraquat+Modulates+Alternative+Pre-mRNA+Splicing+by+Modifying+the+Intracellular+Distribution+of+SRPK2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2.</a> PLoS ONE. 8 (4), 61980(2013).</li>
<li>Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+Human+Cell+Line+Transformed+by+DNA+from+Human+Adenovirus+Type+5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.</a> Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).</li>
<li>Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+gel%3A+A+simple+agarose+gel+for+analyzing+RNA+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality.</a> Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+3%27+splice+site+choice+in+vivo+by+ASF%2FSF2+and+hnRNP+A1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Control of 3' splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1.</a> Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).</li>
<li>Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+an+in+vitro+RNA+processing+system+for+CT%2FCGRP+precursor+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).</li>
</ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Minigenes, küresel alternatif birleştirme in vivo etkilerini belirlemek için önemli araçlardır. Adenoviral minigene E1A,13,14hücredeki bunların miktarını artırarak proteinlerin rolünü değerlendirmek için on yıllardır başarıyla kullanılmaktadır. Burada, kemoterapötik maruziyet sonrası alternatif birleştirmeyi değerlendirmek için minigene E1A kullanımını öneriyoruz. Nek4 isoform 1'i ifade eden kararlı bir hücre hattı kullanıldı ve geçici transeksiyonun neden olduğu...

Birleştirme, 5'mRNA kapaklama ve 3'mRNA poliadenilasyonuna aynı anda meydana gelen ökaryotik mRNA işlemede en önemli adımlar arasındadır, intron kaldırma ve ardından exon kavşağı. Birleştirme alanlarının (SS) spliceosome tarafından tanınması, küçük ribonükleoproteinler (snRNP U1, U2, U4 ve U6), küçük RNA'lar (snRNA'lar) ve birkaç düzenleyici protein1 içeren bir ribonükleoprotein kompleksi, birleştirme için gereklidir.
Ökaryotlarda intron kaldırmanın (konsitutive birleştirme) yanı sıra, intronlar tutulabilir ve eksonlar dışlanabilir, mRNA alternatif birleştirme (AS) adı verilen işlemi yapılandırabilir. Alternatif pre-mRNA birleştirme, ökaryotik genomların kodlama kapasitesini genişleterek nispeten az sayıda genden çok sayıda protein üretilmesini sağlar. Birden fazla ekson içeren insan mRNA'larının% 95-100'ünün alternatif birleştirme2,3'tengeçebileceği tahmin edilmektedir. Bu, nöronal gelişim, apoptoz aktivasyonu ve hücresel stres yanıtı4gibi biyolojik süreçler için temeldir Organizmaya aynı gen repertuarını kullanarak hücre işleyişini düzenlemek için alternatifler sağlar.
Alternatif birleştirme için gerekli makine, konsitütif birleştirme için kullanılanla aynıdır ve SS kullanımı alternatif birleştirme oluşumu için ana belirleyicidir. Constitutive birleştirme, genellikle spliceosome tanıma için konsensüs motiflerine daha benzer olan güçlü birleştirme alanlarının kullanımı ile ilgilidir5.
Alternatif eksonlar tipik olarak, cis düzenleyiciunsurları, 5'SS ve 3'SS'deki diziler bu eksonları kuşatırken, spliceosome için daha düşük bir bağlama kapasitesi gösterdiğinde, konstrüktif eksonlardan daha az verimli olarak tanınır. mRNA ayrıca eksonlarda (eksonik birleştirme arttırıcıları (ESE'ler) ve eksonik birleştirme susturucularında (ESSs)) ve intronlarda (intronic splicing enhancers (ISS) ve intronic splicing susturucularında (ISSs)) bulunan ve eksonik kullanımı artıran veya bastıran güçlendiriciler veya susturucular (ISSs) adlı bölgeleriiçerir. Bu diziler, düzenleyici öğeler veya birleştirme faktörleri (SF) tarafından tanınır. SF'ler esas olarak iki protein ailesi tarafından temsil edilir, ESE'lere bağlanan serine / arginin zengin birleştirme faktörleri (SRSF'ler) ve ESSs dizilerine bağlanan heterojen nükleer ribonükleoproteinler (hnRNPs) ailesi5.
Alternatif birleştirme, etkileşim ortaklarını değiştiren trans faktörlerin fosforilasyonu / defosforilasyonu ve birleştirme faktörlerinin hücresel lokalizasyonu ile modüle edilebilir6,7,8. Birleştirme faktörlerinin yeni düzenleyicilerinin belirlenmesi, birleştirmeyi ve dolayısıyla bazı kanser tedavilerini düzenlemek için yeni araçlar sağlayabilir.
Anufrieva ve ark.9, bir mRNA mikroarray gen ekspresyon profilinde, 101 hücre hattında ve farklı stres koşullarından sonra (platin bazlı ilaçlar, gama ışınlama, topoisomeraz inhibitörleri, tirozin kinaz inhibitörleri ve taksonlar) spliceosomal bileşenlerin seviyelerinde tutarlı değişiklikler gözlemledi. Birleştirme paterni ve kemoterapi etkinliği arasındaki ilişki, kemoterapiye dirençli olan akciğer kanseri hücrelerinde, kaspaz-9 varyantları oranındaki değişiklikleri gösteren10. Kemoterapötik panel ile tedavi edilen HEK293 hücreleri, pro-apoptotik varyantlarda bir artışla birleştirmede değişiklikler göstermektedir. Gabriel ve ark.11, farklı hücre hatlarında cisplatin tedavisinden sonra en az 700 birleştirme etkinliğinde değişiklikler gözlemledi ve birleştirme yollarının cisplatin etkilendiğine işaret etti. Birleştirme modülatörleri, birleştirmenin tümöral gelişim ve esas olarak kemoterapi yanıtı 12 için önemli olduğunu gösteren anti-tümöral aktivitegöstermiştir. Bu nedenle, kemoterapötikler gibi hücresel stresör ajanlarından sonra birleştirmeyi düzenleyen yeni proteinleri karakterize etmek, yeni tedavi stratejilerini keşfetmek için çok önemlidir.
Interactome çalışmalarından alternatif birleştirme düzenlemesinin ipuçları, özellikle yeni veya karakteristik olmayan proteinlerin işlevlerini karakterize etmek için önemlidir, proteinin AS'deki gerçek rolünü doğrulamak için daha genel ve basit bir yaklaşım talep edebilir. Minigenler, birleştirme regülasyonını etkileyen bir proteinin genel rolünün analizi için önemli araçlardır. Alternatif olarak birikmiş ve kuşatıcı genomik bölgeler içeren ilgi geninden segmentler içerirler13. Bir minigene aracı kullanmak, minigenenin uzunluğu gibi küçük olan ve bu nedenle amplifikasyon reaksiyonu için bir sınırlama olmayan çeşitli avantajlarla in vivo birleştirmenin analizini sağlar; aynı minigene farklı hücre hatlarında değerlendirilebilir; tüm hücresel bileşenler, esas olarak çeviri sonrası modifikasyonlarını düzenleyen (fosforilasyon ve hücre bölmelerindeki değişiklikler) mevcuttur ve13,14. Ayrıca, hücresel stres sonrası alternatif birleştirme düzenindeki değişiklikler gözlenebilir ve minigene sisteminin kullanımı, farklı uyaranlar tarafından modüle edilen yolu tanımlamaya izin verir.
13,14, ancak, ön test olarak, minigeneE1A 15,5'SS seçiminin vivo olarak incelenmesi için çok iyi kurulmuş bir alternatif birleştirme muhabir sistemidir. Sadece bir genden, E1A, beş mRNA'lar, üç farklı 5′ splice bölgesinin ve bir büyük veya bir küçük 3′ splice sitesinin seçimine dayalı alternatif birleştirme ile üretilir16,17,18. E1A varyantlarının ekspresyonu Adenoviral enfeksiyon dönemine göre değişir19,20.
Daha önce her iki Nek4 izoformlarının da SRSF1 ve hnRNPA1 gibi birleştirme faktörleriyle etkileşime girdiğini ve isoform 2 değişiklikleri E1A alternatif birleştirmeyi minigene ederken, isoform 1'in bu21. İzoform 1 en bol izoform olduğundan ve kemoterapi direncini ve DNA hasar yanıtını değiştirdiğinden, stres durumunda minigene E1A alternatif birleştirmeyi değiştirip değiştiremeyeceğini değerlendiriyoruz.
Minigene tahlil basit, düşük maliyetli ve hızlı bir yöntemdir, çünkü sadece RNA ekstraksiyonu, cDNA sentezi, amplifikasyon ve agarose jel analizlerine ihtiyaç duyar ve farklı tedavilerin hücresel alternatif birleştirme deseni üzerindeki etkisine kadar ilgi çekici bir protein tarafından alternatif birleştirme üzerinde olası bir etkiden bu yana değerlendirmek için yararlı bir araç olabilir.

<table><tbody><tr><td>100 pb DNA Merdiven</td><td>Invitrogen</td><td>15628-050</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyu plakası</td><td>Sarstedt</td><td>833920</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Sigma</td><td>A9539-250G</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Sigma</td><td>P4394</td><td></td></tr><tr><td>DEPC su</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9920</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>dNTP karışımı</td><td>ThermoFisher</td><td>10297-018</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu - FBS</td><td>ThermoFisher</td><td>12657029</td><td></td></tr><tr><td>Floresan Mikroskobu</td><td>Leica</td><td>DMIL LED FLUO</td><td></td></tr><tr><td>Jel görüntüleme toplama sistemi - ChemiDoc Jel Imagin Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP - pEGFPC3</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 kararlı hücreler - HEK293 Flp-In</td><td></td><td></td><td>Flp-In &trade'den üretilen; T-REx ve ticaret; 293 - İnvitrojen ve ref 21'de açıklanmıştır</td></tr><tr><td>Higromisin B</td><td>ThermoFisher</td><td>10687010</td><td>Flp-In hücrelerinin bakımı için kullanılır</td></tr><tr><td>Görüntü işleme ve analiz yazılımı - FIJI yazılımı</td><td></td><td></td><td>ref. 32</td></tr><tr><td>Lipid bazlı transfeksiyon reaktifi - jetOPTIMUS Polyplus Reaktif</td><td>Polyplus</td><td>117-07</td><td></td></tr><tr><td>Oligo DT</td><td>ThermoFisher</td><td>18418020</td><td></td></tr><tr><td>Paclitxel</td><td>Invitrogen</td><td>P3456</td><td></td></tr><tr><td>Plaka Okuyucu / UV absorbans</td><td>Biotech</td><td></td><td>Epoch Biotek / Take3 adaptörü</td></tr><tr><td>pMTE1A plazmidi</td><td></td><td></td><td>Dr. Adrian Krainer tarafından sağlanmıştır</td></tr><tr><td>pMTE1A F</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 5' -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3</td><td></td></tr><tr><td>pMTE1A R Canlandırıcı</td><td></td><td>5' -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3'</td><td></td></tr><tr><td>Soğutmalı santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>F5810R</td><td></td></tr><tr><td>Ters Transkriptaz - M-MLV</td><td>ThermoFisher</td><td>28025013</td><td></td></tr><tr><td>Ters transkriptaz - Üst simge IV</td><td>ThermoFisher</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Ribunuclease inhibitörü RNAse OUT</td><td>ThermoFisher</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>RNA ekstraksiyonu fenol-kloroform bazlı reaktif - Trizol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>SybrSafe DNA jel lekesi</td><td>ThermoFisher</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Taq</td><td>Platinum</td><td>Thermo 10966026</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasiklin</td><td>Sigma</td><td>T3383</td><td>Bayrak boş veya Nek4 için kullanılır - Bayrak ifadesi indüksiyon</td></tr><tr><td>Thermocycler Bio-Rad Bio-Rad</td><td></td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma</td><td>T4799</td><td></td></tr></tbody></table>

mrna birleştirme değişikliklerini incelemek için e1a minigene aracını kullanma

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

mRNA işleme, mRNA'yı çeviriye hazırlamak için 5'kapaklama, çoklu A ekleme ve birleştirme gibi birden fazla eşzamanlı adım içerir. Konsültasyonel birleştirmenin yanı sıra, alternatif mRNA birleştirme, bir genden çok fonksiyonlu proteinlerin ifadesini sağlar. Interactome çalışmaları genellikle yeni veya bilinmeyen proteinler için ilk analiz olduğundan, yem proteininin birleştirme faktörleriyle ilişkilendirmesi, mRNA birleştirme sürecine katılabileceğinin bir göstergesidir, ancak hangi bağlamda veya hangi genlerin düzenlendiğini belirlemek ampirik bir süreçtir. Bu işlevi değerlendirmek için iyi bir başlangıç noktası klasik minigene aracını kullanmaktır. Burada, farklı hücresel stres uyaranları sonrası alternatif birleştirme değişikliklerini değerlendirmek için adenoviral E1A minigene kullanımını sunuyoruz. Farklı stres tedavilerinden sonra NEK4 proteinini bıçaklayarak HEK293'te E1A minigene'nin birlenmesini değerlendirdik. Protokol, E1A minigene transfection, hücre tedavisi, RNA ekstraksiyonu ve cDNA sentezini, ardından PCR ve jel analizini ve E1A ekli varyantların nicelleştirilmesini içerir. Bu basit ve köklü yöntemin belirli tedavilerle birlikte kullanılması, hücresel süreçlere veya mRNA birleştirme ile hangi genlerin düzenlenebileceğine ışık tutmak için güvenilir bir başlangıç noktasıdır.

Kemoterapi sergisinden sonra hücrelerde birleştirme profilindeki değişiklikleri değerlendirmek için E1A minigene kullanılarak 5' splice sites tahlil yapıldı. Paclitaxel veya cisplatin tedavisinden sonra HEK293 stabil hücrelerinde AS regülasyonunda Nek4 - isoform 1'in rolü değerlendirildi.
Adenoviral E1A bölgesi, farklı splice donörlerinin kullanımı nedeniyle bir RNA öncüsünden üç ana mRNA'nın üretiminden sorumludur. Ortak 5' ve ...

Bu protokol, kemoterapötik tedaviden sonra alternatif birleştirme regülasyonunda karakteristik olmayan işleve sahip bir proteinin rolünü değerlendirmek için hızlı ve kullanışlı bir araç sunar.

mRNA Birleştirme Değişikliklerini incelemek için E1A Minigene Aracını Kullanma

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

Bu protokolün genel amacı, genel mRNA birleştirme değişikliklerini değerlendirmek için minigene E1A2'yi kullanmak için ayrıntılı rehberlik sağlamaktır. Bu, özel rejimlere veya laboratuvar koşullarına gerek kalmadan alternatif birleştirme düzenlemesinde hedef proteinin işlevini değerlendirmek için hızlı, ucuz ve basit bir araçtır. HEK 293 hücrelerini ilgi geninin kararlı ifadesiyle kült ederek başlayın.Hücreleri % 0.25 tripsin EDTA kullanarak bölün, ardından altı kuyu plakalarında kuyu başına 300.000 hücreyi plakalayın ve% 5 karbondioksitte 37 santigrat derecede 24 saat kuluçkaya yatırın. 24 saat sonra, izdihamı kontrol edin ve HEK 293 kararlı hücrelerini sadece% 70 ila% 80 birleştiğinde transfect edin. Hücre kültürü ortamını bir pipetle dikkatlice çıkarın, ardından antibiyotiksiz iki mililitre tam DMEM ortamı ekleyin ve plakayı inkübatöre geri koyun.Transfeksiyon tamponu ile bir tüp hazırlayın, ardından iki mikrogram pMTE1A DNA, girdap ekleyin ve iki mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin. Vortex tekrar ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatır. Plakaları inkübatörden çıkarın ve transfeksiyon karışımını damla açısından dikkatlice ekleyin.Transfeksiyondan altı saat sonra, Nek4 ekspresyon indüksiyonu için HEK 293 kararlı hücrelerine tetrasiklin ekleyin. Transfeksiyondan 24 saat sonra, floresan mikroskop kullanarak hücre morfolojisini ve transfeksiyon verimliliğini doğrulayın. Hücre kültürü ortamını çıkarmak için bir pipet kullanın, ardından kemoterapötiklerle hücre kültürü ortamı ekleyin.Hücreleri 24 saat daha kuluçkaya yatır. RNA toplamak için hücre kültürü ortamını atın ve doğrudan kuyuya 0,5 ila 1 mililitre RNA ekstraksiyon reaktifi ekleyin. Kuyular çok uyumluysa, RNA kalitesini artırmak için bir mililitre RNA ekstraksiyon reaktifi kullanın.Hücreleri bir pipetle homojenize edin ve 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hemen RNA ekstraksiyonuna devam edin veya örnekleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. Numuneleri duman kaputunda çözün ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın.0,1 ila 0,2 mililitre kloroform ekleyin ve kuvvetlice ajite edin, ardından oda sıcaklığında üç dakika kuluçkaya yatırın. 12.000 kez G ve dört santigrat derecede 15 dakika santrifüj, daha sonra üst sulu fazı toplayın ve yeni bir 1,5 mililitre santrifüj tüpüne aktarın. Toplam hacmin yaklaşık% 60'ını toplayın, ancak DNA'yı veya organik fazı toplamayın.0,25 ila 0,5 mililitre izopropanol ekleyin ve numuneyi dört kez ters çevrilerek ajite edin. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın, sonra dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 12.000 kez G'de santrifüjleyin ve üstnatantı atın. RNA peletini etanol ile iki kez yıkayın ve beş dakika boyunca 7.500 kez G'de santrifüjleyin, sonra etanol atın.Tüpü bir kağıt havlu üzerinde ters çevirerek fazla etanol çıkarın, ardından peleti beş ila 10 dakika boyunca kısmen kurutmak için tüpü bir duman kaputunun içinde açık bırakın. RNA peletini 15 mikrolitre DEPC arıtılmış suda yeniden askıya alın. Toplam RNA'yı ölçün ve absorbansı 230, 260 ve 280 nanometre olarak ölçerek RNA kalitesini doğrulayın.Toplam RNA kalitesini doğrulamak için, 30 dakika boyunca %2,5 sodyum hipoklorit çözeltisinin %1,2'si ile önceden tedavi edilmiş %1 agarose jel çalıştırın. Toplam RNA'nın bir ila iki mikrogramını kullanarak cDNA sentezi gerçekleştirin. RNA, bir mikroligo d-T mikrolitresi, bir mikrolitre DNTP ve nükleaz içermeyen suyu 12 mikrolitreye birleştirin.Termo Cycler'daki reaksiyona 65 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatır. Termo Cycler'dan numuneleri çıkarın ve dört mikrolitre ters transkriptaz tamponu, iki mikrolitre DTT ve bir mikrolitre ribonikleaz inhibitörü ekleyin. İki dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yaslanın.Bir mikroliter termo-kararlı ters transkriptaz ekleyin ve 50 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Enzimi 70 santigrat derecede 15 dakika boyunca etkisiz hale getir. Metin el yazmasında açıklandığı gibi PCR yapın, ardından pcr ürününün 20 ila 25 mikrolitresini nükleik asit lekesi içeren% 3 agarose jel üzerine yükleyin ve yaklaşık bir saat boyunca 100 voltta çalıştırın.Herhangi bir bant doygunluğundan kaçınarak jeli fotoğraflayın ve bir görüntü işleme yazılımı kullanarak bantları ölçün. 631, 493 ve 156 baz çiftlerindeki bantlar sırasıyla 13S, 12S ve 9S izoformlarına karşılık gelir. Yazılımın Dosya menüsünden görüntü dosyasını açın ve gri ölçeğe dönüştürün.Parlaklık ve Kontrast'ı ayarlayın, ardından gerekirse aykırı paraziti giderin. Dikdörtgen seçim aracıyla ilk şeridin etrafına bir dikdörtgen çizin ve Analiz Et, Jeller ve İlk Şeridi Seç komutundan veya klavye kısayolunu kullanarak seçin. İlk şeritteki dikdörtgenin ortasında tıklatıp tutmak için fareyi kullanın ve bir sonraki şeride sürükleyin.Analiz Et, Gel'ler'e gidin ve Sonraki Şeridi Seç'i seçin. Kalan tüm şeritler için bu adımı yineleyin. Tüm şeritler vurgulandıktan ve numaralandıktan sonra, her şeridin bir profil grafiğini çizmek için Analiz, Jeller ve Çizim Şeritleri'ne gidin.Arka plan gürültüsünü dışarıda bırakarak her bir banta karşılık gelen her tepenin tabanı boyunca bir çizgi çizmek için düz çizgi seçim aracını kullanın. Her şeritten tüm tepeler kapatıldıktan sonra, asa aracını seçin ve her tepenin içini tıklayın. Ölçümler, vurgulanan her tepe için sonuçlar penceresinde açılmalıdır.Yalnızca 631, 493 ve 156 baz çift bantlarına karşılık gelen 13S, 12S ve 9S zirvelerini göz önünde bulundurun. Elektronik tablo düzenleyicisi için yoğunluk verilerini kopyalayın ve her örnek için üç banttan da yoğunluğu toplayın, ardından her izoform için toplam göre yüzdeyi hesaplayın. Her izoformun yüzdelerini veya tedavi edilmemiş örneklere göre yüzdedeki farkları çizin.Üretilen her izoformdan mRNA oranını değerlendirerek alternatif birleştirme üzerindeki etkiyi gözlemlemek için E1A'dan minigene içeren bir plazmid kullanılmıştır. E1A izoformlarının bazal ekspresyolü, E1A ekspresyonunun hücre çizgisine ve zamanına bağlı olarak ortaya çıktı. HEK 293 stabil hücre hattı veya HEK 293 rekombinaz içeren bölge, HeLa hücrelerine kıyasla daha yüksek bir 13S ifadesi gösterdi, ancak 48 saatlik E1A ifadesinden sonra benzer 13S ve 12S izoform seviyeleri gösterdi.Cisplatin'e maruz kalan hücreler, 12S ekspresyondan yana beş asal S-S birleştirme seçiminde bir kayma gösterdi. Bu etki HEK 293'te Bayrak boş vektörü ve Nek4'ün isoform'larını kasten ifade ederken gözlenmiştir. Paclitaxel tedavisinden sonra alternatif birleştirmedeki değişiklikler çok gizliydi, ancak değişikliklerin yönleri Flag ve Nek4 eksprese hücrelerinde zıttı.Bu protokolü gerçekleştirirken, özellikle HEK 293 hücrelerini kullanırken endojen E1A ifadesiyle yanlış yorumlamayı önlemek için transtransfected ve ters olmayan transkriptaz kontrolleri kullanmak önemlidir. Olumlu sonuçlar alındıktan sonra kemoterapötik yanıtla ilgili spesifik genlerin alternatif biriktiği değerlendirilebilir. Bazı etkiler gözlendiğinde, bu basit protokol, proteinin örneğin kemoterapi yanıtında alternatif birleştirmeyi düzenleyen bir rol oynadığı daha tutarlı yollar için bu çalışmaları yönlendirebilir.

using-the-e1a-minigene-tool-to-study-mrna-splicing-changes

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Alternatif ekleme düzenlemesinin, çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde önemli bir hücresel program olan epitelyal-mezenkimal geçişe (EMT) katkıda bulunduğu gösterilmiştir. Burada, EMT sırasında alternatif eklemenin tespiti için indüklenebilir bir EMT modeli kullanan bir yöntemi açıklıyoruz.

Epitel-Mezenkimal Geçiş sırasında alternatif birleştirme Algılama

Tandem birleştirme olayları, birbirinden 12 nükleotidden daha az uzaklıkta meydana gelir. Bu tür ek varyantlarının oranlarının niceliksel olarak belirlenmesi, mutlak bir kantitatif PCR yaklaşımı kullanılarak mümkündür. Bu el yazması, iki birleştirme olayının Serine-701 dahil etme/dışlama ve α/β C-uçları ile sonuçlandığı STAT3 geninin ek varyantlarının nasıl ölçülebileceğini açıklamaktadır.

Mutlak ve Bağıl Kantitatif PCR Veri birleştirme STAT3 Splice Varyant Dökümünü belirlememize

Burada katı tümörler ve hematolojik malignitelerde ilaç direnci üzerinde anormal yapıştırma etkisini araştıran amaçlayan bir protokol açıklar. Bu hedefe, biz RNA seq ile ebeveyn ve in vitro dirençli modellerin transkriptomik profillerini analiz ve aday genler doğrulamak için bir QRT-PCR tabanlı bir yöntem kurdu.

İlaç Direnci İlgili Roman Splice türevlerini algılamak için RNA sıralamayı kullanarak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Kanser Modelleri

Kısa antianlamlı oligonucleotides fare beyin bölümlerde alternatif pre-mRNA yapıştırma desenleri algılamak için kullandığı bir in situ hibridizasyon (ISH) protokolü tanımlanır.

Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Dairesel RNA'lar üreten muhabir genleri klonlayıp analiz ediyoruz. Bu muhabir genler doğrusal birleştirme analiz etmek ve Alu elemanları içeren yapılar daha büyüktür. Dairesel RNA'ları araştırmak için yapılar hücrelere dönüştürülr ve doğrusal RNA çıkarıldıktan sonra RT-PCR kullanılarak ortaya çıkan RNA analiz edilir.

Dairesel RNA'ları Analiz Etmek Için Minigen İçeren Alu Elementin Kullanımı

Bu makalede, (a) U1 snRNP'nin nükleer özlerden tükenmesi ve eşlik eden birleştirme aktivitesi kaybı ile ilgili deneysel prosedürler açıklanmaktadır; ve (b) U1-tükenmiş ekstrakttaki birleştirme aktivitesinin galektin-3 - Boncuklara bağlı U1 snRNP parçacıklarının anti-galektin-3 antikorları ile kovalent olarak birleştiğinde yeniden kavrar.

Boncuklar Üzerinde Galectin-3 - U1 snRNP Kompleksi ile Birleştirme Etkinliğinin Tamamlayıcısı

Alternatif ekleme (AS) ve alternatif poliadenilasyon (APA), transkript izoformlarının ve ürünlerinin çeşitliliğini genişletir. Burada, deneysel koşullar arasında değişen AS ve APA'yı tespit etmek ve görselleştirmek için toplu RNA-seq ve 3' uç dizileme testlerini analiz etmek için biyoinformatik protokolleri açıklıyoruz.

RNA-seq Verilerinde Alternatif Ekleme ve Poliadenilasyonun Tanımlanması

Bu protokol, 5'-splice bölgesi mutasyonlarının birleştirme üzerindeki etkisini izlemek için bir minigene muhabiri testini açıklar ve mutasyona bağlı birleştirme inhibisyonunun kurtarılması için bastırıcı U1 snRNA geliştirir. Muhabir ve bastırıcı U1 snRNA yapıları HeLa hücrelerinde ifade edilir ve birleştirme astar uzantısı veya RT-PCR ile analiz edilir.

Birleştirme Verimliliğini İzlemek için Muhabir Tabanlı Hücresel Test

Bir bakır büyüme testi olan ACT1-CUP1 testi, öncü mesajcı RNA (pre-mRNA) eklemesinin ve mutant ekleme faktörlerinin spleozomal fonksiyon üzerindeki etkisinin hızlı bir şekilde okunmasını sağlar. Bu çalışma bir protokol sağlar ve ilgilenilen ekleme sorusunu ele almak için mümkün olan özelleştirmeyi vurgular.

ACT1-CUP1 Testleri, Tomurcuklanan Mayadaki Splisozomal Mutantların Substrata Özgü Hassasiyetlerini Belirler

RNA düzenleme olaylarının genomik ölçekte hızlı tespiti ve güvenilir bir şekilde ölçülmesi zorlu olmaya devam etmektedir ve şu anda doğrudan RNA dizileme yöntemlerine dayanmaktadır. Burada açıklanan protokol, RNA düzenlemesini tespit etmek için basit, hızlı ve taşınabilir bir yöntem olarak mikrosıcaklık gradyan jel elektroforezi (μTGGE) kullanır.

RNA Düzenlemenin Hızlı Tespiti için Dizilemesiz Bir Yaklaşım

Keşfedin E1A minigen aracı ile mRNA birleştirme değişikliklerini incelemeyi. Bu hızlı ve ekonomik yöntem, kemoterapi sonrası alternatif birleştirme düzenlemesinde hedef proteinin işlevini değerlendirmeye yardımcı olur.

mRNA Birleştirme Değişikliklerini incelemek için E1A Minigene Aracını Kullanma

Daha fazla video keşfet