ImageJ kullanarak doku hazırlanan immünhistokimya Photomicrographs üzerinden Microglia morfoloji miktarının
5 Haziran 2018
Microglia anket ve değişmiş beyin fizyolojisi kantitatif değerlendirilecek morfolojik değişiklikleri ile tepki beyin bağışıklık hücreleri vardır. Bu iletişim kuralı özetliyor bir ImageJ microglia morfoloji hücre yaklaşım, karmaşıklık ve şekli gibi ölçümleri göre sürekli veri olarak temsil etmek için analiz protokolüne dayalı.
Bu iskelet ve fraktal analiz yöntemlerinin genel amacı, hem doğası gereği yüksek verimli hem de hücre şekillerindeki küçük farklılıkları tespit etmek için hassas olan kantitatif yöntemler kullanarak IHC ile hazırlanan dokudan mikroglia morfolojisini ölçmektir. Bu yöntem, sağlık ve hastalık sırasında mikroglia formunun ve işlevinin nüanslarını tanımlayarak nöroinflamatuar alandaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kategorik değişkenler yerine sürekli değişkenler kullanarak mikroglia morfolojisini ölçmesidir.
Burada açıklanan yöntemler özel mülk yazılım gerektirmez ve beyin bölgelerinin taranması veya hücre hücre analizi için kullanılabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Kimberly Young olacak. Başlamadan önce AnalayzeSkeleton eklentisinin ImageJ veya Fiji'ye indirildiğinden emin olun.
Ardından, Iba1 bağışıklığı lekelenmiş beyni gösteren 30 mikronluk bir Z yığını açın. Floresan fotomikrograf kullanıyorsanız, görüntünün 8 bit olduğundan emin olun ve tüm pozitif boyamayı en iyi şekilde görselleştirmek için gri tonlamaya dönüştürün. Araç çubuğunu kullanın ve Görüntü, Arama Tabloları, Griler'i tıklatın.
Bir DAB parlak alan fotoğrafı kullanıyorsanız, önce varsayılan ayarlarla FFT Bant Geçiren filtre eklentisini kullanın. İşlem, FFT, Bant Geçiren Filtre'ye tıklayın ve ardından gri tonlamaya dönüştürün. Görüntü, mikroglia sürecini görselleştirmek için çok soluksa, araç çubuğunu kullanın ve Görüntü, Ayarla, Parlaklık / Kontrast'a tıklayın.
Minimum veya maksimum kaydırıcıları gerektiği gibi, histogramın kenarlarına kadar ayarlayın, ancak daha fazla değil. Parlaklığın ayarlanması, veri analizinde en fazla değişkenliğe neden olur ve bu nedenle en kritik adımdır. Ardından, kontrastı daha da artırmak için İşlem, Filtreler, Keskinliği Azaltma Maskesi'ni tıklatarak bir Keskinliği Azaltma Maskesi filtresi çalıştırın.
Unsharp Maskesi tarafından üretilen tuz ve karabiber gürültüsünü gidermek için bir leke giderme adımı gerçekleştirin. Araç çubuğunu kullanın ve İşlem, Gürültü, Benek Giderme'yi tıklayın. Görüntü, Ayarla, Eşik'i seçerek görüntüyü ikiliye dönüştürün.
Ardından, kalan tek piksel parazitini gidermek için ikili görüntüye Benek Giderme işlevini uygulayın. Ardından, en fazla iki pikselle ayrılmış koyu pikselleri bağlamak için İşlem, İkili, Kapat'a tıklayarak Kapat işlevini uygulayın. Ardından, İşlem, Gürültü, Aykırılıkları Kaldır'a tıklayarak aykırı değerleri kaldırın.
Görüntüyü ileride kullanmak üzere ayrı bir dosya olarak kaydettikten sonra, İşlem Yap, İkili, İskeletleştir'i tıklatarak araç çubuğunu kullanarak görüntüyü iskeletleştirin. İskeletleştirilmiş görüntüyü seçin ve Eklentiler, İskelet, İskelet'i Analiz Et'e tıklayarak ve dal bilgileri kutusunu işaretleyerek AnalyzeSkeleton eklentisini çalıştırın. Sonuçlardan ve dal bilgileri çıktılarından verileri kopyalayın ve verileri bir Excel elektronik tablosuna yapıştırın.
Excel'de, IHC ve görüntü alımından kaynaklanan iskelet parçalarını kaldırmak için verileri kırpın. İskeletleştirilmiş görüntüyü ImageJ'de açarak ve Çizgi aracını seçerek veri kümesinden hangi uzunluktaki parçaların kırpılacağını belirleyin. Ortalama uzunluğu not alarak birkaç parçayı ölçün ve veri kümesi boyunca tutarlı olması gereken bir kesme değerine karar verin.
Sırala ve Filtrele, Özel Sırala'yı tıklayarak Excel elektronik tablosunu özel sıralayın. Uç nokta voksellerine göre en büyükten en küçüğe ve yeni bir düzeyde, Mx branch PT'ye göre en büyükten en küçüğe doğru sıralayın. En fazla dal uzunluğu kesme değerinden daha az olan iki uç nokta içeren her satırı kaldırın.
Görüntüden toplanan uç noktaların toplam sayısını hesaplamak için uç noktalar sütunundaki verileri toplayın. Dal uzunluğuna göre sıraladıktan sonra dal bilgisi verileri için tekrarlayın. Tüm veriler kırpıldıktan ve toplandıktan sonra, her görüntüdeki verileri ilgili görüntüdeki mikroglia soma sayısına bölün.
İstatistiksel yazılıma son uç noktayı ve hücre başına hücre ve dal uzunluğunu girin. FracLac eklentisinin indirildiğinden emin olun. Ardından, yatırım getirisini çizmek için dikdörtgen aracını kullanın.
Kutunun tüm hücreyi yakalayacak kadar büyük olduğundan ve veri kümesi boyunca tutarlı kalabildiğinden emin olun. ROI Yöneticisi penceresinde, ROI'yi fotomikrografta rastgele seçilen bir hücreye kilitlemek için Güncelle'yi seçin. Seçili hücreyi içeren ikili görüntüyü açın.
Boya Fırçası aracını çift tıklatın, rengi siyah olarak ayarlayın ve fırça genişliğini gerektiği gibi ayarlayın. Eşleşen fotomikrografı referans olarak kullanarak, bitişik hücre işlemlerini çıkarmak, parçalanmış süreçleri bağlamak ve ilgilenilen hücreyi izole etmek için Boya Fırçası'nı kullanın. İkili hücre izole edildikten sonra, ikili dosyayı kaydedin.
Araç çubuğunu kullanarak ikili hücreyi İşlem, İkili, Anahat aracılığıyla bir anahatta dönüştürün. Araç çubuğunda, Eklentiler, Fraktal Analiz, FracLac'a tıklayarak araç çubuğunu kullanarak FracLac'ı açın ve kutu sayımı için BC'yi seçin. Izgara Tasarımı'nda, Num G'yi dört olarak ayarlayın.
Hücrenin dışbükey gövdesini ve sınırlayıcı dairesini analiz etmek için Grafik Seçenekleri'nin altında metrikler kutusunu işaretleyin. İşiniz bittiğinde Tamam'ı seçin ve ardından seçilen görüntüde bir kutu sayma taraması çalıştırmak için Tara düğmesini seçin. Gövde ve Çember Sonuçları penceresinde, istenen tüm veri sonuçlarını kopyalayın.
Ardından, Kutu Sayısı Özeti penceresinde de aynısını yapın. Kopyalanan verileri bir Excel dosyasına veya istatistiksel yazılıma aktarın. Bu grafik, yaralanmamış ve yaralanmış kortikal dokuda hücre başına mikroglia uç noktalarının ve hücre başına işlenen uzunluğun özet verilerini gösterir.
Bu, uygulanan protokol ile yapılan analizin sonucudur. Her iki durumda da Students T Testi kullanılarak istatistiksel analiz yapıldı ve üç görüntü analiz edildi. Protokolün uygulanmasında kullanıcılar arası değişkenlik konusunda dikkatli olunmalıdır.
Bu tür farklılıklar, aynı veri kümesinin aynı protokolü uygulayan iki bağımsız kullanıcı tarafından analiz edildiği burada özetlenmiştir. Eğilimler baştan sona benzer olsa da, kullanıcılar arası değişkenlik verilerin önemini etkiler. Bu prosedürü denerken, amacın orijinal fotomikrografı temsil eden bir iskelet veya anahat modeli elde etmek olduğunu hatırlamak önemlidir.
Bu, adımların araştırmacının özel ihtiyaçlarına göre değiştirilebileceği anlamına gelir. Bu videoyu izledikten sonra, hazır bilgisayar yazılımı kullanarak immünohistokimya dokusunun fotomikrograflarından mikroglia morfolojisini nasıl hızlı bir şekilde ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.
Genel Bakış
Bu makale, beyin dokusunun immünhistokimyasal olarak hazırlanması üzerine odaklanarak, ImageJ kullanarak mikrogliyal morfolojinin nicel olarak ölçülmesi için bir protokol sunar. Yöntem, nörolojik enflamatuar durumlarla bağlantılı mikrogliya şekil değişikliklerini araştırmayı amaçlamakta ve hem sağlıkta hem de hastalıkta mikrogliyal işlevin önemli yönlerini ele almaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- İmmünoloji
Arka Plan
- Mikroglia, beyindeki birincil bağışıklık hücreleri olarak işlev görür ve fizyolojik değişikliklere tepki verir.
- Mikrogliyal morfolojinin nicel analizi, nörolojik enflamasyon hakkında içgörüler sağlayabilir.
- Bu protokol, çeşitli beyin bölgelerinin taranması için erişilebilirliği sağlayan özel olmayan bir yazılım kullanır.
- Yüksek verimli yöntemler, hafif morfolojik farklılıkların tespit edilmesini kolaylaştırır.
Çalışmanın Amacı
- Sağlıklı ve hastalıklı beyin durumlarında mikrogliyal morfolojinin ayrıntılı analizini sağlamak.
- Daha hassas değerlendirmeler için sürekli veri metrikleri (örn., hücre dallanması) kullanmak.
- Mikrogliyal form ve işlevle ilgili önemli nörolojik enflamasyon sorularına cevap vermek.
Kullanılan Yöntemler
- Analiz, immünhistokimyasal olarak hazırlanmış beyin dokusu üzerinde ImageJ kullanılarak gerçekleştirilir.
- Mikrogliyal morfolojiyi nicellemek için iskeletlendirme ve fraktal analiz gibi teknikler kullanılır.
- Adımlar, parlaklık/kontrast ayarlama, ikili dönüştürme ve çeşitli filtrelerin uygulanmasını içerir.
- Robust sonuçlar sağlamak için istatistiksel analiz ve veri düzeltme detaylandırılır.
- Hücrelerin izole edilmesi ve ilgi alanlarının (ROI'lar) analiz edilmesi için öneriler dahil edilmiştir.
Ana Sonuçlar
- Nicel çıktılar, farklı koşullar altında her hücre için uç noktalar ve dal uzunluğu ölçümlerini içerir.
- İlk bulgular, yaralanma durumuna bağlı olarak değişebilen mikrogliyal morfolojideki eğilimleri göstermektedir.
- Analiz, enflamasyon sırasında mikrogliyal işlevde morfolojik değişkenliğin önemini vurgulamaktadır.
- Kullanıcılar arası değişkenlik verilerin önemini etkiler, ancak trend yönünde tutarlı kalır.
Sonuçlar
- Bu çalışma, mikrogliyal morfolojiyi nicel olarak değerlendirmek için ayrıntılı, tekrarlanabilir bir protokol sağlar.
- Sağlık ve hastalıkta mikrogliyal dinamiği anlayışını artırır ve nörolojik enflamasyon araştırması için sonuçlar sunar.
- Belirtilen yöntemler, belirli araştırma ihtiyaçlarına göre uyarlanmış analizlerde uyarlanabilirliği teşvik eder.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative microglia morphology analysis using ImageJ enables objective, high-throughput assessment of neuroinflammatory states in preclinical models. This approach supports early discovery teams by providing sensitive, reproducible metrics for cellular phenotyping and mechanistic de-risking. The protocol's accessibility and scalability facilitate portfolio-wide evaluation of neuroimmune targets and disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of microglial activation and morphological phenotypes in brain tissue.
- Supports functional target validation by linking cell shape metrics to neuroinflammatory status.
- Facilitates mechanistic de-risking through objective, continuous variable outputs.
- Improves predictive confidence for neuroimmune target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated image analysis workflows for downstream compound screening.
- Standardizes morphological quantification across multiple brain regions and conditions.
- Generates reproducible, quantitative outputs for assay benchmarking and optimization.
- Enables scalable, high-throughput screening of microglial responses to perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns morphological endpoints with disease-relevant neuroinflammatory biomarkers.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of neuroimmune mechanisms.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative cellular readouts.
- Enhances translational confidence by enabling cross-study comparability of microglial phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling standardized, quantitative analysis of microglia in immunohistochemistry-prepared tissue.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in neuroinflammation research.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible image analysis for compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as endpoints, branch lengths, and complexity metrics for robust statistical comparison.
- Translational Research: Connects morphological data to disease-relevant biomarkers and preclinical endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a non-proprietary, adaptable workflow for broad application across neuroimmune research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuroimmune target validation.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability in image-based phenotyping.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neuroinflammatory programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in image analysis and neuroanatomy for accurate ROI selection and data interpretation.
- Needs access to immunohistochemistry-prepared tissue and open-source ImageJ plugins (AnalyzeSkeleton, FracLac).
- Demands cross-user standardization to minimize inter-operator variability in data outputs.
- Adaptable to various brain regions and experimental models with protocol modifications as needed.
- Careful thresholding and image preprocessing are critical to ensure data quality and comparability.
