Deneysel Beyin Hasarında Polarizasyonun Mikroglia/Makrofaj Belirteçlerinin Üç Boyutlu Konfokal Analizi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, beyin iskemisini takiben mikroglia makrofaj fenotip belirteçlerinin ekspresyonunu ve hücresel lokalizasyonunu görselleştirmektir. İlk olarak, mikroglia makrofaj aktivasyonunun belirteçlerini tanımlamak için iskemik fare beyinlerinden kriyo kesitleri boyanır. Lekeli bölümler üç boyutlu konfokal görüntülemeye tabi tutulur.

Elde edilen görüntüler daha sonra üç boyutlu işlemeler oluşturmak için işlenir ve hücre kümelerindeki işaretçilerin ifadesini lokalize etmek için görüntü analizi yapılır. Elde edilen veriler, üç boyutlu konfokal analizin belirli bir hücresel gövdeye işaretleyici ifadesinin uygun şekilde atanmasındaki etkinliğini göstermektedir İki belirteç aynı hücre tarafından, ancak farklı hücre altı bölmelerde ifade edildiğinde, tek başına kolokalizasyon çok bilgilendirici olmayabilir. Burada göstereceğimiz gibi üç boyutlu analiz kullanmak, daha iyi bir çözünürlük ve doğruluk sağlar.

Bu yöntem, iskemik hasara beyin yanıtının karmaşıklığı hakkında fikir verebilse de, mikroglia makrofajları için yaralanma ve onarımda ikili bir rol önerildiği diğer akut veya kronik durumlara da uygulanabilir. Ya da sinyallerin farklı özel düzlemlerde seçici olarak lokalize edilmesi gereken durumlarda, Magali'den Carlo Perigo ve Stefan sizi prosedürün farklı adımlarında yönlendirecektir. Aşağıdaki protokol, orta serebral arterin kalıcı tıkanması ile iskeminin indüklendiği fare beyin dokusunu kullanır.

Beynin seri 20 mikron koronal bölümlerini jelatin üzerinde toplamak için bir kriyostat kullanın. Kapalı slaytlar, kullanmadan önce tüm reaktifleri ve numuneleri oda sıcaklığına getirir. Lütfen, eşlik eden belgelerinde listelenen antikorların ve serumun çalışma seyreltmesinin, farklı antikorlar ve serum kullanıldığında en iyi performansı elde etmek için yapılan denemelerden kaynaklandığını unutmayın.

Protokolün doğrulanması gerekiyor. İhtiyaç duyulan reaktif miktarını en aza indirmek için bir sıvı engelleyici kalem kullanarak slayttaki bölümleri daire içine alarak başlayın. Ardından, beyin bölümlerini bir mililitrelik pipet kullanarak ıslak bir odaya yerleştirin.

Bölümlere oda sıcaklığında PBS ekleyin ve yıkamak için beş dakika inkübe edin. Daha sonra iğneli bir mililitrelik tek kullanımlık şırınga kullanarak solüsyonu çıkarın ve yıkamayı bir kez daha tekrarlayın İkinci yıkamayı çıkardıktan sonra, tüm solüsyon değişimleri için bir mililitrelik pipet ve tek kullanımlık bir şırınga kullanarak numuneleri lekelemeye devam edin. Boyama işlemi özetlendiği şekilde yapılmalıdır. Burada.

Yıkama adımları da dahil olmak üzere ayrıntılar için lütfen ekteki metne bakın. İlk olarak, hücreler normal keçi serumu ile bloke edildikten sonra% 1 hidrojen peroksit ile inkübe edilir. Daha sonra, slaytlar uygun bir ikincil antikor ile inkübe edilir, ardından triss, NACL ara tamponu veya TNT, daha sonra triss, H-C-L-N-A-C-L, bloke edici tampon veya TNB ile inkübe edildikten sonra TNB.

Slaytlar, streptavidin HRP ile inkübe edilir, ardından immünofloresan sinyali yükseltecek olan siyanür beş tirom içeren amplifikasyon seyrelticisi ile inkübe edilir. Daha sonra, slaytlar spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke etmek için NGS ile inkübe edilir. Daha sonra CD 68'e karşı bir primer antikor ile inkübe edilirler.

Birincil antikor ile inkübasyonu takiben, hücreler daha sonra uygun Fluor konjuge ikincil antikor içinde inkübe edilir, ardından DNA'yı etiketlemek için mililitre kanca başına bir mikrogram uygulanır. Boyama tamamlandıktan sonra, bölümleri monte ederken uzun süreli altın kullanarak kriyo bölümlerini monte edin, hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. Bölümleri analiz edilene kadar karanlıkta dört santigrat derecede saklayın.

Floresan sinyalin alınması bir hafta içinde yapılmalıdır. Bu protokol, üç lazer çizgisine sahip bir konfokal tarama ünitesi FV 500 ile donatılmış bir IX 81 mikroskobu, 488 nanometrede argon, 646 nanometrede helyum neon kırmızısı ve 532 nanometrede helyum neon yeşili ve ayrıca U 500 yazılımının gribinde bir UV diyotu kullanır. Uygun uyarma lazerlerini ve dikroik aynaları seçin.

Ayrıca görüntü çözünürlüğünü en az 800 x 600 piksel olarak ayarlayın. Ardından, slaydı mikroskobun sahnesine yerleştirin ve epi floresan kullanarak, bir ilgi alanı belirleyin, büyütmeyi kademeli olarak 40 x objektife yükseltin. Ardından lazer tarama mikroskobu modalitesine geçin ve fotoçoğaltıcı güç seviyesini ve her kanal için kazancı ayarlarken tekrarlayan taramalar yapın.

Bu, farklı dalga boylarında çağdaş uyarılmanın neden olduğu sinyal örtüşmesini azaltacaktır. İstenmeyen spesifik olmayan sinyalleri önlemek için kazancı mümkün olduğunca düşük tutun. Tekrarlayan taramaya devam ederek, odağı ayarlayın ve toplam Z ekseni uzunluğu 10 mikron olan Z ekseninin alt ve üst uçlarını tanımlayın.

Ardından tekrarlayan taramayı durdurun. Ardından, adım boyutunu girin. 0,225 mikron olan piksel boyutuna mümkün olduğunca yakın olmalıdır.

Bu, yazılımda Z ekseni üzerinde standart bire bir boyut oranı verecektir: Kalman filtresini en az iki kez etkinleştirin. Kalman algoritması, arka plan gürültüsüne ait tek pozitif vokseller gibi rastgele sinyalleri ortadan kaldıran ve böylece sinyal-gürültü oranını iyileştiren yinelemeli bir işlevdir. Şimdi, efektler arasında sızıntıyı önlemek için sıralı tarama modunu etkinleştirin.

Z ekseninin orta noktasına gidin ve bir XY sıralı taraması çalıştırın. Tatmin edici bir sinyal-gürültü oranı sağlamak için PMT ve kazanç kurulumunu kontrol edin. Satın almayı takiben XY, Z satın alımını çalıştırın.

Verileri çoklu TIF dosyası olarak dışa aktarın. Her çoklu TIF dosyası, işleme için tipik olarak üç renk kanalı ve 44 odak düzlemi içerir. İmas yazılımını açarak başlayın.

Önce aşma görünümünü seçin, ardından çoklu TIF dosyasını yükleyin. Ardından, ekran ayar panelinde, her kanal için istediğiniz rengi seçin Burada. Kırmızı, CD 11'i temsil eder B.Yeşil, CD 68'i temsil eder ve mavi, arka plandaki gürültüyü gidermek, her kanal için ekran ayar panelindeki minimum değeri artırmak için kanca DNA lekesini temsil eder.

Ardından, x, Z ve YZ ekseninin ortogonal projeksiyonlarına sahip tek bir XY odak düzlemini görselleştirmek için kesit görünümüne gidin. Sarı pikseller olarak görünen kolokalizasyonu aramak için Z ekseni boyunca hareket edin. Z ekseni boyunca kolokalizasyonun mevcut olup olmadığını görmek için sarı bir alana tıklayın, bu da katı bir nesne Z eksenine ait olduğunu gösterir.

Çıkıntılar şeklin sağ ve alt kısmında görülebilir. Bir anlık görüntü alın, ardından geçiş görünümüne geri dönün. Ardından, düzenle açılır menüsünde 3B'yi kırp'ı seçin ve bir hücreyi veya hücre kümesini izole etmek için ilgilenilen bir bölgenin ana hatlarını çizin.

Ardından ekran ayarlama panelinde bir kanal seçin. Yüzeyleri aşma algoritması oluşturucusunu seçin. Ardından algoritmayı kurmak için önce bir kanal seçin.

Ardından eşiği, ekran ayarlama panelinde ayarlananla aynı minimum değer olarak tanımlayın ve gerekirse yeniden boyutlandırmayı tanımlayın. Ardından, yumuşatmayı 0,200 olarak tanımlayın. Renk panelini seçin ve görünümü gerektiği gibi değiştirin.

Her kanal için yüzey algoritması oluşturucusu için kurulumu tekrarlayın. Ardından ekran ayarlama panelinde, floresan kanallarının seçimini kaldırın ve üç yüzeyi de seçin. Son olarak, en iyi görünümü bulmak için sesi hareket ettirin ve MM işaretçilerinin birlikte ifade modelini belirlemek için bir anlık görüntü alın.

Bu videoda açıklanan immünofloresan ve konfokal edinim protokolleri, orta serebral arterin kalıcı oklüzyonu ile indüklenen fokal iskeminin bir fare modelinde gerçekleştirildi. Elde edilen görüntülerin iki boyutlu bir görünümü, iskemiden 24 saat sonra, yeşil ile gösterilen lizozomal belirteçler CD 68'in, iskemik çekirdekte bulunan kırmızı renkte görülen CD 11 B pozitif hücreler arasında hipertrofik olarak eksprese edildiğini göstermektedir. Sağ altta gösterilen Z ekseni projeksiyonu, tek düzlem görünümünde belgelenen işaretçi dağılımının sınır bölgesindeki Z ekseni boyunca da mevcut olduğunu gösterir.

CD 11 B pozitif hücreler, CD 68 için oldukça pozitif süreçlere sahip hipertrofik hücre gövdeleri gösterir, bu da fagozomların hücre zarına bağlı olduğunu düşündürür. Bu, CD 68 ve YM birin ko-ekspresyonunu değerlendirmek için mikroglial hücrelerin aktif PHA asidik davranışını gösterir, M iki polarize bir işaretleyicidir. Mm. Floresan görüntüler üç boyutlu render işlemine tabi tutuldu.

Burada gösterilen elde edilen görüntülerin üç boyutlu görünümü, yeşil renkte gösterilen CD 68 pozitif hücrelerin ve kırmızı floresan voksellerde gösterilen YM bir pozitif hücrelerin varlığını göstermektedir. Paralel döşendiğinde, gözlemcinin görüşü, sarı olarak görülen ve işaretler arasındaki gerçek mesafe ile ilgili olmayabilecek bir eş lokalize sinyal verebilir. Kolokalizasyonu tanımlamak.

Z ekseni boyunca hareket ederek Z ekseninin projeksiyonlarını içeren tek bir düzlem görünümü oluşturulmalıdır. Yerelleştirme arıyorum. Z ekseni projeksiyonu, bu görüntünün sağ ve alt kısmında görüldüğü gibi elde edilir.

Floresan vokseller, belirli bir hücresel gövdeye işaretleyici ifadesinin atanmasıyla üç boyutlu işleme ile katı nesnelere dönüştürülebilir. Yüksek büyütme ve 3D işlemeden sonra, iki işaretleyici birbirine yakın farklı hücrelere ait gibi görünüyor. Bu videoyu izledikten sonra, birden fazla işaretleyici ve boya ile bir immünofloresan testinin nasıl gerçekleştirileceğini ve konfokal mikroskopi ile üç boyutlu görüntülerin nasıl düzgün bir şekilde elde edileceğini ve görselleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Ek olarak, işlem sonrası analiz, hücresel düzeyde herhangi bir ortak ekspresyon veya kolokalizasyonu analiz etmek için veya sinyallerin farklı uzamsal düzlemlerde seçici olarak lokalize edilmesi gereken durumlarda verimli bir şekilde kullanılabileceğini açıkladı.