Yalıtım ve mikrobiyal topluluklarda toprak, rizosferde ve kökleri çok yıllık çim deneylerde Analizi

Bu yöntem, mikrobiyal topluluk çeşitliliğinin numune tipine, tedaviye ve bitki genotipine yanıt olarak nasıl değiştiği gibi toprak, rizosfer ve kök endosfer mikrobiyom alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, büyük numune sayıları ve çoğaltma gerektiren saha deneyleri için çok uygun olmasıdır. Prosedürü göstermek ben ve laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi ve araştırma teknisyeni olan Stephanie Futrell olacak.

Protokole başlamak için, bir yıkama tavasını ve kovayı bitki numunesi ayrıntılarını içeren yapışkan bir notla etiketleyin. Etiketli kovayı arsaya taşıyın ve yıkama kabını sahada kurulu iş istasyonunda bırakın. Arsa içindeki farklı alanlardan arsa başına rastgele iki bitki seçin ve toplayın.

Daha sonra, bitkiyi toprakta tutan yan köklerden herhangi birini kesmek için toprağı bir kürekle 30 santimetre derinliğe kadar delin. Küreği kullanarak bitki köklerini kazın ve kök topunu etiketli kovaya yerleştirin. Kovayı sahadaki iş istasyonuna geri getirin.

Kökleri sallayın ve köklerden toprağı çıkarmak için bir kürek veya el tipi yeke kullanın. Eldiven giyin ve kökleri işleme istasyonunun yanına yerleştirin. Kökleri salladıktan sonra, toprağı yıkama tavasında karıştırın ve el tipi bir yeke ile toprak parçalarını parçalayın.

Etiketli, 17,7 x 19,5 santimetre fermuarlı bir saklama torbasına kalıntı içermeyen bir toprak örneği koyun ve buzun üzerine yerleştirin. Budama makasını% 70 etanol içinde sterilize edin. Bitki başına yaklaşık dört ila altı kök ve her bir kök yaklaşık dokuz ila 12 santimetre uzunluğunda olmak üzere çeşitli kökleri çıkarmak için steril makası kullanın.

Eksize edilen kökleri, Silwet L-77 gibi bir yüzey aktif madde ile 35 mililitre otoklavlanmış fosfat tamponu içeren etiketli 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Rizosferi köklerin yüzeyinden serbest bırakmak için tüpleri iki dakika çalkalayın. Bir jeneratör ve girdap ile sallamayı iyileştirin.

% 70 etanol içinde sterilize edilmiş forseps ile kökleri tüpten çıkarın, kısa bir süre kağıt havlu üzerine kurulayın ve yeni, etiketli, 50 mililitrelik bir tüpe koyun. Hem rizosferi içeren tüpü hem de kökleri içeren tüpü buzun üzerine yerleştirin. Tarlada toplanan köklerin bulunduğu 50 mililitrelik tüplere yaklaşık 35 mililitre %50 çamaşır suyu artı %0,01 Tween 20 ekleyin.

Tüpleri 30 ila 60 saniye boyunca girdaplayın veya sallayın. Ağartıcıyı dökün, 35 mililitre% 70 etanol ekleyin ve kökleri 30 ila 60 saniye daha girdaplayın veya sallayın. Çalkaladıktan sonra,% 70 etanolü dökün ve 35 mililitre steril, ultra saf su ekleyin ve numuneyi bir dakika boyunca sallayın veya sallayın.

Suyla durulama adımını iki kez daha tekrarlayın, böylece kök steril, ultra saf su ile toplam üç durulama alır. Kökleri kuru, temiz kağıt havluların üzerine kurulayın ve her numune için temiz bir kağıt havlu kullanın. Steril forseps ve budama makası kullanarak, kökleri yaklaşık beş milimetrelik parçalar halinde kesin ve kesilmiş kökleri temiz, etiketli, 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin, ardından numuneleri daha fazla işlenene kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Tüm numuneyi yeniden askıya almak için rizosfer numuneleri içeren 50 mililitrelik tüpleri sahadan 20 ila 30 saniye çalkalayın. Steril, 100 mikronluk bir ağ hücre süzgeci kullanarak, yeniden askıya alınmış numuneyi 50 mililitrelik yeni bir tüpe süzün. Daha sonra, tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 3.000 kez g'de santrifüjleyin.

Hemen dökün ve süpernatanı atın. Rizosfer peletlerini buz üzerindeki 50 mililitrelik tüplere yerleştirin. Ardından, rizosfer peletlerine yüzey aktif madde içermeyen 1,5 mililitre steril fosfat tamponu ekleyin ve numuneyi yeniden askıya almak için bunları girdaplayın.

Asılı sıvıyı temiz, etiketli, iki mililitrelik bir mikrofüj tüpüne pipetleyin. Tüpleri oda sıcaklığında iki dakika boyunca 15.871 kez g'de döndürün. Hemen süpernatanı dökün ve tüpleri temiz kağıt havluların üzerine boşaltın.

Peletleri daha fazla işlenene kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Steril bir metal spatula kullanarak, DNA ekstraksiyonu için temiz, etiketli, iki mililitrelik bir tüpü yaklaşık üç gram toprakla doldurun ve küçük kök parçalarından ve döküntülerden kaçının. Metal spatulayı her numune arasında% 70 etanol içinde durulayın.

Bu toprak örneğini eksi 20 santigrat derecede saklayın. Temiz bir yıkama tavasında, daha büyük elek daha küçük eleğin üzerinde olacak şekilde toprak torbasını istiflenmiş eleklere boşaltın ve toprağı her iki elekten de manuel olarak eleyin. Numuneler arasındaki elekleri dikkatlice temizlemek için bir fırça kullanın.

Gelecekteki toprak fizikokimyasal ve doku analizi için 17,7 x 19,5 santimetre fermuarlı bir torbada 100 ila 125 gram elenmiş toprağı bir kenara koyun. Kısa süreli depolama için toprak torbalarını dört santigrat dereceye yerleştirin. Daha sonra, sıvı nitrojeni temiz bir spatula ile plastik bir behere ve temiz bir harç içine dökün.

Donmuş dokuyu harcın içine koyun ve havaneli ile ince bir toz haline getirin. Numuneleri donmuş halde tutmak için öğütme boyunca sürekli olarak sıvı nitrojen ekleyin. Öğütülmüş dokuyu temiz, etiketli, iki mililitrelik bir tüpe aktarmak için bir spatula kullanın ve ardından dokuyu eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Çalışma alanını %70 etanol ve %1 ev tipi çamaşır suyu ile silin. Toprak örneklerini eksi 20 santigrat derece depodan çıkarın ve bir buz kovasında çözdürün. Sızdırmazlık matı kapağını 96 oyuklu bir ekstraksiyon plakasından çıkarın ve kullanılmadığı zamanlarda temiz tutmak için kapağı iki kağıt mendil arasına yerleştirin.

Kontaminasyonu önlemek için plakanın 12 sütununu yapışkan 8 kuyulu PCR şeritleri ile örtün. Bir tartı üzerinde steril, küçük bir tartım hunisini daralayın ve 200 ila 250 miligram toprağı tartın. Yapışkan şeridi dikkatlice yukarı kaldırın, doldurulmuş tartım hunisinin boynunu uygun kuyuya yerleştirin ve toprak numunesini nazikçe uygun kuyuya yönlendirin.

Kuyuyu kapatmak için yapışkan şeridi değiştirin. Her numune için yeni bir steril huni kullanarak bu işlemi her kuyucuk için tekrarlayın. Ekstraksiyon plakasındaki sızdırmazlık matı kapağını değiştirin ve plakayı DNA ekstraksiyonu için hazır olana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Rizosfer örneklerini eksi 20 santigrat derece depodan çıkarın ve bir buz kovasında çözdürün. DNA ekstraksiyon plakasını önceki bölümde yapıldığı gibi hazırlayın. Bir tartıya temiz bir kağıt mendil koyun, ardından tartıya steril bir metal spatula darasını alın.

Bir numune tüpünden rizosfer peletinin bir kısmını dikkatlice çıkarmak için spatulayı kullanın. Rizosfer örneğinin 200 ila 250 miligramı arasında tartın. Ekstraksiyon plakasının ilk kuyusunu ortaya çıkarmak için yapışkan şeridi dikkatlice kaldırın.

Doldurulmuş spatulayı kuyuya açı verin ve rizosfer malzemesini steril bir kürdan ile uygun kuyuya kazıyın. Metal spatulayı suyla durulayın, ardından numuneler arasında %70 etanol uygulayın. Son olarak, plaka dolana kadar plakanın her oyuğu için bu işlemi tekrarlayın ve ekstraksiyon boş kontrolü olarak bir kuyuyu boş bırakın.

Bu temsili veri setinde, numune türleri arasında oldukça önemli farklılıklar vardı ve rizosfer ve toprak, bileşim olarak kökten daha benzer görünmektedir. Daha ileri analizler, rizosfer ve toprak arasındaki mikrobiyal topluluk bileşiminde de oldukça önemli farklılıklar olduğunu göstermektedir. Alfa çeşitlilik analizi, endosferdeki mikrobiyal toplulukların toprak ve rizosferdeki topluluklardan daha düşük olduğunu göstermektedir.

Çim türleri arasındaki çeşitlilikteki tek önemli fark, büyük bluestem ve switchgrass'ın endosfer örnekleri arasındaydı. Bağıl bolluk analizi, tüm numune türlerinde Proteobakterilerin baskınlığını ve ardından Aktinobakterileri vurgulamaktadır. Toprak ve rizosfere Asidobakteriler ve Klorofleksi hakimdir, oysa kökler daha büyük bir nispi Bakteriyodet bolluğuna sahiptir.

Tüm numune tiplerinin PERMANOVA analizi, bitki türlerine bağlı olarak mikrobiyal topluluk bileşiminde oldukça önemli bir farkı ortaya koymuştur. Bu videoyu izledikten sonra, toprak, endosfer ve rizosfer mikrobiyomlarının incelenmesinde kullanılacak bir dizi adımın nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu eğitim videosunun kısmen finanse edilmesi için Nebraska EPSCoR'a ve Ulusal Bilim Vakfı EPSCoR Araştırma Altyapısı Programı Track 1'e teşekkür ederiz.