Kök Microbiome keşfetmek: toprak, rizosferde ve kök Endosphere bakteriyel topluluk verileri ayıklama

Bu deneyin genel amacı, 16S ribozomal RNA geninin topluluk profilini kullanarak kök mikrobiyomunun, toprağın, rizosferin ve kök endosferinin üç bölmesini karakterize etmektir. Bu yöntem, mikrobiyom yapısının önemli itici güçleri olan biyotik ve abiyotik faktörler gibi mikrobiyal ekolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kök ve rizosferin ayrılmasından DNA'nın çıkarılmasına ve bir dizileme kütüphanesi hazırlanmasına kadar her adımı standartlaştırmasıdır.

Bu prosedürü göstermek, Coleman-Derr Laboratuvarı'nda yüksek lisans öğrencisi olan Salı Simmons olacak. Protokole başlamak için, bitki köklerinden arınmış toprak elde etmek için etanol ile sterilize edilmiş bir toprak çekirdeği toplayıcı ile toplu toprak örnekleri toplayın. Bitkinin tabanından yaklaşık 23 ila 30 santimetre uzakta bir çekirdek toplayın.

Daha sonra, toprağı plastik bir torbaya aktarın, torbayı hafifçe sallayarak toprağı homojenize edin, toprak örneğinin 600 milikotunu iki mililitrelik bir tüpe aktarın ve iki mililitrelik tüpü hemen DNA ekstraksiyonuna kadar kuru buz üzerine yerleştirin. Kökü ve rizosferi toplamak için, bitkiyi kazmak için etanolle sterilize edilmiş bir kürek kullanın ve mümkün olduğunca fazla kök elde etmeye özen gösterin. Kök yüzeyine yapışan yaklaşık iki milimetre toprak kalana kadar köklerdeki fazla toprağı nazikçe silkeleyin.

Büyük bitkiler için, köklerin temsili bir alt bölümünü kesmek için steril makas kullanın ve 50 mililitrelik konik bir şişeye en az 500 miligram kök dokusu yerleştirin. Kökleri kaplayacak kadar epifit temizleme tamponu ekleyin, ardından numuneyi hemen kuru buzun üzerine yerleştirin. Rizosferi köklerden ayırmak için, kök örneğini buz üzerinde çözdürün, ardından kök örneklerini sonikleştirin.

Steril forseps kullanarak kökleri soğutulmuş, temiz 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Orijinal tüpü tampon ve toprakla birlikte atmayın. Bu, rizosfer fraksiyonunu içerir.

Ardından, tampon ve rizosfer içeren tüpü santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın ve rizosfer fraksiyonunu kuru buza yerleştirin. Kökleri yıkamak için kök fraksiyonuna yaklaşık 20 mililitre dört santigrat derece steril su ekleyin.

Kökü 15 ila 30 saniye kuvvetlice çalkalayarak yıkayın, ardından suyu boşaltın. 250 miligram toprak ve rizosferi, toprak ekstraksiyonu için ticari bir DNA izolasyon kitinde sağlanan ayrı toplama tüplerine hızlı bir şekilde aktarmak için steril bir spatula kullanın, ardından kit tedarikçisinin protokolünü kullanarak devam edin. Elüsyondan sonra, amplikon kütüphanesi hazırlığına devam etmeye hazır olana kadar DNA'yı eksi 20 santigrat derecede saklayın, ardından kök örneklerinden DNA'yı çıkarın.

Sterilize edilmiş bir harcı soğutun ve sıvı nitrojen kullanarak havaneli havan tokmağı. 600 ila 700 miligram kök dokusunu ölçün ve dokuyu harcın içine yerleştirin ve kökleri kaplayacak kadar sıvı nitrojeni dikkatlice ekleyin. Kökleri küçük parçalar halinde öğütün.

Kökler ince bir toz olana kadar sıvı nitrojen ekleme ve öğütme işlemine, numuneler arasında tutarlı olacak şekilde en az iki kez devam edin. Hızlı bir şekilde, kök tozu çözülmeye başlamadan önce, kök tozunu buz üzerinde önceden tartılmış 1,5 mililitrelik tüplere aktarmak için steril bir spatula kullanın. Tüpün ve tozun ağırlığını kaydedin.

150 miligram kök tozunu topraktan ekstraksiyon için tasarlanmış ticari DNA izolasyon kitinde sağlanan toplama tüpüne hızlı bir şekilde aktarmak için steril bir spatula kullanın, ardından kit tedarikçisinin protokolünü kullanarak DNA izolasyonuna devam edin. Her bir DNA örneğini üç kopya halinde çoğaltmak için yeterli PCR ana karışımı hazırlayın. Ana karışımı steril, 25 mililitrelik çok kanallı bir pipet haznesine dökün ve 66 delikli yeni bir 96 oyuklu PCR plakasının her bir oyuğuna 96 mikrolitre ana karışım dağıtın.

Daha sonra, normalleştirilmiş DNA plakasından ana karışım plakasına mikrolitre DNA başına altı mikrolitre beş nanogram ekleyin. Ardından, ana plakaya 1,5 mikrolitre 10 mikromolar ileri astar ekleyin, böylece her sütun farklı bir ileri barkoda sahip olacak şekilde ve her sıranın farklı bir ters barkodu olacak şekilde 1,5 mikrolitre 10 mikromolar ters astar ekleyin. Plakayı filmle örtün ve plakayı 3.000 RCF'de kısa bir süre döndürün.

İçeriği nazikçe karıştırmak için çok kanallı bir pipet kullanın, ardından bunları 25 mikrolitre reaksiyon karışımı ile üç plakaya bölün ve plakaları PCR filmi ile kaplayın. Bir termosiklayıcı kullanarak her plakadaki DNA'yı çoğaltın. Amplifikasyondan sonra, üç çoğaltma plakasını tek bir 96 oyuklu plakada birleştirin.

Bir bilgisayar elektronik tablosu kullanarak, her numunenin 100 nanogramlık hacmini ve tüm numuneler için ortalama hacmi hesaplayın. Her boş PCR ürünü için, hesaplanan ortalama hacmi tek bir 1,5 mililitrelik tüpe ekleyin. Başarılı bir şekilde çoğaltılmış numuneler için, her numunenin 100 nanogramını aynı tüpe koyun, daha sonra bir tezgah üstü florometre kullanarak havuzlanan ürünün konsantrasyonunu ölçün ve moleküler dereceli suda 600 nanogram DNA'yı 1.5 mililitrelik bir tüpte 100 mikrolitrelik bir nihai hacme kadar elüte edin.

Kalan havuzlanmış ürünü eksi 20 santigrat derecede saklayın. 600 nanogram DNA alikotunu saflaştırmadan önce, 600 mikrolitre taze %70 etanol hazırlayın. Paramanyetik boncuklar kullanarak kurulan PCR saflaştırma işlemini takip edin.

Dibe çöken boncukları yeniden askıya almak için manyetik boncuk tüpünü sallayın. 600 nanogramlık DNA alikotuna 1x hacim, 100 mikrolitre boncuk çözeltisi ekleyin. Solüsyonu ve boncukları 10 kez pipetleyerek iyice karıştırın.

İyice karıştırdıktan sonra, karışımı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Boncukları çözeltiden ayırmak için tüpü iki dakika boyunca veya çözelti berraklaşana kadar manyetik standın üzerine yerleştirin. Tüpü standda tutun, şeffaf süpernatanı manyetik boncuklara dokunmadan dikkatlice aspire edin ve atın.

Tüpü standda bırakın, tüpe 300 mikrolitre% 70 etanol ekleyin ve boncukları oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin. Etanolü aspire edin ve atın. Bu işlemi tekrarlayın ve ikinci yıkamadan sonra tüm etanolü çıkarın.

Tüpü manyetik standdan çıkarın ve içindekileri beş dakika havayla kurutun. Kurutulmuş boncuklara 30 mikrolitre moleküler dereceli su ekleyin ve 10 kez pipetleyerek karıştırın. Oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin.

Boncukları çözeltiden ayırmak için tüpü bir dakika manyetik standa geri koyun. Elüatı yeni bir tüpe aktarın. Bir tezgah üstü florometre kullanarak temizlenmiş, havuzlanmış DNA'nın nihai konsantrasyonunu ölçün.

Bir alikotu 30 mikrolitrelik bir son hacimde 10 nanomolar a veya dizileme tesisi tarafından tercih edilen konsantrasyon ve hacme seyreltin. Amplifikasyon adımını takiben, her bir numunenin bakteri topluluğu bileşimini belirlemek için dizileme yapıldı. İncelenen bitki konakçısı için PNA dizisinin her bir kloroplast ve mitokondriyal 16S ribozomal RNA genine hizalanması, herhangi bir uyumsuzluk ortaya çıkarmamalıdır.

13 baz çifti PNA dizisine tek bir uyumsuzluk, sağlanan kloroplast PNA dizisi ve Lactuca sativa veya marulun kloroplast 16S ribozomal RNA geninde olduğu gibi, etkinliği büyük ölçüde azaltabilir. Numune başına eşit miktarda amplifiye DNA bir araya getirildiğinden, dizilemeden sonra numune başına bakteri taksonlarıyla eşleşen çift sayıda okuma elde edildi ve barkodlu indekslerine göre sıralandı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık sekiz saat içinde sekiz bitki için yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, deneyler arasında tutarlı olmak önemlidir. DNA ekstraksiyon yöntemindeki ve PCR ana karışımındaki değişiklikler gibi küçük ayrıntılar önyargıya neden olabilir. Bu prosedürü takiben, hangi mikropların aktif olduğu ve hangi genleri ifade ettikleri gibi ek soruları yanıtlamak için metatranskriptomik gibi diğer yöntemler kullanılabilir.

Sıvı nitrojen ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun KKD giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.