Bir yutulma Deneyi: CNS Fagositler ve nöronlar arasındaki etkileşimi değerlendirmek için bir protokol

Bu prosedürün genel amacı, presinaptik girdilerin mikroglia tarafından yutulmasını görselleştirmek ve ölçmektir. Bu, lateral genant çekirdekteki retinal ganglion hücresi presinaptik girdilerini etiketlemek için önce floresan anterior derece izleyicilerin gözlere enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, beyni incelemek, düzeltmek ve dengelemektir.

Daha sonra, beyin bölümlere ayrılır. Son adım, görüntüleme ve analiz için beyin bölümlerini bir kapak dudağı üzerine monte etmektir. Sonuç olarak, presinaptik girdilerin mikroglia tarafından yutulmasını değerlendirmek için konfokal mikroskopi kullanılır.

Bu yöntem, fagositik toprakların sinaptik devre plastisitesine ve yeniden şekillenmeye nasıl katkıda bulunduğu gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, sağlıklı beyinde sinaptik devrenin yeniden şekillenmesi hakkında fikir verebilse de, sinir sistemi hastalığı sırasında sinaptik devrenin yeniden şekillenmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Prosedürü gösteren, bir teknisyen olan Chris Heller ve Stevens Laboratuvarı'ndan bir yüksek lisans öğrencisi olan Emily Laman olacak.

Bu prosedüre, bir pleksiglas indüksiyon odasında %4 ISO flor içeren bir fareyi uyuşturarak başlayın. Bir ila üç dakika sonra, kuyruğu sıkıştırarak uygun bir anestezi seviyesinin elde edildiğinden emin olun. Ardından fareyi stereo mikroskobun altına yan yatırın ve burun üzerine %3 ila %4 ISO flor veren burun konisini yerleştirin.

Sklerayı ortaya çıkarmak için, göz kapağını açmak ve cildi geri çekmek için bir çift küçük yaylı makas kullanın. Yenidoğanlar için bazen gözün köşesinde başka bir dikey kesi gereklidir. Kan damarı olduğu için göz kapağının köşesini keserken dikkatli olun.

Skleranın başladığı gözün yan tarafında küçük bir delik açmak için steril bir 30.5 gauge iğne kullanın. İğneyi, eğimin göze girecek şekilde yeterince uzağa sokarak lense zarar vermemeye dikkat edin. Vitreusun delikten dışarı akmasına izin verin ve sıvıyı emmek için steril bir kesim ve uçlu aplikatör kullanın.

Vitreus delikten dışarı akmayı bıraktığında, ön derece izleme ile önceden yüklenmiş bir Hamilton şırıngasına bağlı künt uçlu bir iğneyi yavaşça yerleştirin. Deliğe boyayın, boyayı yavaşça göze enjekte edin. Tipik olarak, Alexa 5 94, 6 47 veya 4 88'e konjuge kolera toksini beta alt birimi anterior derece için kullanılır.

Geç izleme R GC girişleri İğneyi birkaç saniye delikte bırakın ve ardından yavaşça çıkarın. Fazla sıvıyı emmek ve boyanın dışarı sızmasını önlemek için pamuk uçlu bir aplikatör kullanın. Daha sonra göze az miktarda antibiyotik merhem sürün.

Göz cerrahi olarak açılmışsa. Enjeksiyondan sonra göz kapaklarını nazikçe yeniden konumlandırın. Anesteziden kurtulmaya başlayana kadar fareyi bir ısı lambasının altında veya bir ısı yastığı üzerinde bırakın.

Fareyi temiz bir ev kafesine geri koyun ve koloniye geri göndermeden önce tamamen uyanık olduğundan emin olmak için izleyin. Enjeksiyondan yaklaşık 24 saat sonra, fareyi feda edin ve beyni inceleyin. Beyni, ertesi gün dört santigrat derecede gece boyunca% 4 PFA ile doldurulmuş bir Falcon tüpüne sabitleyin.

Önce beyni ve PFA'yı boş bir peynir altı suyu teknesine dökerek beyni PBS'de üç kez durulayın, ardından beyni PBS ile dolu başka bir peynir altı suyu teknesine aktarmak için spatula kullanın. Beyni% 30 sükroz çözeltisi ile doldurulmuş bir Falcon tüpüne aktarmadan önce PBS'de iki kez daha yıkayın. Tüpün dibine batana kadar dört santigrat derecede sakaroz içinde bırakın.

Daha sonra, beynin ihtiyaç duyulmayan kısımlarını bir jiletle çıkarın. Beyni kuru buz üzerinde bir parça alüminyum folyo üzerinde dondurun. Bu arada, mikrotom aşamasını dondurun ve donmuş beyni dondurma aşamasına monte etmek için 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna yarım mililitre 0.1 molar PP ile doldurun.

Sahneye az miktarda OCT uygulayın. OCT donmaya başladığında, beyni içine yerleştirin. Beynin kesilecek tarafı yukarı bakmalıdır.

Daha sonra, beyni ve OCT'yi çok ince kırılmış kuru buzla örtün. Kuru buzu beynin üzerinde yaklaşık 30 saniye bekletin. Ardından kuru buzu çıkarmak için büyük bir boya fırçası kullanın.

Dilimleri 40 mikron kalınlığında dilimlemeye başlayın. Daha sonra küçük bir nemli boya fırçası kullanarak ilgilenilen bölgeyi içeren bölümleri bıçaktan çıkarın ve bunları 0.1 molar pb içeren 24 oyuklu plakaya aktarın. Kesitler toplandıktan sonra, ön derece etiketlemeyi bir floresan diseksiyon mikroskobu altında görselleştirin ve bölümleri bir slayt üzerine monte etmek için ilgilenilen bölgeyi içeren bölümleri seçin.

İlk olarak, yüklü bir mikroskoba 0.1 molar PB'lik küçük bir havuz uygulayın. Sonraki kaydırın, doku bölümlerini pb havuzuna aktarın. Ardından dokuları yönlendirmek ve yaymak için boya fırçasını kullanın.

XSPB'yi fitillemek için bir Kim mendili kullanın ve bölümün fitilini atmamaya dikkat edin. Tamamen kurumaya bırakın. Daha sonra her bölüme küçük bir damla montaj ortamı uygulayın ve sonunda üstüne bir kapak fişi monte edin.

Slaytın kenarlarını oje ile kapatın. Slaytı eksi 20 santigrat derecede, gösterilen görüntüleme oturumuna kadar saklayın. İşte ön derece izleme stratejisinin bir şeması.

Sol ve sağ göz RGC girişleri sırasıyla CTB 6 47 ve CTB 5 94 ile izlenir. Girdilerin mikroglia aracılı yutulması daha sonra değerlendirilir. İşte sol ve sağ göz girişlerinin intergrade izlemesini takiben doğum sonrası beşinci gün Fare DLGN'sinin temsili, düşük büyütmeli bir görüntüsü.

Bu, sol ve sağ göz girişlerinin sınır bölgesinden örneklenen bir mikrogliadır. Mikroglial hacmin dışındaki tüm CTB floresansı çıkarıldı, bu da yutulan RGC girişlerini ve mikroglia'nın yüzey oluşumunu ve yutulduğunu ortaya çıkardı. RGC girişleri burada gösterilmiştir.

İşte P beş, P dokuz ve P 30 fareden mikroglia oluşturulmuş temsili yüzey. DLGN RGC girdilerinin yutulması, DLGN'de pik budama sırasında daha büyük yaşlara göre önemli ölçüde artar. Kompleman reseptörü üçünde eksik olan farelerden elde edilen mikroglia, bir kez ustalaştıktan sonra vahşi tip çöp arkadaşlarına kıyasla önemli ölçüde daha az RGC girdisi yutar.

Bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde 72 saat içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, nöronları nasıl etiketleyeceğinizi ve mikroglia sinaps etkileşimlerini nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.