Name: Deneysel Beyin Hasarında Polarizasyonun Mikroglia/Makrofaj Belirteçlerinin Üç Boyutlu Konfokal Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Öğrenin, deneysel beyin iskemisinde mikroglia/makrofaj belirteçlerinin üç boyutlu konfokal görüntüleme ile lokalizasyonunu incelemeyi. Bu yöntem, fare modelinde inflamatuar yanıtı anlamak için yüksek çözünürlük sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Stefano Fumagalli, Monzino Vakfı'nın bir üyesidir.

1. İmmünofloresan
Aşağıdaki protokol, transkardiyal perfüze farelerden (20 ml PBS, 0.1 mol/litre, pH 7.4, ardından PBS'de %4 50 ml soğutulmuş paraformaldehit) elde edilen koronal beyin kriyoseksiyonları üzerinde gerçekleştirilir. Perfüzyondan sonra, beyinler dikkatlice çıkarılır ve kriyoproteksiyon için gece boyunca 4 ° C'de PBS'de% 30 sükroza aktarılır. Beyinler daha sonra şişelere kapatılmadan ve kullanıma kadar -70 ° C'de saklanmadan önce 3 dakika boyunca - 45 ° C'de izopentan içine daldırılarak hızla dondurulur. Koronal beyin kriyoseksiyonları (20 μm) seri olarak kesilir ve immünofloresan protokolü 11, 6'ya tabi tutulur.
Kullanmadan önce tüm reaktifleri ve numuneleri oda sıcaklığına getirin. Sunulan çalışma antikor ve serum seyreltmelerinin, en iyi performansı elde etmek için yapılan denemelerden kaynaklandığını lütfen unutmayın. Farklı antikorlar ve serum kullanıldığında, protokolün doğrulanması gerekir.
Hem anti-CD11b hem de anti-CD68 primer antikorları sıçanlarda yapıldığından, sıçan karşıtı Alexa 546'nın çapraz sinyalini önlemek için, yüksek miktarda anti-CD11b seyreltmesi ve ardından TSA kiti (Cy5 Tyramide) ile floresan sinyal amplifikasyonu kullandık. Adım 1.17 dışında açıklanan protokolü uygulayarak ve tablo 1'de bildirildiği gibi en az 7 farklı anti-CD11b seyreltmesi kullanarak anti-CD11b için en uygun çalışma seyreltmesini oluşturduk. Sonuç olarak, 1: 30.000, aşağıdakileri başaran tek seyreltme olarak seçilmiştir: 1) uyarma dalga boyu 646 nm'de Cy5 ile görünür sinyal; 2) 532 nm uyarma dalga boyunda Alexa 546 ile sinyal yok. Bu şekilde, Alexa 546 floresan sinyali seçici olarak CD68 ekspresyonu ile ilişkilendirilir.
Anti-CD11b ve anti-CD68 antikorları için optimal dilüsyonlar, doku tipine bağlı olarak değişebilir ve ortak etiketleme protokolünü başlatmadan önce tanımlanmalıdır.
<ol>
	<li>Beyin kriyoseksiyonlarını PBS ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>% 1 H2O2 içeren PBS'de kriyoseksiyonları 5 dakika inkübe edin (floresan amplifikasyonun yaban turpu peroksidaz, streptavidin-HRP ile inkübasyona ihtiyacı olduğundan adım gereklidir, bkz. adım 1.12).</li>
	<li>Kriyosekeseksiyonları 2x PBS ile yıkayın.</li>
	<li>%10 NGS ve %0.3 Triton içeren PBS'de kriyoseksiyonları 60 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Birincil Ab Rat anti-CD11b [1:30.000], %10 NGS ve %0.3 Triton içeren PBS'de kriyoseksiyonları gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Kriyokesitleri 2x (5 dakika) PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Biyotinile edilmiş ikincil anti-Rat Ab [1:200] ve% 1 NGS içeren PBS'de kriyoseksiyonları 60 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Kriyosekeseksiyonları 2x PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Kriyosekesyonları TNT ile yıkayın (Tris-HCl, NaCl, Ara: 0.1 M TRIS-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, %0.05 Tween 20).</li>
	<li>Kriyoseksiyonları TNB'de 1,5 saat inkübe edin (Tris-HCl-NaCl-Bloke edici tampon: 0,1 M TRIS-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, uygun kitten %0,5 Bloke edici reaktif (reaktifler tablosuna bakınız)).</li>
	<li>Kriyoseksiyonları TNT ile 3 kez yıkayın.</li>
	<li>Streptavidin HRP içeren TNB'de kriyoseksiyonları inkübe edin [1:100].</li>
	<li>Kriyoseksiyonları 3x TNT ile yıkayın.</li>
	<li>Kriyoseksiyonları Siyanin 5 Tyramid [1:300] içeren Amplifikasyon Seyrelticisinde 8 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Kriyokesitleri 3x PBS ile yıkayın.</li>
	<li>% 10 NGS ve% 0.1 Triton içeren PBS'de kriyoseksiyonları 60 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Kriyoseksiyonları gece boyunca 4 °C'de primer Ab Rat anti-CD68 [1:200], %3 NGS ve %0.3 Triton içeren PBS'de inkübe edin.</li>
	<li>Kriyokesitleri 3x PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Florkonjuge ikincil Ab, Alexa 546, anti-Rat [1:500] ve% 1 NGS içeren PBS'de kriyoseksiyonları 60 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Kriyokesitleri 3x PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Hoechst 1 μg / ml içeren PBS'de kriyoseksiyonları 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Kriyokesitleri 3x PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Kriyoseksiyonları Prolong Gold'a monte edin.</li>
</ol>
2. Konfokal Mikroskopi ile Üç Boyutlu Görüntülerin Elde Edilmesi
Burada kullanılan mikroskop, 3 lazer çizgisine sahip bir konfokal tarama ünitesi FV500 ile donatılmış bir IX81 mikroskobu idi: Ar-Kr (488nm), He-Ne kırmızı (646nm) ve He-Ne yeşil (532nm) ve bir UV diyotu.
<ol>
	<li>Uyarılacak floresan boyaların dalga boylarına bağlı olarak uyarma lazerlerini seçin (Cy5, CD11b için He-Ne kırmızısı; Alexa546, CD68 için He-Ne yeşili ve Hoechst, çekirdekler için UV diyotu).</li>
	<li>Işık sinyali toplama için en iyi dikroik ayna kombinasyonunu seçin.</li>
	<li>Görüntü çözünürlüğünü en az 800 x 600 piksel olarak ayarlayın.</li>
	<li>Epi-floresan kullanarak bir ilgi alanı belirleyin ve büyütmeyi kademeli olarak 40X objektife yükseltin.</li>
	<li>Lazer Tarama Mikroskobu (LSM) modalitesine geçin.</li>
	<li>Her kanal için fotoçoğaltıcıyı (PMT) ve kazancı ayarlamak için tekrarlayan taramalar yapın. Kurulumu kolaylaştırmak için lazerler ayrı ayrı açılabilir. İstenmeyen, spesifik olmayan sinyalleri önlemek için kazancı mümkün olduğunca düşük tutun.</li>
	<li>Tekrarlayan tarama çalışırken, z ekseninin alt ve üst uçlarını tanımlamak için odak kontrolünü hareket ettirin (toplam z ekseni uzunluğu = 10 μm).</li>
	<li>Tekrarlayan taramayı durdurun.</li>
	<li>Adım boyutunu tanımlayın. Z ekseni üzerinde standart bir 0.225:1 boyut oranı elde etmek için piksel boyutuna (1 μm) mümkün olduğunca yakın olmalıdır.</li>
	<li>Kalman filtresini en az 2 kez etkinleştirin.</li>
	<li>Taşma efektlerini önlemek için sıralı tarama modunu etkinleştirin.</li>
	<li>Z ekseni boyunca yarıya kadar gidin ve bir xy sıralı tarama çalıştırın. PMT ve kazanç kurulumunu kontrol edin (iyi sinyal/gürültü oranı). Tatmin edici değilse, adım 2.6'yı tekrarlayın.</li>
	<li>xyz alımını çalıştırın.</li>
	<li>Verileri multitiff dosyası olarak dışa aktarın. Her multitiff dosyası tipik olarak 3 renk kanalı (mavi, yeşil ve kırmızı) ve 44 odak düzlemi içerir.</li>
</ol>
3. Konfokal Edinimlerin Üç Boyutlu Görünümü ve Üç Boyutlu İşleme
Multitiff dosyalarını Imaris yazılımına yükleyin ve aşağıdaki gibi işleyin:
<ol>
	<li>Yazılımı açın.</li>
	<li>Aşma görünümünü seçin.</li>
	<li>Multitiff dosyasını yükleyin.</li>
	<li>Her kanal için istediğiniz rengi seçin.</li>
	<li>Ekran ayar panelindeki minimum değeri artırarak arka plandaki gürültüyü kaldırın. Her kanalı ayrı ayrı ayarlayın.</li>
	<li>Bölüm görünümüne gidin. Birlikte yerelleştirmeyi (sarı pikseller) aramak için z ekseni boyunca hareket edin.</li>
	<li>Z ekseni boyunca kolokalizasyonun mevcut olup olmadığını (yani katı bir nesneye ait olup olmadığını) görmek için sarı bir alana tıklayın. Z ekseni çıkıntıları şeklin sağ ve alt kısmında görülebilir.</li>
	<li>Anlık görüntü alın.</li>
	<li>Geçiş görünümüne geri dönün.</li>
	<li>Bir hücreyi veya hücre kümesini izole etmek için 3B'yi kırpın.</li>
	<li>Ekran ayar panelinde bir kanal seçin.</li>
	<li>Aşma/yüzeyler algoritması oluşturucusunu seçin. Algoritma adımları:
	<ol>
		<li>Kanal seçin.</li>
		<li>Eşiği tanımlayın (ekran ayarlama panelinde aynı minimum değeri kullanın).</li>
		<li>Yeniden boyutlandırmayı tanımlayın.</li>
		<li>Düzgünleştirmeyi tanımlayın (en iyi = 0,200).</li>
		<li>Renk görünümünü tanımlayın.</li>
		<li>Algoritmayı sonlandırın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Her kanal için 3.12 adımını tekrarlayın.</li>
	<li>Ekran ayar panelinde floresan kanallarının seçimini kaldırın ve üç yüzeyi de seçin.</li>
	<li>En iyi görünümü bulmak için sesi hareket ettirin.</li>
	<li>Anlık görüntü alın.</li>
</ol>

<ol><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li>
<li>Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+activation+in+stroke%3A+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Microglial activation in stroke: therapeutic targets.</a> Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).</li>
<li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunology+of+stroke%3A+from+mechanisms+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nat. Med. 17, 796-808 (2011).</li>
<li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke%3A+role+of+inflammatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 779-789 (2010).</li>
<li>Schilling, M., Besselmann, M., Muller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predominant+phagocytic+activity+of+resident+microglia+over+hematogenous+macrophages+following+transient+focal+cerebral+ischemia%3A+an+investigation+using+green+fluorescent+protein+transgenic+bone+marrow+chimeric+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice.</a> Exp. Neurol. 196, 290-297 (2005).</li>
<li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia%2Fmacrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> Journal of Neuroinflammation. 8, 174-193 (2011).</li>
<li>Zanier, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+blood+mesenchymal+stem+cells+protect+mice+brain+after+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+CareMed%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma.</a> Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).</li>
<li>Capone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosphere+derived+cells+exert+a+neuroprotective+action+by+changing+the+ischemic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment.</a> PLoS ONE. 2, e373(2007).</li>
<li>Bhatia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+ofalternatively+activated+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943(2011).</li>
<li>Raes, G., Noel, W., Beschin, A., Brys, L., de Baetselier, P., Hassanzadeh, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIZZ1+and+Ym+as+tools+to+discriminate+between+differentially+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">FIZZ1 and Ym as tools to discriminate between differentially activated macrophages.</a> Dev. Immunol. 9, 151-159 (2002).</li>
<li>Gesuete, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+C1+inhibitor+in+brain+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury.</a> Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+plasticity+and+polarization%3A+in+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada, M/M fenotip belirteçlerinin iskemik alana lokalizasyonunu ve birlikte ekspresyonunu araştırmak için güçlü bir yaklaşım olarak immünofloresan bazlı protokolleri ve ardından üç boyutlu konfokal analizi sunuyoruz (daha ayrıntılı bir analiz için bkz. ref 6). Bu yöntem, M/M aktivasyonunun ilgili belirtecinin spesifik boyamasını üç boyutlu konfokal görüntüleme ile birleştirir. Antikorların, serumun ve florkonjuge çalışma dilüsyonlarının ince ayarı, araştırılan belirteçlerin optimal sinyal-gürültü oranına izi...

Akut beyin hasarından sonra, mikroglia hızla aktive olur ve dramatik morfolojik ve fenotipik değişikliklereuğrar 1-3. Bu içsel yanıt, yaralı beyin parankimine göç eden kan kaynaklı makrofajların işe alınmasıyla ilişkilidir4,5. Antijenik olarak ayırt edilemeyen (bundan böyle M/M olarak anılacaktır) mikroglia ve makrofajların beyin hasarındaki rolü hala tartışılmaktadır. Artan sayıda çalışma, periferik makrofajlar için tarif edilenlere benzer şekilde, mikroglia ve beyin tarafından işe alınan makrofajların, uç noktaları klasik pro-inflamatuar toksik (M1) veya anti-inflamatuar koruyucu (M2) fenotipe karşılık gelen farklı fenotipler alabileceğini göstermektedir. Pro- veya anti-enflamatuar faktörlerin salgılanması, nörotrofik moleküllerin salınması ve lizozomal aktivite dahil olmak üzere farklı aktivasyon durumları, ekspresyonu çevredeki ortamın zamansal evrimine bağlı olan spesifik bir fenotipik belirteç modeli ile karakterize edilir. Yaralı beyindeki bu M / M fenotiplerinin karakterizasyonu hala yetersizdir. İnme sonrası M / M ekspresyonunu ve evrimini analiz etmek için iyi kurulmuş bir pMCAo fare modeli kullandık. Burada sunulan immünofloresan tabanlı protokoller, iskemik alanda spesifik M/M fenotip belirteçlerinin görünümü, lokalizasyonu ve hücresel ko-ekspresyonu hakkında bilgi edinmeyi amaçlamaktadır. Farklı aktivasyon durumu veya fenotipi ile ilişkili birkaç molekülü, yani lökositler tarafından eksprese edilen bir yüzey markörü ve yaygın olarak kullanılan bir M/M aktivasyon/işe alımbelirteci olan CD11b, 6-8, CD68 lizozom6,7 ve alternatif olarak aktive edilen (M2) makrofajlar tarafından eksprese edilen ve iyileşme ve fonksiyon restorasyonu ile ilişkili bir salgı proteini olan Ym19-10 ile ilişkili birkaç molekülü araştırdık.	
	İki belirteç aynı hücre tarafından, ancak farklı hücre altı bölmelerde ifade edildiğinde, tek başına kolokalizasyon çok bilgilendirici olmayabilir. Bu durumda, tek düzlem görünümü ve üç boyutlu renderlar kullanılarak ortak ifade analizi gerçekleştirilebilir. Burada, işaretleyici birlikte ifadesinin kapsamlı bir üç boyutlu analizini elde etmek için bir protokol açıklıyoruz.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materials</strong</td></tr><tr><td>>Rat Anti-fare CD11b</td><td>Nazikçe Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milano, İtalya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tarafından sağlanmıştır Sıçan Anti-fare CD68 </td><td>AbD Serotec</td><td>MCA 1957</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan Anti-fare Ym1 </td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>1404</td><td></td></tr><tr><td>H&#8211; chst 33342</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>Fare Anti-Nöral Çekirdekleri (NeuN)</td><td>CHEMICON</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Biyotinillenmiş Keçi Anti-Sıçan antikoru</td><td>Jackson İmmüno Araştırma</td><td>112-065-143</td><td></td></tr><tr><td>TSA Siyanin 5 Sistemi </td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL705A001KT</td><td></td></tr><tr><td>Uzatma Altın </td><td>İnvitrojen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Anti-sıçan alexa 546</td><td>Invitrogen</td><td>A-11081</td><td></td></tr><tr><td>Anti fare Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>Anti-tavşan Alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-11037</td><td></td></tr><tr><td>Normal Keçi Serumu</td><td>Vektörleri</td><td>Laboratuvarları S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tritin X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin</td><td>Sigma</td><td>P4417-100</td><td></td><</tr><tr>td colspan="4"><güçlü > Ekipman< / güçlü ></td></tr> <tr><td>Kriyostat CM1850</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81 konfokal mikroskop </td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AnalySIS yazılımı</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris yazılımı 5.0</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop cs2</td><td>Adobe Sistemleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yazılım paketleri GraphPad Prism sürüm 4.0</td><td>GraphPad Yazılım A.Ş.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

deneysel beyin hasarında polarizasyonun mikroglia/makrofaj belirteçlerinin Üç boyutlu konfokal analizi

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

Beyin felcinden sonra mikroglia/makrofajlar (M/M), yeni yüzey antijenlerinin ekspresyonunu ve inflamatuar yanıtı oluşturan ve sürdüren mediatörlerin üretimini içeren dramatik morfolojik ve fenotipik değişikliklerle hızlı aktivasyona uğrar. Ortaya çıkan kanıtlar, M/M'nin akut beyin hasarından sonra klasik proinflamatuar (M1) veya alternatif anti-inflamatuar (M2) aktivasyonu varsayabilen oldukça plastik hücreler olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, M/M fenotip belirteç ekspresyonunun tam bir karakterizasyonu, bunların kolokalizasyonu ve yaralı beyindeki zamansal evrimi hala eksiktir.	
	 M/M aktivasyonunun ilgili belirteçlerini spesifik olarak boyayan immünofloresan protokolleri, iskemik beyinde gerçekleştirilebilir. Burada, orta serebral arterin (pMCAO) kalıcı oklüzyonu ile indüklenen fokal iskeminin fare modelinde CD11b, CD68, Ym1 gibi M/M fenotip belirteçlerinin lokalizasyon ve birlikte ekspresyon paternini araştırmak için güçlü bir yaklaşım olarak immünofloresan tabanlı protokolleri ve ardından üç boyutlu konfokal analizi sunuyoruz. Boyanmış alanın iki boyutlu analizi, her bir belirtecin tanımlanmış bir M/M morfolojisi ile ilişkili olduğunu ve iskemik lezyonda belirli bir lokalizasyona sahip olduğunu ortaya koymaktadır. M/M fenotip belirteç ko-ekspresyon paternleri, iskemik alanda üç boyutlu konfokal görüntüleme ile değerlendirilebilir. Görüntüler, taşma etkilerini en aza indirmek ve dalga boyu örtüşmesini önlemek için sıralı bir tarama modu ile tanımlanmış bir hacimde (10 μm z ekseni ve 0,23 μm adım boyutu, 180 x 135 x 10 μm hacme karşılık gelir) elde edilebilir. Görüntüler daha sonra Imaris yazılımı aracılığıyla üç boyutlu görüntüler elde etmek için işlenir. Üç boyutlu işlemelerin katı görünümü, hücre kümelerinde işaretçi ifadesinin tanımlanmasına izin verir. M/M'nin, lezyon bölgesindeki konuma ve yaralanmadan sonraki zamana bağlı olarak çok sayıda fenotipe doğru farklılaşma yeteneğine sahip olduğunu gösterdik.

Etiketleme protokolleri ve konfokal alımlar iskemik bölgede gerçekleştirildiğinde elde edilen sonuçlara bir örnek Şekil 1A ve Şekil 1B'de gösterilmiştir. Alınan görüntülerin iki boyutlu görünümü, iskemiden yirmi dört saat sonra (A), lizozomal belirteç CD68'in (yeşil), iskemik çekirdekte bulunan hipertrofik ameboid CD11b hücrelerinde (kırmızı) eksprese olduğunu göstermektedir. Sınır bölgesinde (B), CD11b pozitif hücreler yuvarlak hücre gövdeleri ve CD68'e...

Beyin inflamatuar yanıtının karmaşıklığı hakkında yeni bilgiler edinmenin bir yolu sunulmaktadır. İmmünofloresan tabanlı protokolleri ve ardından fokal iskeminin bir fare modelinde mikroglia/makrofaj fenotip belirteçlerinin birlikte ekspresyon modelini araştırmak için üç boyutlu konfokal analizi tanımladık.

Deneysel Beyin Hasarında Polarizasyonun Mikroglia/Makrofaj Belirteçlerinin Üç Boyutlu Konfokal Analizi

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, beyin iskemisi sonrası mikroglia makrofaj fenotip belirteçlerinin ekspresyonunu ve hücresel lokalizasyonunu görselleştirmektir. İlk olarak, iskemik fare beyinlerinden alınan kriyoseksiyonlar, mikroglia makrofaj aktivasyon belirteçlerini tanımlamak için boyanır. Boyanan kesitler üç boyutlu konfokal görüntülemeye tabi tutulur.Elde edilen görüntüler daha sonra üç boyutlu renderlar oluşturmak için işlenir ve hücre kümelerindeki markerların ekspresyonunu lokalize etmek için görüntü analizi gerçekleştirilir. Ortaya çıkan veriler, marker ekspresyonunun belirli bir hücre gövdesine doğru şekilde atanmasında üç boyutlu konfokal analizin etkinliğini göstermektedir. İki marker aynı hücre tarafından ancak farklı süb hücresel kompartmanlarda eksprese edildiğinde, tek başına kolokalizasyon çok bilgilendirici olmayabilir. Burada göstereceğimiz üzere, üç boyutlu analiz kullanmak daha iyi bir çözünürlük ve doğruluk sağlar.Bu yöntem, beynin iskemik hasara verdiği yanıtın karmaşıklığına dair içgörü sağlayabilse de, mikroglia makrofajların hasar ve onarımda ikili bir rolünün önerildiği diğer akut veya kronik durumlarda da uygulanabilir. Ya da sinyallerin farklı özel düzlemlerde seçici olarak yerelleştirilmesi gereken durumlarda, Carlo Perigo ve Stefan of Magali sizi prosedürün farklı adımları boyunca yönlendirecektir. Aşağıdaki protokol, orta serebral arterin kalıcı tıkanmasıyla iskemi oluşturulmuş fare beyin dokusunu kullanmaktadır.Beynin 20 mikronluk seri koronal kesitlerini jelatin üzerine toplamak için bir kriyostat kullanın. Lamların üzerini kapatın; kullanmadan önce tüm reaktifleri ve numuneleri oda sıcaklığına getirin. Lütfen, antikorlar ve serum için beraberindeki belgede belirtilen çalışma dilüsyonlarının, farklı antikorlar ve serumlar kullanıldığında en iyi performansı elde etmek amacıyla yapılan denemeler sonucunda belirlendiğini unutmayın.Protokolün doğrulanması gerekmektedir. Gerekli reaktif miktarını minimize etmek için öncelikle lam üzerindeki kesitleri sıvı bloklayıcı kalemle çevreleyin. Ardından, beyin kesitlerini bir mililitrelik pipet kullanarak nemli bir hazneye yerleştirin.Kesitlere oda sıcaklığında PBS ekleyin ve yıkamak için beş dakika boyunca inkübe edin. Ardından, iğneli bir mililitrelik tek kullanımlık bir şırınga kullanarak solüsyonu uzaklaştırın ve yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın. İkinci yıkama işlemini tamamladıktan sonra, tüm solüsyon değişimleri için bir mililitrelik bir pipet ve tek kullanımlık bir şırınga kullanarak numuneleri boyama işlemine geçin. Boyama prosedürü, burada özetlendiği şekilde gerçekleştirilmelidir.Yıkama adımları da dahil olmak üzere detaylar için lütfen beraberindeki metne bakınız. İlk olarak, hücreler normal keçi serumu ile bloke edildikten sonra %1 hidrojen peroksit ile inkübe edilir. Ardından, CD 11 B'ye karşı primer antikor ile inkübe edilirler. Sonrasında, lamlar uygun bir sekonder antikor ile inkübe edilir ve ardından tris, NaCl tween tamponu veya TNT; TNB ile inkübasyondan sonra ise tris, HCl-NaCl bloklama tamponu veya TNB ile inkübe edilir.Slaytlar, önce streptavidin HRP ile, ardından immunofloresan sinyali güçlendirecek olan cyanide five tyrom içeren amplifikasyon dilüenti ile inkübe edilir. Sonrasında, spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke etmek için slaytlar NGS ile inkübe edilir. Ardından CD 68'e karşı bir primer antikor ile inkübasyona bırakılırlar.Birincil antikor ile inkübasyonun ardından, hücreler uygun Flor konjugatlı ikincil antikor ile inkübe edilir ve ardından DNA'yı etiketlemek için mililitre başına bir mikrogram hooklar uygulanır. Boyama tamamlandığında, kriyoseksiyonları prolonged gold kullanarak monte edin; kesitleri monte ederken hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Kesitleri, analiz edilene kadar dört °C'de karanlıkta saklayın.Floresan sinyalin alımı bir hafta içinde gerçekleştirilmelidir. Bu protokol; üç lazer hattına (488 nanometre argon kripton, 646 nanometre helyum neon kırmızı ve 532 nanometre helyum neon yeşil) ve U 500 yazılımı akışındaki bir UV diyoda sahip FV 500 konfokal tarama ünitesi ile donatılmış bir IX 81 mikroskobu kullanmaktadır. Uygun eksitasyon lazerlerini ve dikroik aynaları seçin.Ayrıca görüntü çözünürlüğünü minimum 800 by 600 piksel olarak ayarlayın. Ardından, lamı mikroskobun tablasına yerleştirin ve epi-floresans kullanarak ilgi çekici bir alan belirleyip büyütmeyi kademeli olarak 40 x objektife yükseltin. Daha sonra lazer taramalı mikroskopi moduna geçin ve her kanal için fotomultiplier güç seviyesini ve kazancı ayarlayarak tekrarlı taramalar gerçekleştirin.Bu işlem, farklı dalga boylarındaki eş zamanlı uyarılmanın neden olduğu sinyal örtüşmesini azaltacaktır. İstenmeyen spesifik olmayan sinyallerden kaçınmak için kazancı mümkün olduğunca düşük tutun. Tekrarlayıcı taramaya devam ederken odağı ayarlayın ve toplam Z ekseni uzunluğu 10 mikron olacak şekilde Z ekseninin alt ve üst uç noktalarını belirleyin.Ardından tekrarlayan taramayı durdurun. Sonra, adım boyutunu girin. Bu değer, 0.225 mikron olan piksel boyutuna mümkün olduğunca yakın olmalıdır.Bu, yazılımda Z ekseni boyunca standart bir bire bir boyut oranı sağlayacaktır; kalman filtresini en az iki kez etkinleştirin. Kalman algoritması, arka plan gürültüsüne ait tekil pozitif vokselle gibi rastgele sinyalleri ortadan kaldıran yinelemeli bir fonksiyondur ve böylece sinyal-gürültü oranını iyileştirir. Şimdi, sızıntı etkilerini önlemek için ardışık tarama modunu etkinleştirin.Z ekseninin orta noktasına gidin ve bir XY ardışık tarama gerçekleştirin. Tatmin edici bir sinyal-gürültü oranı sağlamak için PMT ve kazanç ayarlarını kontrol edin. Edinimin ardından XY, Z edinimini gerçekleştirin.Verileri çoklu TIF dosyası olarak dışa aktarın. Her bir çoklu TIF dosyası tipik olarak, işleme tabi tutulmak üzere üç renk kanalı ve 44 odak düzlemi içerir. İşleme imas yazılımını açarak başlayın.Öncelikle, surpass görünümünü seçin, ardından multi TIF dosyasını yükleyin. Sonra, ekran ayarı panelinde, her kanal için istenen rengi buradan seçin. Kırmızı CD 11 B'yi, yeşil CD 68'i ve mavi hooks DNA boyasını temsil eder. Arka plandaki gürültüyü gidermek için her kanal için ekran ayarı panelindeki minimum değeri artırın.Ardından, x, Z ve YZ eksenlerinin ortogonal projeksiyonlarıyla birlikte tek bir XY odak düzlemini görselleştirmek için kesit görünümüne gidin. Sarı pikseller şeklinde görünen kolokalizasyonu aramak için Z ekseni boyunca ilerleyin. Kolokalizasyonun Z ekseni boyunca mevcut olup olmadığını görmek için sarı bir alana tıklayın; bu durum, kolokalizasyonun katı bir nesne Z eksenine ait olduğunu gösterir.İzdüşümler şeklin sağ ve alt kısmında görünmektedir. Bir anlık görüntü alın, ardından surpass görünümüne geri dönün. Sonrasında, düzenleme açılır menüsünden 3D kırpmayı seçin ve bir hücreyi veya hücre kümesini izole etmek için bir ilgi alanı belirleyin.Ardından ekran ayar panelinde bir kanal seçin. Surpass surfaces algoritma oluşturucusunu seçin. Daha sonra algoritmayı kurmak için öncelikle bir kanal seçin.Ardından, eşiği ekran ayarları panelinde belirlenen minimum değerle aynı şekilde tanımlayın ve gerekirse yeniden boyutlandırmayı belirleyin. Sonra, yumuşatmayı 0,200 olarak tanımlayın. Renk panelini seçin ve görünümü gerektiği şekilde değiştirin.Surpass yüzeyler algoritma oluşturucu kurulumunu her kanal için tekrarlayın. Ardından ekran ayarlama panelinde, floresan kanallarının seçimini kaldırın ve üç yüzeyin tamamını seçin. Son olarak, en iyi görünümü bulmak için hacmi hareket ettirin ve MM markörlerinin ko-ekspresyon paternini belirlemek için bir anlık görüntü alın.Bu videoda açıklanan immünofloresan ve konfokal görüntüleme protokolleri, orta serebral arterin kalıcı tıkanıklığı ile indüklenen bir fokal iskemi fare modeli üzerinde gerçekleştirilmiştir. Elde edilen görüntülerin iki boyutlu görünümü, iskemiden 24 saat sonra, yeşil renkle gösterilen lizozomal marker CD 68'in, iskemik çekirdekte bulunan ve kırmızı renkle görülen CD 11 B pozitif hipertrofik hücrelerde eksprese olduğunu göstermektedir. Sağ alt köşede gösterilen Z ekseni projeksiyonu, tek düzlem görünümünde belgelenen marker dağılımının, sınır bölgesinde Z ekseni boyunca da mevcut olduğunu kanıtlamaktadır.CD 11 B pozitif hücreler, CD 68 için yüksek düzeyde pozitif olan uzantılara sahip hipertrofik hücre gövdeleri sergilemektedir; bu durum, fagosomların hücre membranına bağlı olduğunu göstermektedir. Bu durum, M2 polarize belirteci olan YM 1 ve CD 68'in ko-ekspresyonunu değerlendirmek için mikroglial hücrelerin aktif PHA asidik davranışını işaret eder. Floresan görüntüler üç boyutlu olarak işlenmiştir.Burada gösterilen elde edilmiş görüntülerin üç boyutlu görünümü, yeşil ile gösterilen CD 68 pozitif hücrelerin ve kırmızı floresan vokselle gösterilen YM one pozitif hücrelerin varlığını belirtmektedir. Paralel konumlandıklarında, gözlemcinin bakış açısı sarı olarak görülen bir ko-lokalizasyon sinyali verebilir ve bu durum belirteçler arasındaki gerçek mesafe ile ilişkili olmayabilir. Ko-lokalizasyonu tanımlamak için.Z ekseni boyunca hareket ederek Z ekseni projeksiyonlarını içeren tek bir düzlem görünümü oluşturulmalıdır. Kolokalizasyon aranmaktadır. Z ekseni projeksiyonu, bu görüntünün sağ ve alt kısımlarında görüldüğü şekilde elde edilir.Floresan vokseller, marker ekspresyonunun belirli bir hücresel gövdeye atanmasıyla gerçekleştirilen üç boyutlu render işlemi ile katı nesnelere dönüştürülebilir. Yüksek büyütme ve 3D render sonrası, iki marker'ın birbirine yakın konumdaki farklı hücrelere ait olduğu görülmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, çoklu marker ve boyalarla immünofloresan analizin nasıl yapılacağı ile konfokal mikroskopi kullanılarak üç boyutlu görüntülerin nasıl doğru şekilde elde edileceği ve görselleştirileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.Ek olarak, açıklanan işlem sonrası analiz, hücresel düzeydeki herhangi bir ko-ekspresyon veya kolokalizasyonu analiz etmek için ya da sinyallerin farklı uzamsal düzlemlerde seçici olarak lokalize edilmesi gereken durumlar için verimli bir şekilde kullanılabilir.

three-dimensional-confocal-analysis-microgliamacrophage-markers

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Deneysel Beyin Hasarında Mikroglya/Makrofaj Polarizasyonunun Üç Boyutlu Konfokal Analizi

Akut beyin travması bugüne kadar yeterli bir tedavisi olmayan ciddi bir yaralanma olduğunu. Multiphoton mikroskopi uzunlamasına akut beyin travması gelişim sürecini inceleyerek ve kemirgenlerde terapötik stratejiler sondalama sağlar. Beynin in vivo iki foton görüntüleme ile incelenmiştir akut beyin travması iki model bu protokolde gösterilmiştir.

Boyuna İki foton görüntüleme ile takip Farelerde Akut Beyin Travma

İki fotonlu intravital görüntüleme, dorsal kolon travmatik omurilik ezilme yaralanması olan kemik iliği kimerik bir hayvanda omurilikteki farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir.

Fare Sırt Sütun Crush Yaralanmalarında mikroglia ve Makrofagların ile aksonal İlişkilerin Intravital Görüntüleme

Microglia anket ve değişmiş beyin fizyolojisi kantitatif değerlendirilecek morfolojik değişiklikleri ile tepki beyin bağışıklık hücreleri vardır. Bu iletişim kuralı özetliyor bir ImageJ microglia morfoloji hücre yaklaşım, karmaşıklık ve şekli gibi ölçümleri göre sürekli veri olarak temsil etmek için analiz protokolüne dayalı.

ImageJ kullanarak doku hazırlanan immünhistokimya Photomicrographs üzerinden Microglia morfoloji miktarının

Bu protokol, mikroglial yoğunluk, dağılım ve morfolojinin yanı sıra fare beyin dokusunda periferik miyeloid hücre infiltrasyonunun analizine ek olarak, IBA1 ve TMEM119'un immünororesan costaining'i için adım adım iş akışını tanımlar.

Fare Beyninde Mikroglial Yoğunluk, Morfoloji ve Periferik Miyeloid Hücre Infiltrasyonu Analizi için IBA1 ve TMEM119 Kullanılarak İmmünofloresanS Boyama

Serebral kontüzyonun eşlik ettiği intraparankimal kanama ve nöroinflamasyon ciddi ikincil beyin hasarını tetikleyebilir. Bu protokol, araştırmacıların kanama, kontüzyon ve travma sonrası bağışıklık tepkilerini incelemelerine ve potansiyel terapötikleri keşfetmelerine olanak tanıyan fare kontrollü bir kortikal etki (CCI) modelini detaylandırır.

Travmatik Kanama, Konkontüzyon ve Nöroinflamasyon için Preklinik Kontrollü Kortikal Etki Modeli

Bu protokol, hafif travmatik beyin hasarına nöroinflamatuar ve hemodinamik yanıtı karakterize etmek ve bu verileri kısmi en küçük kareler regresyonunu kullanarak çok değişkenli bir sistem analizinin bir parçası olarak entegre etmek için yöntemler sunmaktadır.

Travmatik Beyin Hasarına Nöroinflamatuar ve Hemodinamik Yanıtın Sistem Analizi

Primer mikroglia kültürleri, yeni anti-enflamatuar molekülleri değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Mevcut protokol, mikroglia'yı yenidoğan yavrulardan manyetik olarak izole etmek için tekrarlanabilir ve ilgili bir yöntemi tanımlamaktadır.

Birincil Hücre Kültürleri için Yenidoğan Fareden Mikroglial Hücrelerin Manyetik İzolasyonu

Protokol, bir fare modelinde hafif travmatik beyin hasarını tanımlar. Özellikle, hafif bir orta hat kapalı kafa travmasını indüklemek için adım adım bir protokol ve hayvan modelinin karakterizasyonu tam olarak açıklanmaktadır.

Farelerde Hafif Travmatik Beyin Hasarının Elektromanyetik Kontrollü Kapalı Kafa Modeli

Yaralı omuriliklerde mikroglia (MG) ve periferik infiltre makrofajları (Mø) tanımlamak zordur. Bu protokolde, sırasıyla M1 benzeri MG, M2 benzeri MG, M1 benzeri Mø ve M2 benzeri Mø'yu tanımlamak için akış sitometrisi (FCM) kullanıldı. Bu teknoloji, MG ve Mø'nun rolünü anlamak için diğer merkezi sinir sistemi hastalıklarına da uygulanabilir.

Akış Sitometrisi Kullanılarak Yaralı Omurilikteki Mikroglia ve Periferik İnfiltre Makrofajların Belirlenmesi

Burada, mini inme modelinde akış sitometrik analizi kullanarak iskemik inme sonrası immün hücre fonksiyonunu değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, nöroimmün etkileşimlerin ayrıntılı olarak incelenmesini sağlar ve diğer nörodejeneratif hastalıkları incelemek için uyarlanabilir ve inme patolojisindeki immün yanıtları anlamamızı geliştirir.

Mini İnme Murin Modelinde Nöroimmün Etkileşimlerin İzolasyonu ve Flow Sitometrik Değerlendirmesi

Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), kodlama uzmanlığı gerektirmeyen ve immünoflüoresans görüntülerden tek hücreli mikrogliyal morfoloji analizini yarı otomatikleştiren kullanıcı dostu bir analiz hattıdır. Kemirgenlerin lipopolisakkaridi indükleyen nöroinflamasyon modelinde doğrulanan MMPS, aktivasyonla ilişkili morfolojik değişiklikleri tekrarlanabilir şekilde tespit eder ve standart, ölçeklenebilir mikroglial fenotiplemeyi mümkün kılar.

Mikroglial Parametreleri Haritalama Yazılımı (MMPS): Nicel Mikroglia Morfoloji Analizi için Açık Kaynaklı, Kullanıcı Dostu Bir Araç

Öğrenin, deneysel beyin iskemisinde mikroglia/makrofaj belirteçlerinin üç boyutlu konfokal görüntüleme ile lokalizasyonunu incelemeyi. Bu yöntem, fare modelinde inflamatuar yanıtı anlamak için yüksek çözünürlük sağlar.

Deneysel Beyin Hasarında Polarizasyonun Mikroglia/Makrofaj Belirteçlerinin Üç Boyutlu Konfokal Analizi

Daha fazla video keşfet