Name: Yalıtım ve mikrobiyal topluluklarda toprak, rizosferde ve kökleri çok yıllık çim deneylerde Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Öğrenin toprak, rizosfer ve kök endosfer örneklerinin yalıtımı ve analizi için standart protokolleri. Bu yöntem mikrobiyal topluluk çeşitliliğini incelemek ve saha deneylerinde tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu el yazması geliştirilmesi kök ve Rhizobiome Yenilik Ödülü OIA-1557417 Ulusal Bilim Vakfı EPSCoR Merkezi tarafından desteklenir. Veri toplama fonları Nebraska Üniversitesi-Lincoln, Tarımsal Araştırma ve geliştirme ve USDA bir Hatch hibe tarafından desteklenmiştir. Biz de USDA ARS desteğinden kabul ve destek tarım ve gıda araştırma girişimi rekabetçi Grant No 2011-68005-30411 tarafından kurmak ve bu alanları yönetmek için USDA Ulusal Enstitüsü Gıda ve tarım sağlandı.

<ol><li>Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+back+to+the+roots%3A+the+microbial+ecology+of+the+rhizosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 789-799 (2013).</li>
<li>Fierer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embracing+the+unknown%3A+disentangling+the+complexities+of+the+soil+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome.</a> Nature Review Microbiology. 15 (10), 579-590 (2017).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shifts+in+microbial+communities+in+soil%2C+rhizosphere+and+roots+of+two+major+crop+systems+under+elevated+CO2+and+O3%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Shifts in microbial communities in soil, rhizosphere and roots of two major crop systems under elevated CO2 and O3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 15019(2017).</li>
<li>White, L. J., Jothibasu, K., Reese, R. N., Brözel, V. S., Subramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio+Temporal+influence+of+isoflavonoids+on+bacterial+diversity+in+the+soybean+Rhizosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Spatio Temporal influence of isoflavonoids on bacterial diversity in the soybean Rhizosphere.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 28 (1), 22-29 (2015).</li>
<li>Edwards, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+variation%2C+and+assembly+of+the+root-associated+microbiomes+of+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (8), E911-E920 (2015).</li>
<li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana+root+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.</a> Nature. 488, 86-90 (2012).</li>
<li>Bougoure, D. S., Cairney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblages+of+ericoid+mycorrhizal+and+other+root-associated+fungi+from+Epacris+pulchella+%28Ericaceae%29+as+determined+by+culturing+and+direct+DNA+extraction+from+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Assemblages of ericoid mycorrhizal and other root-associated fungi from Epacris pulchella (Ericaceae) as determined by culturing and direct DNA extraction from roots.</a> Environmental Microbiology. 7 (6), 819-827 (2005).</li>
<li>Doty, S. L., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007%2FBF03179967">Diazotrophic endophytes of native black cottonwood and willow.</a> Symbiosis. 47 (1), 23-33 (2009).</li>
<li>Gottel, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+microbial+communities+within+the+endosphere+and+rhizosphere+of+populus+deltoides+roots+across+contrasting+soil+types%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Distinct microbial communities within the endosphere and rhizosphere of populus deltoides roots across contrasting soil types.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (17), 5934-5944 (2011).</li>
<li>Xin, G., Glawe, D., Doty, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+three+endophytic%2C+indole-3-acetic+acid-producing+yeasts+occurring+in+Populus+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Mycological+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of three endophytic, indole-3-acetic acid-producing yeasts occurring in Populus trees.</a> Mycological Research. 113, 973-980 (2009).</li>
<li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biolology%22%5BJournal%5D)">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biolology. 12, 87(2014).</li>
<li>Gohl, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+improvement+of+amplicon+marker+gene+methods+for+increased+accuracy+in+microbiome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systematic improvement of amplicon marker gene methods for increased accuracy in microbiome studies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 942-949 (2016).</li>
<li>Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+dual-index+sequencing+strategy+and+curation+pipeline+for+analyzing+amplicon+sequence+data+on+the+MiSeq+Illumina+sequencing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform.</a> Applied Environmental Microbiology. 79 (17), 5112-5120 (2013).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li>
<li>Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+innovations+for+high-throughput+amplicon+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing.</a> Nature Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).</li>
<li>RStudio, T. RStudio: Integrated Development for R. RStudio, Inc. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.rstudio.com/">http://www.rstudio.com/</a> (2015).</li>
<li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UPARSE%3A+highly+accurate+OTU+sequences+from+microbial+amplicon+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads.</a> Nature Methods. 10 (10), 996-998 (2013).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li>
<li>Shannon, C. <a target="_blank" href="http://affect-reason-utility.com/1301/4/shannon1948.pdf">A mathematical theory of communication.</a> Bell System Technical Journal. 27, 379-423 (1948).</li>
<li>Simpson, E. H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/163688a0">Measurement of diversity.</a> Nature. 163, 688(1949).</li>
<li>Chao, A. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/4615964">Non-parametric estimation of the number of classes in a population.</a> Scandanavian Journal of Statistics. 11, 265-270 (1984).</li>
<li>Legendre, P. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jpe/article/1/1/3/1130269">Studying beta diversity: Ecological variation partitioning by multiple regression and canonical analysis.</a> Journal of Plant Ecology. 1 (1), 3-8 (2008).</li>
<li>Oksanen, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/228975085_The_Vegan_Package">The vegan package.</a> Community Ecology Package. 10, 631-637 (2007).</li>
<li>Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWickham%2C+H+%22Ggplot2%3A+Elegant+Graphics+for+Data+Analysis%22">Ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis</a>. , Springer Nature. Switzerland. 1-212 (2009).</li>
<li>Cole, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ribosomal+Database+Project+%28RDP-II%29%3A+sequences+and+tools+for+high-throughput+rRNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for high-throughput rRNA analysis.</a> Nucleic Acids Research. 33, D294-D296 (2006).</li>
<li>Wagner, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+genotype+and+age+shape+the+leaf+and+root+microbiomes+of+a+wild+perennial+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Host genotype and age shape the leaf and root microbiomes of a wild perennial plant.</a> Nature Communications. 7, 12151(2016).</li>
<li>O'Brien, H. E., Parrent, J. L., Jackson, J. A., Moncalvo, J. M., Vilgalys, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+community+analysis+by+large-scale+sequencing+of+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fungal community analysis by large-scale sequencing of environmental samples.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (9), 5544-5550 (2005).</li>
<li>Taylor, D. L., et al. <a target="_blank" href="https://esajournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1890/12-1693.1">A first comprehensive census of fungi in soil reveals both hyperdiversity and fine-scale niche partitioning.</a> Ecological Monographs. 84 (1), 3-20 (2014).</li>
<li>Lebeis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salicylic+acid+modulates+colonization+of+the+root+microbiome+by+specific+bacterial+taxa%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Salicylic acid modulates colonization of the root microbiome by specific bacterial taxa.</a> Science. 349 (6250), 860-864 (2015).</li>
<li>Ofek-Lalzar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche+and+host-associated+functional+signatures+of+the+root+surface+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commununications%22%5BJournal%5D)">Niche and host-associated functional signatures of the root surface microbiome.</a> Nature Commununications. 5, 4950(2014).</li>
<li>Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+and+representative+bacterial+community+of+maize+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Simplified and representative bacterial community of maize roots.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).</li>
<li>Fitzpatrick, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+ecological+function+of+the+root+microbiome+across+angiosperm+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Assembly and ecological function of the root microbiome across angiosperm plant species.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 115 (6), E1157-E1165 (2018).</li>
<li>Ramirez, K. S., Lauber, C. L., Knight, R., Bradford, M. A., Fierer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consistent+effects+of+nitrogen+fertilization+on+soil+bacterial+communities+in+contrasting+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology%22%5BJournal%5D)">Consistent effects of nitrogen fertilization on soil bacterial communities in contrasting systems.</a> Ecology. 91 (12), 3463-3470 (2010).</li>
<li>Paungfoo-Lonhienne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+the+table%3A+Plants+consume+microbes+as+a+source+of+nutrients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Turning the table: Plants consume microbes as a source of nutrients.</a> PLoS One. 5 (7), e11915(2010).</li>
<li>Yeoh, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+root+microbiome+of+sugarcanes+cultivated+under+varying+nitrogen+fertilizer+application%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The core root microbiome of sugarcanes cultivated under varying nitrogen fertilizer application.</a> Environmental Microbiology. 18 (5), 1338-1351 (2016).</li>
<li>Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functions+of+the+bacterial+microbiota+of+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure and functions of the bacterial microbiota of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).</li>
<li>Peiffer, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+heritability+of+the+maize+rhizosphere+microbiome+under+field+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome under field conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (16), 6548-6553 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu el yazması açıklanan yöntemler bilim adamları kolayca toprak ve bitki metagenomics alana girmek izin vermesi gerekir. Yıllar boyunca, biz bu el yazması açıklanan deney beri bizim yöntemleri iyileştirdiyseniz. Biz şimdi tüpler için örnek alana dışarı çıkmadan önceden etiket bu bir değişimdir. Laboratuarımızın barkodlama sistemi ve bir etiket yazıcısı kullanır. Etiket yazıcısının sadece ne zaman etiketleme tüpler, ama aynı zamanda daha kolay izlemek ve doğru örnekleri olmadan insan el yazma kaprisleri tanımlamak için her şeyi yapar zaman kazandırır. Başka bir kritik nokta bu geri alandan en kısa zamanda getirdikten sonra malzeme işlemek çalışıyoruz olduğunu. DNA analizi için kullanılan toprak dondurmak, sterilize ve kökleri, donma ve filtre ve tarladan döndükten sonra 12-36 saat içinde rizosferde dondurmak hedefliyoruz. Biz DNA ekstraksiyon protokolleri için zamanında eller en aza indirir, tanıttı insan hatası azaltır bir robot (Kingfisher Flex, ThermoFisher) satın böylece DNA ekstraksiyon yordamları adım, özellikle için toprak ve rizosferde, uzun, ve tutarlılık içinde çok farklı geliştirir toplu toprak, kökleri veya rizosferde işlenir. Bitki materyali ile çalışırken belirlenmesi için ya da bir "temsilcisi örnek" almak için kök türü almak kök türüne karar vermek önemlidir. Kökler ve DNA çekimi iletken 96-şey DNA ekstraksiyon plakaları doldururken örnekleri arasında çapraz bulaşma olduğunu kontrol ettikten gibi önemli olduğunda donmuş bir durumda bırakır. Başka bir önemli faktör dikkate tasarımı sahada yapılan deneyler ve tam bir kullanarak tasarım mümkünse randomize kullanılacak çoğaltır sayısıdır26. Yüksek alan değişkenlik nedeniyle çok sayıda küçük farklılıkları algılamak için çoğaltır gerekli olabilir. Son olarak, deneyimlerimizden toprak kazı kökleri çok ıslak değildir emin olmak önemlidir. Toprak su ile doygun Eğer sadece çalışmak zor bir durum değil ama çok da rizosferde tanımlamak ve toprak kökleri kaldırmak için zordur.
Erken bu yöntemlerin geliştirilmesi sırasında yapılan bir değişiklik el ile çalışma alanı ve daha kolaylaştırmak için bir gaz jeneratör tarafından desteklenmektedir vortexers için yükseltilmiş rizosferde serbest bırakmak için tüpler sallayarak yerine açısından standart yapıldı. zaman ve şekilde her tüpün tedirgin. Amplicon sıralama yaklaşım bir sınırlama sonuçları taksonomik çözünürlüğe genellikle sınırlıdır ve birçok OTUs aile veya cins düzeyinde bilinmeyen veya yalnızca bilinen olmasıdır. Özellikle sonuçları çözünürlüğü artırabilir veri analizi için yeni ve gelişmekte olan yaklaşımlar haberdar olmak önemlidir bu alanda araştırma hızla gelişmektedir.
Bu sadece eğitim için bakteri ve Arkeler, değil mantar kurallarıdır. Amplifikasyon için farklı astar kullanılması mantar toplulukları aynı DNA örnekleri27,28kullanarak çalışma için izin verir. Yöntemleri basitleştirilmiş olabilir çünkü bu yöntemler satın alma donanımları büyük miktarda gerektirmez. Yöntemleri tarif biz burada esas olarak "kim var orada" belirlemek için ama alanını hızlı bir şekilde av tüfeği sıralama yöntemlerle, yalıtım ve işlevselliğini test ele alınması işlevi hakkında önemli soru sormayı içine gelişmektedir mikroplar veya sıralama bütün mikrobiyal genleri.
Temsilcisi sonuçları açıklanan yöntemleri kullanarak tanımlanan mikrobiyal topluluklar farklılıkları vurgulayın. Veri Analizi22bir beta-çeşitlilik yaklaşım kullanarak, kompozisyon farklılıklar arasında örnek türleri gösterilmiştir. Bu fark açıkça gözlemlenmiştir nerede endosphere, rizosferde ve toprak benzersiz mikrobiyal topluluklar3içeren diğer çoğu çalışmalarda. Shannon çeşitlilik Dizin bereket ve sakin endosphere, rizosferde ve toprak her bitki türü içinde mevcut mikrobiyal türlerin belirlemek için hesaplanır. Bu çalışma ve diğerleri gösterildiği gibi alfa çeşitlilik biraz rizosferde azalan ve sonra önemli ölçüde azalan içinde endosphere3,5,29topraktaki yüksek olur. Bu sonuçlar yöntem tanımlamak burada endosphere, rizosferde ve toprak kompozisyon değişiklikleri tanımlamak için uygun olduğunu gösteriyor.
Proteobakteriler hakimiyeti endosphere ve toprak30,31,32üzerinde çalışmalarda ortak bir bulgudur. Endosphere genel olarak daha düşük bir mikrobiyal türlerin çeşitliliğinin bakteridaha yüksek bir göreli bereket ile vardır. Bu tekrar sonuçları buraya diğer bulgular literatür temsilcisi olduğunu vurgular. Bu çalışmada tedavisinin etkileri önemli ölçüde farklı değildi ve bu iki önemli nedeni olabilir tedaviler tarafından dayatılan farklılıkları algılamak için yeterli varyasyon oluşturmak için yeterince büyük değildi ve bu örnekleme sonunda yapıldı Sezon ne zaman alanları olan ne sezon sonunda ölçüldü benzer seviyelere azot çekmek için yeterli zaman vardı olabilir, büyüyen. Daha uzun bir süre boyunca benzer fertilizasyon oranları kullanarak başka bir çalışmada sadece nispeten küçük değişiklikler microbiome bileşiminde ölçülen33edildi. Diğer çalışmalar değişiklikler nedeniyle Azot Gübre34,35mantar ve bakteri topluluklarda göstermiştir.
Onların microbiomes3,32,36 belirlenmesinde rol oynamak için bilinen bitki türleri ve farklı bitki genotip içinde arasında gösterdi mikrobiyal topluluk varyasyon bile küçük farklılıklar bir tek tür37. Bu çalışmada, mikrobiyal topluluk kompozisyon önemli bir fark bitki türleri arasında bulundu. Tüm örnek türlerinde göründüğü en farklı mikrobiyal kompozisyon switchgrass vardı ama türler arasındaki farklar sadece içinde endosphere istatistiksel olarak anlamlı değildi. Rizosferde topluluk kompozisyon daha fazla çoğaltır çözümlemesi için kullanılabilir Eğer önemli hale gelebilir.
Kombine alan, laboratuvar ve analitik protokoller burada açıklanan ne kadar farklı faktörler etkisi çalışmak için güçlü bir yöntem mikrobiyal topluluklarda toprak, rizosferde ve kökleri36endosphere bileşimi sağlar. Büyük bir microbiomes, özellikle tarım alanlarındaki eğitim alanında yapılması gereken işler var. Nasıl verimleri toprak microbiome tarafından değiştirilmiş hakkında önemli sorular henüz tam aydınlatılmamıştır gerekiyor. Nasıl ürün rotasyonu etkisi toprak microbiome, nasıl microbiome zamanlama değiştirir, nasıl abiyotik stres ile ilgili bile en temel soru değiştirir microbiome microbiome değiştirmek için bu faktörler ile toprak tipi etkileşir nasıl ve olup olmadığını bazı bitkileri veya bölgelerde ABD'nin evrensel mikroplar tüm açık sorular vardır. Bu yöntemler aynı zamanda varlığı ve sebat yararlı ve patojenik bakterilerin tanımlamak epidemiyolojik çalışmalar için faydalı olacaktır. Başka bir gelecek horizon bu yöntemler için DNA yöntem tanımlamak burada bitki ve mikrop RNA ve metaboliti veri ile entegre başlatmak için olacak. Ek iyileştirme ve daha fazla değişkenlerinin test bu protokollerin duruma getirilmesi için daha da önemli olacaktır.

Microbiome araştırma anlama ve besin bisiklet, organik madde devir oranı ve geliştirme veya toprak patojenleri1,2inhibisyonu gibi ekosistem süreçleri değiştirmek için önemli sonuçları vardır. Bu alanda araştırma da toprak mikroplar doğal bitki toplulukları ve agroecosystems verimliliği üzerine etkileri anlamak için büyük bir potansiyele sahiptir. Doğal ekosistemler toprak microbiome odaklı olması birçok çalışma olmakla birlikte, daha az sayıda bitki rizosferde ve endosphere mikroplar agroecosystems3üzerinde odaklanmıştır. Nebraska'da, tarım tarım önemli bitkileri araştırma için hayati bir konu nerede yetişir bu topraklar çalışmaları yapma devletin büyük parçalar arasında manzara hakim. Bu yöntemleri kağıt amacı araştırmacılar agroecosystems içinde mevcut mikroplar nasıl bitki kökleri mikrobiyal topluluklar rizosferde ve endosphere ve sonunda değiştirmek belirlemek için açıklamak için iletişim kuralları standart kümesi sağlamaktır Bu mikropların toprak sağlık ve bitki verimlilik oynamak işlevleri anlamak.
Burada sunulan Yöntem biraz diğerleri bu kağıt hangi mikrop öğrenme hedefleniyor4,5 ' te yalnızca iç kök ve nasıl onlar mikrop hemen dışında kök dizininde farklı tarafından kullanılan yöntemleri farklıdır rizosferde. Bu çalışmada kullanılan amplicon sıralama DNA örneğinde buldu mikrobiyal özellikleri tanımlar ve müfettişler nasıl topluluklar örnek türü veya tedavi bağlı olarak değiştiğini belirlemek izin verir. Bu iletişim kuralı ve Lundberg vd tarafından kullanılan bir çok benzer iletişim kuralı arasındaki önemli farklar biri 6 sonication yerine, bu iletişim kuralını yüzey sterilizasyon çamaşır suyu ve etanol ile rizosferde kökleri kaldırmak için kullanmasıdır. Diğerleri de etkili bir şekilde yüzey sterilizasyon kullandık7,8,9,10. Bu yöntemler biraz farklı ama diğer yöntemlere göre daha avantajlı değildir. Yeterli sayıda kişi ile endosphere, rizosferde ve toprak bölümlenmiş seçtiğinizde yaklaşık 450 örnekleri kadar ekler günlük 150'den fazla alan araziler işlemek mümkündür çünkü bu yöntemler özellikle de büyük sahada yapılan deneyler için uygundur. Bu el yazması alanında örnek, laboratuvar malzeme işlemek, hulâsa ve DNA dizisi için kullanılan yöntemleri ayrıntılı olarak açıklar ve sonuç sıralama verileri çözümlemek için adımları kısa bir genel bakış sağlar.

<table><tbody><tr><td>Dneasy PowerSoil HTP 96 Kiti</td><td>Qiagen/MoBio</td><td>12955-4</td><td>Toprak ve rizosfer için ekstraksiyon kiti</td></tr><tr><td>Dneasy PowerPlant HTP 96 Kiti</td><td>Qiagen/MoBio</td><td>13496-4</td><td>Kökler için ekstraksiyon kiti</td></tr><tr><td>D-Saplı Kazma küreği, 101 cm L</td><td>Fiskars</td><td>9669</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Yeke, 40 cm L</td><td>Truper</td><td>34316</td><td></td></tr><tr><td>Ziploc Torbalar, 17,7 cm x 19,5 cm</td><td>Ziploc</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Soğutucu</td><td>Herhangi bir</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Yıkama tavası</td><td>Herhangi bir</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Plastik kova</td><td>Herhangi bir</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Eldiven (iş ve laboratuvar)</td> <td>Herhangi bir</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>20 cm çap Toprak elek #8, 2360 & mu; m ağ boyutu</td><td>Dual Manufacturing Co., Chicago IL</td><td>US8-8FS</td><td></td></tr><tr><td>20 cm çap Toprak Elek # 4, 4750 & mu; m ağ boyutu</td><td>Dual Manufacturing Co., Chicago IL</td><td>US8-4FS</td><td></td></tr><tr><td>taşınabilir jeneratör</td><td>Honda markası iyi çalışıyor</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Steril hücre süzgeçleri 100 & mu; m ağ boyutu</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; H2O</td><td>VWR</td><td>0823</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>VWR</td><td>0404</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Lehman Seeds</td><td>VIS-30</td><td>Yüzey Aktif Madde</td></tr><tr><td>Otoklavları</td><td>Herhangi bir</td><td>NA</td><td></td></tr> kurutma <tr><td>fırını</td><td>Herhangi bir</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ölçeği</td><td>herhangi bir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ağartıcı</td><td>CLOROX - ev gücü</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Herhangi bir</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı Nitrojen</td><td>Herhangi bir</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Kuru Buz peletleri</td><td>Herhangi bir</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Herhangi bir</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>11 cm hassas ince uçlu cımbız</td><td>Fisher</td><td>17456209</td><td></td></tr><tr><td>18 cm Düz nokta numune forseps</td><td>VWR</td><td>82027-436</td><td></td></tr><tr><td>13,5 cm Budama Makası</td><td>Fiskars</td><td>9921</td><td></td></tr><tr><td>2 mL tüp</td><td>Herhangi bir</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>15 mL PP konik boru</td><td>MIDSCI</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>50 mL PP konik boru</td><td>MIDSCI</td><td>C50B</td><td></td></tr><tr><td>Ultra saf su</td><td>Millipore-sigma</td><td>Milli-Q Integral, Q-POD</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 florometre</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Test Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>Çıkarılan örneklerin DNA miktar tayini için</td></tr><tr><td>QuantiFluor dsDNA Sistemi</td><td>Promega</td><td>E2670</td><td>DNA miktar tayini için</td></tr><tr><td>Şeffaf Düz Tabanlı Plakalı 96 Kuyulu Siyah</td><td>Corning</td><td>3631</td><td></td></tr><tr><td>pPNA PCR Engelleyici</td><td>PNA Bio</td><td>PP01-50</td><td></td></tr><tr><td>mPNA PCR Engelleyici</td><td>PNA Bio</td><td>MP01-50</td><td></td></tr><tr><td>Mikrobiyal Mock Community B'den Genomik DNA (Hatta Düşük Konsantrasyonlu) v5.1L, 16s rRNA Gen dizilimi için</td><td>BEI Kaynakları</td><td>HM782D</td><td></td></tr><tr><td>Yapıştırıcı Plakalar için 8 kuyulu şerit</td><td>VWR</td><td>89134-434</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz çelik boncuklar, 3,2 mm çap</td><td>Sonraki İlerleme</td><td>SSB32</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Test bloğu (Qiagen / MoBio Dneasy için DNA ekstraksiyon plakası PowerPlant HTP Kiti)</td><td>CoStar</td><td>3959</td><td></td></tr><tr><td>antistatik PP tartım hunisi, toprak/rizosfer için küçük boyut</td><td>TWD Tradewinds, INC</td><td>ASWF1SPK</td><td></td></tr><tr><td>antistatik PP tartım hunisi, kök/yaprak TWD</td><td>Tradewinds, INC</td> için x-küçük boyut <td>ASWFXSCS</td><td></td></tr><tr><td>Genie 2 Digital Vortex</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tüpler</td> <td>için vorteks adaptörüBilimsel Endüstriler</td><td>SI-H506</td><td></td></tr><tr><td>Havan (100 mL) ve havaneli</td><td>Herhangi bir</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Metal mikro spatula</td><td>VWR</td><td>80071-672</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık antistatik mikro spatulalar</td><td>VWR</td><td>231-0106</td><td></td></tr><tr><td>Kahverengi Kağıt torba 2 # (10.95 cm x 6.19 cm x 20 cm)</td> <td>Duro</td><td>18402</td><td></td></tr><tr><td>5424 2 mL tüp için</td> santrifüj <td>Eppendorf</td><td>22620461</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka için santrifüj</td><td>Sigma4-16S</td><td>81510</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tüpler için santrifüj rotoru</td><td>Sigma4-16S</td><td>12269 - Biosafe</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi DNA polimeraz</td><td>Kapa Biosystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

yalıtım ve mikrobiyal topluluklarda toprak, rizosferde ve kökleri çok yıllık çim deneylerde analizi

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Bitki ve toprak microbiome çalışmalar rolleri mikroorganizmaların tarımsal verimlilik oynamak anlamak için giderek daha önemli hale gelmektedir. Bu yazının amacı hızla toprak, rizosferde ve endosphere çoğaltılmış alan çalışmaların örnek ve örnek türü, tedavi ve bitki genotip nedeniyle mikrobiyal toplumlarda ortaya çıkabilecek değişiklikleri analiz konusunda ayrıntı sağlamaktır. Bu yöntemleri göstermek için kullanılan deney ve çoğaltılmış alan araziler iki, saf, içeren sıcak-sezon çimenler oluşur (Panicum virgatum ve Andropogon gerardii) ve düşük-çeşitlilik ot karışımı (A. gerardii, Sorghastrum nutans, ve Bouteloua curtipendula). Kısaca, bitkiler kazılan, kökleri çeşitli kesmek ve fosfat tampona yerleştirildikten ve rizosferde toplamak için sarsıldı. Kökleri buz ve çamaşır suyu ve etanol (alkol) ile sterilize yüzey üzerinde Laboratuvar götürülür. Rizosferde filtre ve Santrifüjü tarafından yoğunlaşmıştır. Kök topu çevresinde kazılan topraktan plastik torbalar içine yerleştirilir ve laboratuara toprak az miktarda DNA çekimi için nerelere getirdi. DNA kökleri, toprak ve rizosferde çıkarılan ve V4 bölge 16S rRNA gen için astar ile güçlendirilmiş. Amplicons sıralı sonra açık erişim Biyoinformatik araçları ile analiz. Bu yöntemler araştırmacılar nasıl mikrobiyal topluluk çeşitlilik ve kompozisyon örnek türü nedeniyle, tedavi, değişeceğini test etmek izin ve genotip bitki. İstatistiksel modeller yanı sıra bu yöntemleri kullanarak, temsilcisi sonuçları kökleri, rizosferde ve toprak mikrobiyal toplumlarda önemli farklılıklar göstermektedir. Burada sunulan yöntemleri alan örnekler toplamak, ayırma, ayıklamak, ölçmek, yükseltmek ve DNA dizisi adımlar komple bir kümesini sağlar ve mikrobiyal topluluk çeşitlilik ve çoğaltılmış alan denemeler bileşiminde analiz.

Mead yakınındaki Nebraska Üniversitesi Lincoln Tarım Araştırma Bölümü çiftliğinde 2012 yılında kurulan bir alan site temsilcisi sonuçları bu el yazması sunulan geliyorsun, ne önceden deneme, site için bir Mısır-soya dönme başarmıştı . Çalışma sitesi üç farklı topraklar üzerinde bulunan, ancak tüm değişiklikleri ölçülen toprak özellikleri'nde uygulanan tedaviler nedeniyle sanki verileri analiz edildi.
Alan site iki saf bulunan, switchgrass (P. virgatum cv Liberty) ve büyük bluestem (A. gerardii) yanı sıra büyük bluestem, indiangrass (S. nutans) ve 'Butte' sideoats grama () içeren bir düşük-çeşitlilik ot karışımı standları B. curtipendula). Üç sıcak-sezon çim araziler üç kez çoğaltılan bir randomize tam blok tasarımında vardı. Üç farklı çim araziler iç içe olduğunu 56 (N1) ve 112 (N2) kg N ha iki azot (N) döllenme tedaviler-1 uygulamalı üre vardı. Microbiome örnekleme büyüme mevsimi sonunda zaman bulunan toprak 8.0 ± 1.1 (ortalama ± SD) ppm nitrat parsellerde 112 kg N ha-1 ve 6.8 ± 0.7 (ortalama + SD) döllenmiş ppm nitrat parsellerde döllenmiş 56 kg N ha-1. Araziler yılda bir döllenmiş. Araziler ana araziler (8000 m2) ve N tedaviler belirlenmiş sıcak-sezon çim bölünmüş araziler (4000 m2) olduğunu. Büyük bluestem 'Bonanza' ve 'Altın madeni' bir 50: 50 karışımı tohumlari ve Indiangrass bir 50: 50 karışımı 'Keşif' ve 'Savaşçı' seçilir. Araziler 2012 yılında dikilmiştir ve 2013 ilkbaharında ilk N uygulama oluştu.
Toprak ve Kök örnekleme 15 Eylül 2014 gerçekleştirilmiştir. Aşağıda açıklanan çalışmaları üç çoğaltır (Şekil 1) ile split-Arsa randomize tasarım olarak ayarlanan bir alanda gerçekleştirilmiştir. Tüm örnekleri için endosphere aşağıdaki gibi ortalama sıralama derinliği: 4871 ± 5711 (ortalama ± SD), rizosferde: 40726 ± 14684, toprak: 38184 ± 9043. Açıklanan, yöntemleri kullanarak bu deneyler varyasyon büyük kaynaklarından biri olan mikrobiyal toplumlarda örnek türleri (Şekil 2) arasında bulunan farktır. Temsilcisi bu veri kümesinde, rizosferde ve toprak birbirlerine bileşiminde endosphere (Şekil 2A) daha fazla benzer görünüyor. Ancak, ayrıca vardı son derece önemli (p = 0.001) mikrobiyal topluluk kompozisyon rizosferde ve toprak (Şekil 2B) arasındaki farkları. Örnek türüne göre analiz bu deneyler için muhasebesi toplam değişim % 26 oldu.
Alfa çeşitlilik Analizi endosphere mikrobiyal topluluklarda örnek çeşitlilik toprak ve rizosferde (Şekil 3) ile karşılaştırıldığında daha düşük olduğunu gösterdi. Büyük bluestem endosphere örnekleri ve anlamlı olarak daha yüksek mikrobiyal tür çeşitliliği (Şekil 3) olan switchgrass ile switchgrass arasında herhangi bir yerde çim türler arasında çeşitlilik tek önemli farklılıklar vardı. Göreli bereket analiz (Şekil 4) tüm örnek türlerinde evvel tarafından takip Proteobakteriler hakimiyeti vurgulamaktadır. Endosphere Bacteriodetesdaha büyük bir göreli bolluk vardı, ancak toprak ve rizosferde Ayrıca Acidobacteria ve Chloroflexi hakim.
Bu deneyde, bitkiler N gübre iki farklı tutarlarla yetiştirilmiştir ve bu nedenle tedavisinin etkileri olduğunu olup olmadığını belirlemek için veri analiz. Tedavisinin etkileri toplam değişim % 12'si için oluşturuyor ama yılında koordinasyon iki tedavileri farklı (Şekil 5) bak rağmen önemli ölçüde farklı değildi. Bu istatistiksel analizler bu veri kümeleri yerine görsel muayene veya nitel kararlar için önemini vurgular.
Microbiome bitki doku ve toprak bitki etkisinde farklılıkları koordinasyon kısıtlanmış bir yöntemini kullanarak görüntülenir. İstatistiksel farklar önemli ölçüde farklı mikrobiyal topluluk kompozisyon örnekleri arasında örneğin, belirli değişkenler neden olup olmadığını sınamak için bir PERMANOVA analizi kullanılarak belirlenmiştir. Ne zaman tüm örnek türleri birlikte analiz edildi, mikrobiyal topluluk kompozisyon bitki türleri (Şekil 6) nedeniyle son derece önemli bir fark bulundu. Bu deneyde, bitki türleri tarafından sorumluydu değişim miktarı % 6.7 oldu. Son olarak, her örnek türü tek tek hangi örnek türleri önemli bitki tür etkisi sürüş belirlemek için analiz edildi. Sadece endosphere içinde son derece önemli bir fark vardı (p = 0.001) farklı bitki türü (Şekil 7) mikrobiyal topluluk kompozisyonlar arasında. Diğer örnek türlerinde tür etkisi tek tek analiz zaman önemli değildi. Rizosferde (% 18) ve toprak (% 15) daha düşük ise endosphere türler nedeniyle yüzde değişim % 27'si oldu. Bu daha fazla doku türlerinin ayrı ayrı analiz önemini vurgular.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig1.jpg"> Şekil 1: deneysel alan tasarım örneği. Nebraska Üniversitesi Lincoln Doğu Nebraska araştırma ve uzantısı Center Mead, ne yanında yer alan sitenin nüsha randomize tam blok tasarımında gösteren deneysel alan tasarım Tam site açıklaması için sonuçlar bölümüne bakın. N1 olan en düşük (56 kg N ha-1 üre) ve N2 (112 kg N ha-1 üre) uygulanan yüksek azot oranıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig2.jpg"> Şekil 2: Beta çeşitlilik Analizi endosphere, rizosferde ve topraktan çok yıllık çim örnekleme 2014 yılında da dahil olmak üzere farklı örnek türleri mikrobiyal bileşiminde karşılaştırarak. Bray-Curtis dagilimini matris üretmek için QIIME1.9.1 içinde bir Python komut dosyası kullanılarak analizi yapılmıştır. Bray-Curtis dagilimini matris üzerinde göre asıl koordinatları analiz (PCoA) RStudio içinde görüntülenmiştir. PCoA1 ve PCoA2 göre PCoA analiz açıkladı ilk ve ikinci en büyük farkı gösterir. PERMANOVA istatistiksel analiz örnek türleri arasında önemini belirlemek için gerçekleştirilmiş ve p değeri sağ üst köşede gösterilir. Her sembolün rakamlarla her örnek için tüm mikrobiyal toplum temsil eder. (A) Endosphere, rizosferde ve toprak örnek türleri birlikte analiz edildi. Tüm 87 örnekleri örnek başına 486 sıralarını rarefied. (B) birlikte rizosferde ve toprak örnekleri analiz edildi. Tüm 59 örnekleri 8231 sıralarıyla rarefied. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig3.jpg"> Şekil 3: Alfa çeşitlilik Analizi her tür endosphere, rizosferde ve toprak için Shannon dizini kullanarak. Analiz QIIME1.9.1 içinde bir Python komut dosyası kullanılarak yapılmıştır. Rarefaction endosphere, rizosferde ve toprak örnek türleri sırasıyla her örnek için 486, 17154 ve 8231 serileri ile yapıldı. Kutuları gösterir 25 ve 75 testlerinde (birinci ve üçüncü Dörttebirlikler). Kutu içindeki yatay çizgi ortanca ve kırmızı gösterir artı ortalamasını gösterir. Bıyık göstermek 1.5 katından fazla interquartile aralığı düştü (hangi siyah noktalar gösterilir) aykırı hariç veri aralığını (n = 6 sideoats grama için nereye karıştırın dışında her örnek için n = 5). Endosphere tüm beş tür Shannon Dizin rizosferde ve toprak düşük. Non-parametrik Wilcoxon rank sum testi türler arasında önemini belirlemek için kullanılan ve yalnızca türler arasında önemli farklılıklar üstünde tepe-in belgili tanımlık boksör gösterildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig4.jpg"> Şekil 4: şube düzeyinde endosphere, rizosferde ve toprak göreli bereket. Örnekleri farklı örnekleri türleri arasında mikrobiyal kültürlenebilen bolluk karşılaştırmak için analiz (n = 29 her örnek türü için). Analiz OTU tablosundan QIIME1.9.1 içinde bir Python komut dosyası kullanılarak yapılmıştır. Pasta grafiği içinde farklı renkler kültürlenebilen göstermek. Her şube her örnek türü göreli bolluk yüzdesini gösterir. Şube bilgileri ribozomal veritabanı projesi Sınıflandırıcısı (RDP)25kullanarak açıklama. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig5.jpg"> Şekil 5: tedavi tüm örnek türleri arasında kısıtlayan faktör analizi. Asıl koordinatları (CAP) analiz kurallı analiz mikrobiyal topluluk kompozisyon tedaviler arasında farklılıklar olduğunu olup olmadığını belirlemek için gerçekleştirildi. Her N tedavisi, n için 42 için N1 = (56 kg N ha-1) ve n = 45 için N2 (112 kg N ha-1). Bray-Curtis dagilimini matris içinde QIIME1.9.1 bir python komut dosyası kullanarak oluşturulmuştur. Bray-Curtis dagilimini matris üzerinde dayalı CAP analiz faktör RStudio olarak tedavi sınırlama tarafından yapıldı. PERMANOVA analiz tedavi farklılıklar anlamlıdır p değeri sağ üst köşede gösterilir olup olmadığını belirlemek için gerçekleştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig6.jpg"> Şekil 6: bitki türleri tüm örnek türleri arasında kısıtlayan faktör analizi. Analiz mikrobiyal topluluk kompozisyon tüm örnek türlerinde bitki türleri arasında farklılıklar olduğunu olup olmadığını belirlemek için yapılmıştır. Asıl koordinatları koordinasyon ve her türlü örnek (endosphere, rizosferde ve toprak) CAP analiz yapılan bir Bray-Curtis dagilimini matrisi kullanarak. Bray-Curtis dagilimini matris QIIME1.9.1 içinde Python komut dosyası kullanılarak oluşturuldu. Bray-Curtis dagilimini matris üzerinde dayalı CAP analiz faktör olarak RStudio bitki türleri sınırlama tarafından yapıldı. PERMANOVA istatistiksel analiz bitki türleri arasında önemini belirlemek için gerçekleştirilmiş ve P değeri sağ üst köşede gösterilir. Her sembolün rakamlarla bu örnek için tüm mikrobiyal toplum temsil eder. n = n dışındaki tüm örnek türleri içinde her tür için 18 = 15 sideoats grama karışımı için. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig7.jpg"> Şekil 7: türler kısıtlayan faktör olarak her örnek türü için ayrı ayrı kap analizi örneği. Asıl koordinat koordinasyon ve her örnek türü (endosphere, rizosferde ve toprak) CAP Analizi Bray-Curtis dagilimini matrisi kullanarak. Her örnek türü 486, 17154 ve endosphere, rizosferde ve toprak içinde sırasıyla örnek başına 8231 okuma rarefied. Türler faktör olarak koordinasyon sınırlamak için kullanıldı. PERMANOVA istatistiksel analiz her örnek türü bitki türleri arasında önemini belirlemek için gerçekleştirilmiş ve p değeri sağ üst köşede gösterilir. Her sembolün şekildeki her örnek için tüm mikrobiyal toplum temsil eder. Örnek boyutudur n 29 için her örnek türü, n = = 6 sideoats grama mix hariç her örnek türü her bitki türü için (n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Kazı alanından bitki köklerinin yanı sıra endosphere, rizosferde ve toprak içine örnekleri işleme DNA ekstraksiyon ve veri analiz yöntemleri de dahil olmak üzere ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu kağıt bu teknikleri toprak, endosphere ve rizosferde microbiomes çalışma için kullanmak diğer laboratuvarlar sağlamak için tasarlanmıştır.

Yalıtım ve mikrobiyal topluluklarda toprak, rizosferde ve kökleri çok yıllık çim deneylerde Analizi

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Bu yöntem, mikrobiyal topluluk çeşitliliğinin numune tipine, tedaviye ve bitki genotipine yanıt olarak nasıl değiştiği gibi toprak, rizosfer ve kök endosfer mikrobiyom alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, büyük numune sayıları ve çoğaltma gerektiren saha deneyleri için çok uygun olmasıdır. Prosedürü göstermek ben ve laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi ve araştırma teknisyeni olan Stephanie Futrell olacak.Protokole başlamak için, bir yıkama tavasını ve kovayı bitki numunesi ayrıntılarını içeren yapışkan bir notla etiketleyin. Etiketli kovayı arsaya taşıyın ve yıkama kabını sahada kurulu iş istasyonunda bırakın. Arsa içindeki farklı alanlardan arsa başına rastgele iki bitki seçin ve toplayın.Daha sonra, bitkiyi toprakta tutan yan köklerden herhangi birini kesmek için toprağı bir kürekle 30 santimetre derinliğe kadar delin. Küreği kullanarak bitki köklerini kazın ve kök topunu etiketli kovaya yerleştirin. Kovayı sahadaki iş istasyonuna geri getirin.Kökleri sallayın ve köklerden toprağı çıkarmak için bir kürek veya el tipi yeke kullanın. Eldiven giyin ve kökleri işleme istasyonunun yanına yerleştirin. Kökleri salladıktan sonra, toprağı yıkama tavasında karıştırın ve el tipi bir yeke ile toprak parçalarını parçalayın.Etiketli, 17,7 x 19,5 santimetre fermuarlı bir saklama torbasına kalıntı içermeyen bir toprak örneği koyun ve buzun üzerine yerleştirin. Budama makasını% 70 etanol içinde sterilize edin. Bitki başına yaklaşık dört ila altı kök ve her bir kök yaklaşık dokuz ila 12 santimetre uzunluğunda olmak üzere çeşitli kökleri çıkarmak için steril makası kullanın.Eksize edilen kökleri, Silwet L-77 gibi bir yüzey aktif madde ile 35 mililitre otoklavlanmış fosfat tamponu içeren etiketli 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Rizosferi köklerin yüzeyinden serbest bırakmak için tüpleri iki dakika çalkalayın. Bir jeneratör ve girdap ile sallamayı iyileştirin.% 70 etanol içinde sterilize edilmiş forseps ile kökleri tüpten çıkarın, kısa bir süre kağıt havlu üzerine kurulayın ve yeni, etiketli, 50 mililitrelik bir tüpe koyun. Hem rizosferi içeren tüpü hem de kökleri içeren tüpü buzun üzerine yerleştirin. Tarlada toplanan köklerin bulunduğu 50 mililitrelik tüplere yaklaşık 35 mililitre %50 çamaşır suyu artı %0,01 Tween 20 ekleyin.Tüpleri 30 ila 60 saniye boyunca girdaplayın veya sallayın. Ağartıcıyı dökün, 35 mililitre% 70 etanol ekleyin ve kökleri 30 ila 60 saniye daha girdaplayın veya sallayın. Çalkaladıktan sonra,% 70 etanolü dökün ve 35 mililitre steril, ultra saf su ekleyin ve numuneyi bir dakika boyunca sallayın veya sallayın.Suyla durulama adımını iki kez daha tekrarlayın, böylece kök steril, ultra saf su ile toplam üç durulama alır. Kökleri kuru, temiz kağıt havluların üzerine kurulayın ve her numune için temiz bir kağıt havlu kullanın. Steril forseps ve budama makası kullanarak, kökleri yaklaşık beş milimetrelik parçalar halinde kesin ve kesilmiş kökleri temiz, etiketli, 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin, ardından numuneleri daha fazla işlenene kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.Tüm numuneyi yeniden askıya almak için rizosfer numuneleri içeren 50 mililitrelik tüpleri sahadan 20 ila 30 saniye çalkalayın. Steril, 100 mikronluk bir ağ hücre süzgeci kullanarak, yeniden askıya alınmış numuneyi 50 mililitrelik yeni bir tüpe süzün. Daha sonra, tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 3.000 kez g'de santrifüjleyin.Hemen dökün ve süpernatanı atın. Rizosfer peletlerini buz üzerindeki 50 mililitrelik tüplere yerleştirin. Ardından, rizosfer peletlerine yüzey aktif madde içermeyen 1,5 mililitre steril fosfat tamponu ekleyin ve numuneyi yeniden askıya almak için bunları girdaplayın.Asılı sıvıyı temiz, etiketli, iki mililitrelik bir mikrofüj tüpüne pipetleyin. Tüpleri oda sıcaklığında iki dakika boyunca 15.871 kez g'de döndürün. Hemen süpernatanı dökün ve tüpleri temiz kağıt havluların üzerine boşaltın.Peletleri daha fazla işlenene kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Steril bir metal spatula kullanarak, DNA ekstraksiyonu için temiz, etiketli, iki mililitrelik bir tüpü yaklaşık üç gram toprakla doldurun ve küçük kök parçalarından ve döküntülerden kaçının. Metal spatulayı her numune arasında% 70 etanol içinde durulayın.Bu toprak örneğini eksi 20 santigrat derecede saklayın. Temiz bir yıkama tavasında, daha büyük elek daha küçük eleğin üzerinde olacak şekilde toprak torbasını istiflenmiş eleklere boşaltın ve toprağı her iki elekten de manuel olarak eleyin. Numuneler arasındaki elekleri dikkatlice temizlemek için bir fırça kullanın.Gelecekteki toprak fizikokimyasal ve doku analizi için 17,7 x 19,5 santimetre fermuarlı bir torbada 100 ila 125 gram elenmiş toprağı bir kenara koyun. Kısa süreli depolama için toprak torbalarını dört santigrat dereceye yerleştirin. Daha sonra, sıvı nitrojeni temiz bir spatula ile plastik bir behere ve temiz bir harç içine dökün.Donmuş dokuyu harcın içine koyun ve havaneli ile ince bir toz haline getirin. Numuneleri donmuş halde tutmak için öğütme boyunca sürekli olarak sıvı nitrojen ekleyin. Öğütülmüş dokuyu temiz, etiketli, iki mililitrelik bir tüpe aktarmak için bir spatula kullanın ve ardından dokuyu eksi 80 santigrat derecede saklayın.Çalışma alanını %70 etanol ve %1 ev tipi çamaşır suyu ile silin. Toprak örneklerini eksi 20 santigrat derece depodan çıkarın ve bir buz kovasında çözdürün. Sızdırmazlık matı kapağını 96 oyuklu bir ekstraksiyon plakasından çıkarın ve kullanılmadığı zamanlarda temiz tutmak için kapağı iki kağıt mendil arasına yerleştirin.Kontaminasyonu önlemek için plakanın 12 sütununu yapışkan 8 kuyulu PCR şeritleri ile örtün. Bir tartı üzerinde steril, küçük bir tartım hunisini daralayın ve 200 ila 250 miligram toprağı tartın. Yapışkan şeridi dikkatlice yukarı kaldırın, doldurulmuş tartım hunisinin boynunu uygun kuyuya yerleştirin ve toprak numunesini nazikçe uygun kuyuya yönlendirin.Kuyuyu kapatmak için yapışkan şeridi değiştirin. Her numune için yeni bir steril huni kullanarak bu işlemi her kuyucuk için tekrarlayın. Ekstraksiyon plakasındaki sızdırmazlık matı kapağını değiştirin ve plakayı DNA ekstraksiyonu için hazır olana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın.Rizosfer örneklerini eksi 20 santigrat derece depodan çıkarın ve bir buz kovasında çözdürün. DNA ekstraksiyon plakasını önceki bölümde yapıldığı gibi hazırlayın. Bir tartıya temiz bir kağıt mendil koyun, ardından tartıya steril bir metal spatula darasını alın.Bir numune tüpünden rizosfer peletinin bir kısmını dikkatlice çıkarmak için spatulayı kullanın. Rizosfer örneğinin 200 ila 250 miligramı arasında tartın. Ekstraksiyon plakasının ilk kuyusunu ortaya çıkarmak için yapışkan şeridi dikkatlice kaldırın.Doldurulmuş spatulayı kuyuya açı verin ve rizosfer malzemesini steril bir kürdan ile uygun kuyuya kazıyın. Metal spatulayı suyla durulayın, ardından numuneler arasında %70 etanol uygulayın. Son olarak, plaka dolana kadar plakanın her oyuğu için bu işlemi tekrarlayın ve ekstraksiyon boş kontrolü olarak bir kuyuyu boş bırakın.Bu temsili veri setinde, numune türleri arasında oldukça önemli farklılıklar vardı ve rizosfer ve toprak, bileşim olarak kökten daha benzer görünmektedir. Daha ileri analizler, rizosfer ve toprak arasındaki mikrobiyal topluluk bileşiminde de oldukça önemli farklılıklar olduğunu göstermektedir. Alfa çeşitlilik analizi, endosferdeki mikrobiyal toplulukların toprak ve rizosferdeki topluluklardan daha düşük olduğunu göstermektedir.Çim türleri arasındaki çeşitlilikteki tek önemli fark, büyük bluestem ve switchgrass'ın endosfer örnekleri arasındaydı. Bağıl bolluk analizi, tüm numune türlerinde Proteobakterilerin baskınlığını ve ardından Aktinobakterileri vurgulamaktadır. Toprak ve rizosfere Asidobakteriler ve Klorofleksi hakimdir, oysa kökler daha büyük bir nispi Bakteriyodet bolluğuna sahiptir.Tüm numune tiplerinin PERMANOVA analizi, bitki türlerine bağlı olarak mikrobiyal topluluk bileşiminde oldukça önemli bir farkı ortaya koymuştur. Bu videoyu izledikten sonra, toprak, endosfer ve rizosfer mikrobiyomlarının incelenmesinde kullanılacak bir dizi adımın nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu eğitim videosunun kısmen finanse edilmesi için Nebraska EPSCoR'a ve Ulusal Bilim Vakfı EPSCoR Araştırma Altyapısı Programı Track 1'e teşekkür ederiz.

isolation-analysis-microbial-communities-soil-rhizosphere-roots

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Biz predasyon riski artan stres taleplerini karşılamak için diyet değişiklikleri uyararak otobur yırtıcı kimyasal kalitesini değiştirebilir nasıl değerlendirmek için yöntemler sunmak, ve nasıl bu stresli otobur gelen karkasların ayrışma toprak mikroplar tarafından sonradan bitki çöp ayrıştırma yavaşlatır.

Predasyon Risk, Herbivore Fizyolojik Stres ve Bitki Çöp mikrobiyal bozunma Bağlama

Türler arada çevre heterojenitenin rolünü anlamak genellikle toplumun tür kompozisyonu için dışsal olan heterojen türleri üzerine odaklanmıştır. Biz bitki-toprak geribildirim klima, ya da toplum kompozisyon içsel heterojen tabi topraklar kullanarak toprak heterojen tedaviler oluşturmak için yeni ayrıntılı yöntemler sağlar.

Kurgulama Bitki kaynaklı Toprak Heterojen Deneysel Protokol

Makale, birçok numuneyle yapılan çalışmalarda toprak mikrobik topluluk yapısını belirlemek için hem toplam lipidlerin hem de gösterge lipidlerinin göreceli olarak bolluğunun karakterize edilmesinde kullanılmak üzere, mikroorganizmaların hücre membranlarından lipidlerin ekstraksiyonu için çaba ve doğruluğu denkleştirirken, verimliliği arttıran bir yöntemi açıklıyor.

Çok Örnekli Deneylerde Toprak Mikroplarını Karakterize Etmek İçin Bir Lipid Ekstraksiyon ve Analiz Metodu

Burada, toprak, rizosferde ve kök endosphere microbiomes amplicon sıra verileri elde etmek için bir protokol açıklayın. Bu bilgiler kompozisyon ve çeşitlilik bitki ilişkili mikrobiyal toplulukların araştırmak için kullanılan ve bitki türlerinin geniş bir kullanım için uygundur.

Kök Microbiome keşfetmek: toprak, rizosferde ve kök Endosphere bakteriyel topluluk verileri ayıklama

Burada bir hidroponik bitki büyüme tahlil türler varlığı ölçmek ve bitki kökleri ilk kolonizasyon ve farklı büyüme ortamları içine transfer edildikten sonra bakterilerin uzamsal dağılımı görselleştirmek için açıklanmaktadır.

Yüzen hidroponik sistemde Arabidopsis thaliana kökleri üzerinde bakteriyel kolonizasyon ve bakım izleme

Örnek bir tür olarak pirinç(Oryza sativa L.) kullanarak sulak alanlardan bozulmamış kökleri ve çevresindeki rizosfer toprağını örnekleme, koruma ve bölümleme protokolünü açıklıyoruz. Numune korunduktan sonra senkrotron X-ışını floresan (XRF) kimyasal spektrasyon görüntüleme gibi elementel görüntüleme teknikleri kullanılarak analiz edilebilir.

Elementel Görüntüleme için Sulak Alan Köklerini ve Rizosferleri Koruma Yöntemi

Glifosat bazlı ürünler (GBP), dünya çapında en yaygın geniş spektrumlu herbisitlerdir. Bu makalede, GBP'nin mikrobiyomlar üzerindeki etkisini ölçmek için saha deneylerinden biyoinformatik analizlere kadar genel kılavuzlar sunuyoruz.

Glifosat Bazlı Ürünlerin Mikrobiyomlar Üzerindeki Potansiyel Etkisinin Ölçülmesi

Entomopatojenik mantar kolonileri, Tenebrio yemi, Galleria yemi ve seçici yapay ortam, yani kloramfenikol, tiyabendazol ve sikloheksimid (CTC ortamı) ile desteklenmiş maya özü ile zenginleştirilmiş patates dekstroz agarı kullanılarak tropikal toprak örneklerinden izole edilir.

Entomopatojenik mantarları toprak örneklerinden izole etme yöntemlerinin karşılaştırılması

Bu protokol, bitki köklerini toprak kaynaklı mikroplarla aşılamak için stratejilerin ayrıntılı bir özetini sunar. Verticillium longisporum ve Verticillium dahliae mantarları için örneklendirilen üç farklı kök enfeksiyon sistemi tanımlanmıştır. Potansiyel uygulamalar ve olası aşağı akış analizleri vurgulanır ve her sistem için avantajlar veya dezavantajlar tartışılır.

Bitki Köklerini Toprak Kaynaklı Mikroorganizmalarla Enfekte Etmek için Aşılama Stratejileri

Çeşitli rizosfer topraklarından sinerjik çok türlü biyofilm toplulukları oluşturmak için hızlı ve standartlaştırılmış bir prosedür burada sunulmaktadır. Karmaşık rizosfer toprak mikrobiyotasını araştırmak ve simüle etmek için tasarlanmış benzersiz bir protokoldür.

Rizosfer Toprağından Çok Türlü Biyofilm Toplulukları Oluşturmaya Yönelik Bir Yaklaşım

Burada, bitki tarihi ve toprak tarihinin, bir bitki çeşitliliği gradyanı boyunca otlak topluluklarının ekosistem işleyişi üzerindeki bağımsız ve etkileşimli etkilerini incelemek için, yer üstünde ve altında kontrollü çevre koşullarına sahip karasal mezokozm odaları olan iDiv Ecotron'da kurulan bir çalışmayı sunuyoruz.

JenaTron - Bitki Tarihi ve Toprak Tarihinin Otlak Ekosisteminin İşleyişi Üzerindeki Etkilerini İncelemek İçin Deneysel Bir Yaklaşım

Öğrenin toprak, rizosfer ve kök endosfer örneklerinin yalıtımı ve analizi için standart protokolleri. Bu yöntem mikrobiyal topluluk çeşitliliğini incelemek ve saha deneylerinde tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kullanılır.

Yalıtım ve mikrobiyal topluluklarda toprak, rizosferde ve kökleri çok yıllık çim deneylerde Analizi

Daha fazla video keşfet