Bir fare beyin dilimindeki bir bileşiğe doğru mikroglial süreç çekimini incelemek için iki foton mikroskobu

İki fotonlu bir mikroskop altında aCSF içeren bir perfüzyon odasına bir fare beyin dilimi yerleştirin.

Fare, GFP'yi mikroglia cinsinden ifade etmek için genetik olarak tasarlanmıştır ve mikroglial hareket takibini mümkün kılar.

Dilimi bir tutucu ile sabitleyin.

Parlak alan aydınlatmasını kullanarak ilgilendiğiniz bölgeyi bulun.

Mikroglia'yı görselleştirmek için floresan aydınlatmaya geçin.

Bir mikropipeti test bileşiği ile doldurun, bir şırınga tutucusuna monte edin ve dilime değecek şekilde indirin.

Düşük enerjili yakın kızılötesi ışığı dokuya odaklayarak iki fotonlu görüntüleme modunu etkinleştirin.

Lazerin odak noktasında, iki foton enerjilerini GFP'yi uyarmak ve floresan yaymak için birleştirir.

Mikroglial süreçlere odaklanmak için birden fazla Z düzleminde görüntü yakalayın.

Temel aktiviteyi kaydedin, ardından bileşiği enjekte edin ve kayda devam edin.

Bileşik, mikroglial reseptörlere bağlanarak, mikroglial süreç uzantısını bileşik kaynağına doğru yönlendiren sinyal yollarını tetikler.

Hareketi izlemek için zaman içinde enjeksiyon bölgesinin yakınındaki floresan artışını izleyin.

Kayda başlamadan 30 dakika önce, doku dilimlerinin oksijenlenmesini ve canlılığını optimize etmek için peristaltik pompayı üst ve alt perfüzyonlu özelleştirilmiş bir kayıt odasına bağlayın ve tüm perfüzyon sistemini 50 mililitre ultra saf su ile temizleyin. Temizleme döngüsünün sonunda, sürekli karbojenasyon altında bir cam beherde 50 mililitre aCSF ile kayıt odasının perfüzyonunu başlatın ve lens kağıdını çıkarmak için görüntülenecek ilk dilimi behere aktarmak için tek kullanımlık geniş ağızlı bir transfer pipeti kullanın.

Kesit beherin dibine battığında, kesiti kayıt odasına aktarın ve perfüzyon akışının neden olduğu hareketi en aza indirmek için dilim tutucuyu dilimin üzerine yerleştirin. 5 ila 10 kat büyütme altında ilgilenilen beyin bölgesini hedeflemek için parlak alan aydınlatması kullanın. Ardından, görüntüleme alanının konumunu ayarlamak için 0,35 kat suya daldırma lensi ile 25 kat objektif kullanın.

Floresan mikroglial hücreleri bulmak için floresan aydınlatmayı kullanın ve pipeti, son konsantrasyonunda ilgilenilen bileşiği içeren 10 mikrolitre aCSF ile doldurun. Uçta sıkışan hava kabarcıklarını gidermek için ucu hafifçe sallayarak aşağı doğru tutun ve doldurulmuş pipeti, 5 mililitrelik bir şırıngaya bağlı, bir piston 5 mililitre konumuna yerleştirilmiş ve üç eksenli bir mikromanipülatöre monte edilmiş bir pipet tutucusuna monte edin.

Pipet ucu dilimin yüzeyine hafifçe temas edene kadar pipeti yavaşça dilime doğru indirin, aynı anda hedefi kontrol edin ve ayarlayın. Şimdi lazeri ayarlayın ve mikroskobu çoklu foton moduna geçirin. Odanın herhangi bir ışık kaynağından perdelendiğinden emin olun ve taranmamış dedektörleri açın. Kazancı ayarlayın ve görüntüdeki piksellerin doygunluğunu önlemek için renk kodlu bir üst sınıra sahip bir arama tablosu kullanın.

Ardından, bileşiği bölüme uygulamak için 5 saniyelik bir süre boyunca beş dakika sonra şırınga pistonunu 5 ila 1 mililitre konumundan yavaşça bastırarak toplam en az 30 dakikalık bir süre boyunca kayda başlayın. Görüntü analizi için önce ilgilenilen dosya üzerinde ImageJ ile Z-projeksiyon ve sapma düzeltmesi gerçekleştirin. Ardından değiştirilmiş dosyayı Icy'de açın ve enjeksiyon bölgesi üzerinde ortalanmış dairesel, 35 mikrometre çapında bir ilgi alanı çizin.

İyi konumlandırıldığından emin olmak için filmi ROI ile yeniden çalıştırın. Ardından, ilgilenilen bölgedeki zaman içindeki ortalama yoğunluğu ölçmek ve sonuçları bir .xls dosyası olarak kaydetmek için ilgi bölgesi Intensity Evolution eklentisini kullanın.