ImageJ kullanarak doku hazırlanan immünhistokimya Photomicrographs üzerinden Microglia morfoloji miktarının

Bu iskelet ve fraktal analiz yöntemlerinin genel amacı, hem doğası gereği yüksek verimli hem de hücre şekillerindeki küçük farklılıkları tespit etmek için hassas olan kantitatif yöntemler kullanarak IHC ile hazırlanan dokudan mikroglia morfolojisini ölçmektir. Bu yöntem, sağlık ve hastalık sırasında mikroglia formunun ve işlevinin nüanslarını tanımlayarak nöroinflamatuar alandaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kategorik değişkenler yerine sürekli değişkenler kullanarak mikroglia morfolojisini ölçmesidir.

Burada açıklanan yöntemler özel mülk yazılım gerektirmez ve beyin bölgelerinin taranması veya hücre hücre analizi için kullanılabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Kimberly Young olacak. Başlamadan önce AnalayzeSkeleton eklentisinin ImageJ veya Fiji'ye indirildiğinden emin olun.

Ardından, Iba1 bağışıklığı lekelenmiş beyni gösteren 30 mikronluk bir Z yığını açın. Floresan fotomikrograf kullanıyorsanız, görüntünün 8 bit olduğundan emin olun ve tüm pozitif boyamayı en iyi şekilde görselleştirmek için gri tonlamaya dönüştürün. Araç çubuğunu kullanın ve Görüntü, Arama Tabloları, Griler'i tıklatın.

Bir DAB parlak alan fotoğrafı kullanıyorsanız, önce varsayılan ayarlarla FFT Bant Geçiren filtre eklentisini kullanın. İşlem, FFT, Bant Geçiren Filtre'ye tıklayın ve ardından gri tonlamaya dönüştürün. Görüntü, mikroglia sürecini görselleştirmek için çok soluksa, araç çubuğunu kullanın ve Görüntü, Ayarla, Parlaklık / Kontrast'a tıklayın.

Minimum veya maksimum kaydırıcıları gerektiği gibi, histogramın kenarlarına kadar ayarlayın, ancak daha fazla değil. Parlaklığın ayarlanması, veri analizinde en fazla değişkenliğe neden olur ve bu nedenle en kritik adımdır. Ardından, kontrastı daha da artırmak için İşlem, Filtreler, Keskinliği Azaltma Maskesi'ni tıklatarak bir Keskinliği Azaltma Maskesi filtresi çalıştırın.

Unsharp Maskesi tarafından üretilen tuz ve karabiber gürültüsünü gidermek için bir leke giderme adımı gerçekleştirin. Araç çubuğunu kullanın ve İşlem, Gürültü, Benek Giderme'yi tıklayın. Görüntü, Ayarla, Eşik'i seçerek görüntüyü ikiliye dönüştürün.

Ardından, kalan tek piksel parazitini gidermek için ikili görüntüye Benek Giderme işlevini uygulayın. Ardından, en fazla iki pikselle ayrılmış koyu pikselleri bağlamak için İşlem, İkili, Kapat'a tıklayarak Kapat işlevini uygulayın. Ardından, İşlem, Gürültü, Aykırılıkları Kaldır'a tıklayarak aykırı değerleri kaldırın.

Görüntüyü ileride kullanmak üzere ayrı bir dosya olarak kaydettikten sonra, İşlem Yap, İkili, İskeletleştir'i tıklatarak araç çubuğunu kullanarak görüntüyü iskeletleştirin. İskeletleştirilmiş görüntüyü seçin ve Eklentiler, İskelet, İskelet'i Analiz Et'e tıklayarak ve dal bilgileri kutusunu işaretleyerek AnalyzeSkeleton eklentisini çalıştırın. Sonuçlardan ve dal bilgileri çıktılarından verileri kopyalayın ve verileri bir Excel elektronik tablosuna yapıştırın.

Excel'de, IHC ve görüntü alımından kaynaklanan iskelet parçalarını kaldırmak için verileri kırpın. İskeletleştirilmiş görüntüyü ImageJ'de açarak ve Çizgi aracını seçerek veri kümesinden hangi uzunluktaki parçaların kırpılacağını belirleyin. Ortalama uzunluğu not alarak birkaç parçayı ölçün ve veri kümesi boyunca tutarlı olması gereken bir kesme değerine karar verin.

Sırala ve Filtrele, Özel Sırala'yı tıklayarak Excel elektronik tablosunu özel sıralayın. Uç nokta voksellerine göre en büyükten en küçüğe ve yeni bir düzeyde, Mx branch PT'ye göre en büyükten en küçüğe doğru sıralayın. En fazla dal uzunluğu kesme değerinden daha az olan iki uç nokta içeren her satırı kaldırın.

Görüntüden toplanan uç noktaların toplam sayısını hesaplamak için uç noktalar sütunundaki verileri toplayın. Dal uzunluğuna göre sıraladıktan sonra dal bilgisi verileri için tekrarlayın. Tüm veriler kırpıldıktan ve toplandıktan sonra, her görüntüdeki verileri ilgili görüntüdeki mikroglia soma sayısına bölün.

İstatistiksel yazılıma son uç noktayı ve hücre başına hücre ve dal uzunluğunu girin. FracLac eklentisinin indirildiğinden emin olun. Ardından, yatırım getirisini çizmek için dikdörtgen aracını kullanın.

Kutunun tüm hücreyi yakalayacak kadar büyük olduğundan ve veri kümesi boyunca tutarlı kalabildiğinden emin olun. ROI Yöneticisi penceresinde, ROI'yi fotomikrografta rastgele seçilen bir hücreye kilitlemek için Güncelle'yi seçin. Seçili hücreyi içeren ikili görüntüyü açın.

Boya Fırçası aracını çift tıklatın, rengi siyah olarak ayarlayın ve fırça genişliğini gerektiği gibi ayarlayın. Eşleşen fotomikrografı referans olarak kullanarak, bitişik hücre işlemlerini çıkarmak, parçalanmış süreçleri bağlamak ve ilgilenilen hücreyi izole etmek için Boya Fırçası'nı kullanın. İkili hücre izole edildikten sonra, ikili dosyayı kaydedin.

Araç çubuğunu kullanarak ikili hücreyi İşlem, İkili, Anahat aracılığıyla bir anahatta dönüştürün. Araç çubuğunda, Eklentiler, Fraktal Analiz, FracLac'a tıklayarak araç çubuğunu kullanarak FracLac'ı açın ve kutu sayımı için BC'yi seçin. Izgara Tasarımı'nda, Num G'yi dört olarak ayarlayın.

Hücrenin dışbükey gövdesini ve sınırlayıcı dairesini analiz etmek için Grafik Seçenekleri'nin altında metrikler kutusunu işaretleyin. İşiniz bittiğinde Tamam'ı seçin ve ardından seçilen görüntüde bir kutu sayma taraması çalıştırmak için Tara düğmesini seçin. Gövde ve Çember Sonuçları penceresinde, istenen tüm veri sonuçlarını kopyalayın.

Ardından, Kutu Sayısı Özeti penceresinde de aynısını yapın. Kopyalanan verileri bir Excel dosyasına veya istatistiksel yazılıma aktarın. Bu grafik, yaralanmamış ve yaralanmış kortikal dokuda hücre başına mikroglia uç noktalarının ve hücre başına işlenen uzunluğun özet verilerini gösterir.

Bu, uygulanan protokol ile yapılan analizin sonucudur. Her iki durumda da Students T Testi kullanılarak istatistiksel analiz yapıldı ve üç görüntü analiz edildi. Protokolün uygulanmasında kullanıcılar arası değişkenlik konusunda dikkatli olunmalıdır.

Bu tür farklılıklar, aynı veri kümesinin aynı protokolü uygulayan iki bağımsız kullanıcı tarafından analiz edildiği burada özetlenmiştir. Eğilimler baştan sona benzer olsa da, kullanıcılar arası değişkenlik verilerin önemini etkiler. Bu prosedürü denerken, amacın orijinal fotomikrografı temsil eden bir iskelet veya anahat modeli elde etmek olduğunu hatırlamak önemlidir.

Bu, adımların araştırmacının özel ihtiyaçlarına göre değiştirilebileceği anlamına gelir. Bu videoyu izledikten sonra, hazır bilgisayar yazılımı kullanarak immünohistokimya dokusunun fotomikrograflarından mikroglia morfolojisini nasıl hızlı bir şekilde ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.