Akut Ictal faaliyet kemirgen ve insan dokusu üretimi ve isteğe bağlı başlatma
19 Ocak 2019
Akut kriz modelleri epileptiform olaylar altında yatan mekanizmaları eğitim için önemlidir. Ayrıca, epileptiform olaylar üstünde-istek oluşturma yeteneği kendi başlatma altında yatan olay tam sırası çalışmaya son derece verimli bir yöntem sağlar. Burada, fare ve insan dokusu içinde kurulan akut 4-aminopyridine kortikal nöbet modelleri açıklar.
Bu yöntem, elektrografik nöbet başlangıcı ve sonlandırmadan hangi sinirsel alt popülasyonların sorumlu olduğu gibi nöbet mekanizmalarının incelenmesinde anahtar soruların yanıtlandırılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, elektrografik nöbet olaylarını, isteğe bağlı olarak ve klinik olarak gözlenenleri anımsatan in vivo ve in vitro modellerini yeniden üretebiliyor olmasıdır. Bu teknik aynı zamanda potansiyel nöbet önleyici tedavileri aramak için de kullanılabilir, farklı anti-nöbet ilaç adaylarının uygulanması sırasında elektrografik nöbet olayları tetiklemeye çalışarak.
Kortikal dilimleri hazırlamak için, preklinik beyin dokusunu anında yapışkan tutkal kullanarak Vibratome aşamasına yapıştırın. Specimin tutucuyu yavaşça tampon tepsiye yerleştirin. Beynin sırt kısmının Vibratom'un bıçağına baktığından emin ol.
Beyni 450 mikrometre kalınlığında keserek dorsal yönden ventral yöne doğru dilimleyin. Koku ampul kaldırmak için preklinik hayvan beyninde ilk kesim olun. Daha sonra, somatosensoriyel motor alan gözlenene kadar sonraki kesimyapmak.
Geniş bir pipet kullanın. Hedeflenen koronal dilimleri soğuk diseksiyon solüsyonu içeren Petrie kabına aktarın. Koronal dilimler için, neo kortikal komissür hemen altında bir enine kesim yapmak, ve sonra, hemisfer ayırmak için orta hatta kesilmiş.
Sonra, dilimler herhangi bir fazla doku kesmek için yeni bir jilet kullanın. Beyin dilimleme işlemini verimli bir şekilde yapmak çok önemlidir. Beyin dokusunun ACSF'ye batırılmadığını her an, kalitesine zarar verir.
Hasarlı, kalitesiz beyin dokusunun elektrografik nöbet olayları oluşturma olasılığı daha düşüktür. Koronal dilimlerin sırt kısmını, neo korteks içeren, bir an için 35 derece Santigrat ACSF ile dolu ikinci bir Petrie çanak aktarın. Daha sonra, dilimleri derhal 35 santigrat derece içeren bir kuluçka odasına aktarın.
Beyin dilimlerini 30 dakika boyunca 35 derecede kuluçka odasına daldırın. Daha sonra, su banyosundan kuluçka odasını çıkarın ve oda sıcaklığına geri dönmesine izin verin. Elektrofizyolojik kayıtları yapmadan önce beyin dilimlerinin iyileşmesi için bir saat bekleyin.
Bu işlemde, beyin dilimi biraz daha büyük lens kağıt kesip. Bir diş cızırtı kullanarak yerinde tutulan kesme lens kağıt üzerine bir beyin dilimi aktarmak için geniş delikli pipet veya ayrıntılı bir fırça kullanın. Daha sonra, bir beyin dilimi ile lens kağıdını kayıt odasına aktarın ve bir arp ekranıyla konuma sabitleyin.
Daha sonra, dakikada üç mililitre hızında 35 santigrat derece karbogenated ACSF ile kayıt odasında beyin dilimi bol. Kayıt odasının 33 ila 36 santigrat derece olduğundan emin olmak için dijital termometre kullanın. Daha sonra, bir Hamilton şırınga kullanarak, ACSF 10 mikrolitre ile cam elektrotlar backfill.
20 kez stereomikroskop altında, el manipülatörleri kullanarak yüzeysel kortikal tabaka, iki, üç içine kayıt cam elektrot kılavuzu. Standart yazılım ile beyin diliminin elektriksel aktivitesini görüntüleyin. Elektrografik nöbet benzeri aktiviteleri teşvik etmek için, 100 mikromolar 4-AP içeren ACSF ile beyin dilimi bol.
Standart yazılım ile beyin diliminin elektriksel aktivitesini görüntüleyin. Optogenetik farelerin beyin dilimlerinde optogenetik strateji kullanarak elektrografik nöbet benzeri olaylar oluşturmak için, kayıt bölgesinin hemen üzerinde 1.000 mikron kordon çapında optik fiber konumlandırmak için manuel bir manipülatör kullanın. Bir ictal olay başlatmak için mavi ışık kısa bir darbe uygulayın.
In vitro ve in vivo 4-AP nöbet modellerinde meydana gelen çeşitli epileptiform olayları tespit etmek ve sınıflandırmak için kullanıcı dostu Bir MATLAB tabanlı program özel olarak geliştirilmiştir. Bu algılama programı Valiante Labs GitHub deposundan edinilebilir. 100 mikromolar 4-AP uygulaması kaliteli 450 mikron boyutlu kortikal beyin dilimleri bir genç VGAT channelrhodopsin fare, güvenilir 15 dakika içinde tekrarlayan ictal benzeri olaylar indüklenen.
100 mikromolar 4-AP'nin kalitesiz dilimlere uygulanması, patlama olayları veya artış aktivitesi ile sonuçlandı. Ortalama olarak, her kesişen klinik öncesi beyinden dilimlerin %40'ı, ictal benzeri olayları başarıyla oluşturdu. Ayrıca, parçalanmış farelerin %83'ü en az bir beyin dilimi ile sonuçlandı ve bu da ictal benzeri olayları başarıyla oluşturdu.
Spontan olarak meydana gelen ictal benzeri olaylarla beyin dilimlerinde, beyin dilimine 30 milisaniyelik kısa bir ışık darbesi uygulanması, morfolojide özdeş olan ictal benzeri bir olayı güvenilir bir şekilde tetikledi. Aynı bulgular THY bir Channelrhodopsin iki fare beyin dilimleri yapıldı. Böylece, hangi nöronal alt popülasyon aktive edildi, izole kortikal nöral ağ herhangi bir kısa senkronizasyon olay, bir ictal benzeri olayın başlangıcına yol açtı.
Bu ictal benzeri olaylar bir nöbetçi başak, tonik gibi ateş, klonik gibi ateş ve sonuna doğru patlama benzeri aktivite oluşuyordu. Klinik nöbetlerle ilişkili elektrografik imzalara benzerlerdi. Bu prosedürü takiben, beyin durumu geçişleri gibi sorulara cevap vermek için beyin durumu geçişleri diğer türleri yapılabilir, beyin durumu geçişleri altında yatan nöro biyolojik mekanizmalar nelerdir?
Ve çeşitli patolojik beyin durumlarına girişi önlemek için bu geçişleri nasıl düzenleyebiliriz?
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, hem fare hem de insan kortikal dokularındaki epileptiform aktivitelerin mekanizmalarını incelemek amacıyla, özellikle 4-aminopiridin kullanılarak oluşturulan akut nöbet modellerine odaklanmaktadır. Elektrografik nöbet olaylarını talep üzerine tetikleyebilme yeteneği, nöbet başlangıcı ve sonlanmasıyla ilişkili nöronal davranışların ayrıntılı bir şekilde incelenmesine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Elektrofizyoloji
- Epilepsi araştırmaları
Arka Plan
- Nöbetlerin altında yatan mekanizmaları anlamak, etkili tedavilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir.
- Akut nöbet modelleri, nöbet dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesine olanak tanır.
- Elektrofizyolojik kayıtlar, nöbetlerin başlangıcı ve yayılımı hakkında bilgiler sunar.
- Teknik, nöbet karşıtı ilaçların test edilmesinde potansiyel uygulama alanlarına sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Nöbetlerin başlangıcı ve sonlanmasından sorumlu nöral alt popülasyonları araştırmak.
- Potansiyel nöbet karşıtı tedavilerin etkinliğini kontrollü bir şekilde değerlendirmek.
- Kortikal beyin dilimlerinde iktal benzeri olayların karakterizasyonunu incelemek.
Kullanılan Yöntemler
- Çalışmada, farelerden ve insan dokularından hazırlanan akut kortikal beyin kesitleri kullanılmıştır.
- 4-aminopiridin tarafından indüklenen nöbet benzeri aktiviteleri ölçmek için elektrofizyolojik kayıtlar gerçekleştirilmiştir.
- Doku canlılığını sağlamak amacıyla ayrıntılı kesit alma ve inkübasyon protokolleri uygulanmıştır.
- Hassas ışık stimülasyonu yoluyla iktal olayları tetiklemek için optogenetik stratejiler dahil edilmiştir.
- Epileptiform olayların saptanması ve sınıflandırılması için MATLAB tabanlı bir yazılım geliştirilmiştir.
Temel Sonuçlar
- Protokol, 4-AP uygulamasının ardından 15 dakika içinde yüksek kaliteli beyin kesitlerinde güvenilir bir şekilde iktal benzeri olaylar tetiklemiştir.
- Kesitlerin %40'ının bu olayları başarıyla oluşturduğu saptanmış olup, bu durum doku hazırlığının etkili olduğunu göstermiştir.
- Yanıtlar, karakteristik bir sentinel spike ve nöbet aktivitesine işaret eden çeşitli ateşleme fazlarını içermiştir.
- Farklı fare modellerinde benzer sonuçlar gözlemlenmiş, bu da tekniğin sağlamlığını ortaya koymuştur.
Sonuçlar
- Bu çalışma, epileptik nöbetlerin indüklenmesi ve incelenmesi için güvenilir bir yöntem sunarak epilepside yer alan nöronal mekanizmalara dair bilgiler sağlamaktadır.
- Bulgular, nöbet dinamiklerinin in vivo ve in vitro ortamlarında araştırılmasını desteklemektedir.
- Bu mekanizmaların anlaşılması, epilepsi ve ilgili diğer bozukluklar için daha iyi tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yol açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel İlgililiği
Akut kortikal modellerde elektro grafik nöbet olaylarının isteğe bağlı indüklenmesi, nöbet başlangıcının ve sonlanmasının temelindeki nöronal mekanizmaların hassas bir şekilde sorgulanmasına olanak tanır. Bu yetenek, tanımlanmış elektrofizyolojik fenotipler üzerinde nöbet karşıtı bileşik etkilerinin tekrarlanabilir ve kantitatif değerlendirmesini sağlayarak, epilepsi ilaç keşfinde hedef doğrulama ve mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler. Hem kemirgen hem de insan dokusuna uygulanabilir olması, terapötik hipotezlerin türler arası doğrulamasını kolaylaştırarak translasyonel uygunluğu artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Optogenetik veya farmakolojik tetikleme yoluyla, elektrografik nöbet başlangıcı ve sonlanmasından sorumlu spesifik nöral alt popülasyonların sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Spesifik nöronal yolların modüle edilmesinin iktal benzeri olayları önleyip önlemediğini veya değiştirip değiştirmediğini değerlendirmek için tekrarlanabilir bir platform sağlayarak hedef hipotez testlerini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Yüksek içerikli tarama için uygun, tanımlanmış morfolojiye (sentinel spike, tonik-klonik ateşleme, burst aktivitesi) sahip, nicelendirilebilir elektro grafik nöbet benzeri olaylar oluşturur.
- Operasyonel Değer: 4-AP, optogenetik impulslar veya nörotransmitter püskürtmeleri aracılığıyla iktal olayların standardize indüksiyonuna izin vererek laboratuvarlar arasında tutarlı bileşik testlerini mümkün kılar.
- Bilimsel Değer: Talep üzerine indüksiyon sırasında nöbet sıklığı, süresi veya elektro grafik özellikler üzerindeki etkilerini ölçerek nöbet karşıtı ilaç adaylarının değerlendirilmesini kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Terapötik etkinliğe yönelik öngörü güvenilirliğini artırmak amacıyla, klinik olarak ilgili iktal benzeri olaylar oluşturmak için insan kortikal dokusu kullanılır.
- Operasyonel Değer: İndüklenen olayların klinik elektrografik imzaları taklit ettiğini doğrulayarak, akut taramadan kronik epilepsi modellerine kadar sürekliliği destekler.
- Bilimsel Değer: Spesifik nöronal manipülasyonları nöbet dinamiklerindeki değişikliklerle ilişkilendirerek mekanistik risk azaltmaya olanak tanır ve preklinik ilerleme için hedef seçimine bilgi sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, optimize edilmiş öncü bileşiklerin belirlenmesinden önce hedef doğrulaması ve bileşik taraması için fizyolojik olarak ilgili bir analiz sağlayarak erken keşif iş akışlarına entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Kortikal ağlarda iktal olayların hassas ve isteğe bağlı indüksiyonu yoluyla, nöbet başlangıcının altında yatan nöronal mekanizmaların hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Deney standardizasyonu ve bileşik karşılaştırması için temel olan tekrarlanabilir, kantitatif elektrofizyolojik okumalar (olay sıklığı, morfoloji, süre) sağlar.
- Analitik: MATLAB tabanlı yazılım aracılığıyla epileptiform olayların tespitini ve sınıflandırılmasını sağlayarak, bileşiklerin nöbet dinamikleri üzerindeki etkilerini değerlendirmek için objektif metrikler sunar.
- Translasyonel Araştırma: Hastalıkla olan ilişkiyi sağlamak için insan dokusu kullanarak, keşif bulgularını preklinik ve klinik epilepsi araştırmalarına bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla proje ve terapötik modalite genelinde çeşitli nöbet önleyici mekanizmaları değerlendirmek için standardize edilmiş, ölçeklenebilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Nöronal nöbet oluşum ve yayılım mekanizmalarındaki belirsizliği azaltarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Kemirgen ve insan doku preparasyonlarında nöbet indükleme süreçlerinin tekrarlanabilirliğini ve ölçeklenebilirliğini geliştirerek çok merkezli tarama kampanyalarını destekler.
- Stratejik Değer: Anti-nöbet bileşiklerinin belirlenmiş elektrofizyolojik son noktalar üzerindeki etkilerinin hızlı ve kantitatif değerlendirmesine olanak tanıyarak devam/dur kararlarının verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Klinik olarak ilgili modellerde iktal benzeri olayları baskılama veya modifiye etme yeteneklerine göre bileşiklerin risk ayarlı önceliklendirilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Elektrofizyoloji, doku dilimleme ve optogenetik veya farmakolojik nöbet tetikleme tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Elektrofizyolojik kayıt, hassas sıvı perfüzyonu (örneğin 4-AP, ACSF) ve optik stimülasyon (optogenetik tetikleme için) için kullanılan cihazlara bağımlıdır.
- Doku kalitesi başarı oranlarını doğrudan etkilediğinden, dilim canlılığını ve tutarlı iktal olay üretimi sağlamak için standardize edilmiş doku hazırlama protokolleri gereklidir.
- Kemirgen ve insan doku modelleri arasında geçiş yaparken indüksiyon parametrelerinin (örneğin 4-AP konsantrasyonu, ışık darbesi süresi, nörotransmitter puff hacmi) adaptasyonu gerekir.
- Pratik sınırlamalar arasında dilim kalitesindeki değişkenlik ve hazırlama ile kayıt sırasında doku sağlığını korumak için yetkin bir kullanım ihtiyacı yer alır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Title
0:46
Preparation of Cortical Slices from the Somatosensory-motor Cortex
2:40
Electrophysiological Recordings of the Superficial Cortical Layer and Seizure Induction
4:43
Results: Acute In Vitro 4-AP Cortical Seizure Model and Ictal Events Generated by Optogenetics
6:19
Conclusion
