Name: Akış ve Esneme Altında Biyomalzemelerin Enflamatuar ve Rejeneratif Kapasitesini Değerlendirmek için Çok İşaretli Bir Biyoreaktör (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Keşfedin, akış ve esneme altında biyomalzemelerin enflamatuar ve rejeneratif kapasitesini değerlendirmek için çok işaretli bir biyoreaktör kullanımını. Bu yöntem, doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta mekanik yüklerin etkilerini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, LSH 2Treat programının (436001003) ve Hollanda Böbrek Vakfı'nın (14a2d507) bir parçası olarak ZonMw tarafından finansal olarak desteklenmektedir. N.A.K. Avrupa Araştırma Konseyi'nin (851960) desteğini kabul eder. Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (024.003.013) tarafından finanse edilen YerÇekim Programı "Materyal Odaklı Rejenerasyon"u minnetle kabul ediyoruz.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada açıklanan biyoreaktör, borulu rezonanslı iskelelerde kesme stresi ve döngüsel esnemenin iltihaplanma ve doku yenilenmesi üzerindeki bireysel ve kombine etkilerinin sistematik olarak değerlendirilmesini sağlar. Bu yaklaşım aynı zamanda temsili sonuçlar bölümünde de örneklendirildiği gibi damar yapıları üzerinde çok çeşitli analizler yapılmasına olanak sağlamaktadır. Bu sonuçlar, farklı hemodinamik yükleme rejimlerinin (yani, farklı kesme ve esneme kombinasyonlarının) TEVG yapısında hem büyüme hem de yeniden şekille...

Kardiyovasküler doku mühendisliği (TE),1,2,3,4hastalarının büyük kohortları için yetersiz olan şu anda kullanılan kalıcı kardiyovasküler protezlere (örneğin, vasküler greftler, kalp kapak değiştirmeleri) alternatif bir tedavi seçeneği olarak takip edilmektedir. Çok aranan uygulamalar arasında doku mühendisliği yapılmış vasküler greftler (TEVG'ler) 5,6 ve kalp kapakçıkları (TEHV' ler)7,8bulunur. Çoğu zaman, kardiyovasküler TE metodolojileri, oluşacak yeni doku için öğretici bir iskele görevi gören yeniden sıralanabilir biyomalzemelerden (doğal veya sentetik) yararlanır. Yeni doku oluşumu tamamen in vitro olarak mühendislik yapılabilir, implantasyondan önce bir biyoreaktörde (in vitro TE) 9,10,11veya doğrudan in situ, sentetik iskelenin doğrudan vücutta yeni doku oluşumunu teşvik etmek için ön kültleme yapılmadan implante edildiği hücreli ve kültlü iskeleyi tohumlayarak (yerinde TE)12,13,14. Hem in vitro hem de in situ kardiyovasküler TE yaklaşımları için, başarılı fonksiyonel rejenerasyon baskın olarak hem implante yapıya konak immün yanıtına hem de uygun biyomekanik yüklemeye bağlıdır.
Kardiyovasküler TE için biyomekanik yüklemenin önemi iyi kabul edilir15. Kardiyovasküler implantlarda, iskeleyi dolduran hücreler hemodinamik ortamın bir sonucu olarak ortaya çıkan döngüsel esneme ve kesme streslerine maruz kalır. Çok sayıda çalışma, (döngüsel) esnemenin kollajen16 , 17 , 18,19,glikozaminoglisekanlar (GAG) 20 ve elastin21,22gibi matris bileşenlerinin oluşumu üzerindeki uyarıcı etkisini çeşitli hücre tiplerine göre bildirmektedir. Örneğin, Huang ve ark. biaksiyel streç bir vasküler biyoreaktör kullanarak in vitro TEVGs kollajen ve elastin birikimini ve organizasyonununu yükselttini göstermiştir23. Vurgu tipik olarak baskın yük olarak esnemeye dayansa da, bu çalışmalar genellikle numunenin kesme akışına da maruz kaldığı akış tahrikli biyoreaktörlerden yararlanır. Kesme gerilmelerinin 3D doku oluşumu ve iltihaplanma üzerindeki izole etkisi hakkında nispeten az şey bilinmesine rağmen, bazı veriler mevcuttur. Örneğin, Hinderer ve ark. ve Eoh ve arkadaşları, 3D iskele mikro yapısına ek olarak, in vitro model sistemde insan damar düz kas hücreleri tarafından olgun elastin oluşumu için önemli olduğunu göstermiştir24,25. Bu bulgular, kardiyovasküler TE için hem döngüsel esneme hem de kesme stresinin alaka düzeyini göstermektedir.
TE implantlarının başarısı veya başarısızlığı için bir diğer önemli belirleyici, konağın implante grefte immün yanıtıdır26. Bu, hücresel akın ve endojen doku oluşumu ve yeniden şekillendirme27sonraki süreçlerini başlatmak için iskeleye akut enflamatuar yanıta dayanan malzeme odaklı in situ TE stratejileri için özellikle önemlidir. Makrofaj,28,29,30gibi birden fazla çalışma ile gösterilen fonksiyonel doku yenilenmesinin kritik bir başlatıcısıdır. Yara iyileşmesine benzer şekilde, dokunun yenilenmesi makrofajlar ve fibroblastlar ve miyofibroblastlar31, 32,33 gibi doku üreten hücreler arasında parakrin sinyal ile yönetilir. Yeni doku birikimini koordine ederek, makrofajlar yabancı iskele malzemesi34,35'inaktif resorpsiyonunda yer almaktadır. Bu nedenle, bir biyomalzeme in vitro makrofaj yanıtı, implantların in vivo başarısı için tahmine dayalı bir parametre olarak tanımlanmıştır36,37,38.
İmplante edilmiş bir iskeleye makrofaj yanıtı, malzeme bileşimi ve mikroyapı35, 39,40gibi iskele tasarım özelliklerine bağlıdır. İskele özelliklerine ek olarak, bir iskeleye makrofaj tepkisi ve myofibroblasts ile çapraz konuşmaları da hemodinamik yüklerden etkilenmiştir. Örneğin, döngüsel streç makrofaj fenotip41 , 42,43,44ve sitokinlerinsalgılanması önemli bir modülatör olarak gösterilmiştir43,44,45,46 3D elektrospun iskelelerde. Makrofajlar ve vasküler düz kas hücrelerinden oluşan bir ortak kültür sistemi kullanan Battiston ve arkadaşları, makrofajların varlığının elastin ve GAG seviyelerinin artmasına yol açtığını ve orta derecede döngüsel esneme seviyelerinin (1.07-1.10) kollajen I ve elastin47'ninbirikmesini uyardığını göstermiştir. Önceki çalışmalarda, kesme stresinin 3D elektrospun iskeleleri48,49'a monosit alımı için önemli bir belirleyici olduğunu ve hem kesme stresinin hem de döngüsel esnemenin insan monositleri ve mezenkimal stromal hücreler arasındaki parakrin sinyali etkilediğini gösterdik50. Fahy ve arkadaşları, kesme akışının insan monositleri tarafından pro-enflamatuar sitokinlerin salgısını artırdığını göstermiştir51.
Birlikte ele alındığında, yukarıdaki kanıtlar hemodinamik yükler üzerinde yeterli bir anlayış ve kontrolün kardiyovasküler TE için çok önemli olduğunu ve bunu başarmak için enflamatuar yanıtın göz önünde bulundurulmasının önemli olduğunu göstermektedir. Daha önce in vitro52 , 53 , 54 ,55,56,57,58veya ex vivo59,60 ,61kardiyovasküler doku kültürü için çok sayıda biyoreaktör tanımlanmıştır. Bununla birlikte, tüm bu sistemler fizyolojik hemodinamik yükleme koşullarını mümkün olduğunca taklit etmek için tasarlanmıştır. Bu, kardiyovasküler dokuların in vitro olarak oluşturulması veya ex vivo kültürlerinin korunması amacıyla son derece değerli olsa da, bu tür sistemler bireysel ipuçlarının bireysel etkilerine sistematik çalışmalara izin vermez. Bunun nedeni, bu biyoreaktörlerde hem döngüsel esneme hem de kesme stresinin uygulanmasının, özünde onları bağlayan aynı basınçlı akış tarafından yönlendirilmesidir. Doğru çok işaretli mekanik manipülasyona izin veren mikrosistemler 2D substratlar62 veya 3D hidrojel kurulumları63,64için açıklanmış olsada,bu tür kurulumlar elastomerik 3D biyomalzeme iskelelerinin birleştirilmesine izin vermez.
Burada, kesme stresi ve döngüsel esnemenin ayrışmasını benzersiz bir şekilde sağlayan ve bireysel ve kombine etkilerini mekanistik olarak araştırmaya yardımcı olan bir tübüler biyoreaktör sisteminin uygulanmasını sunuyoruz. Bu sistem, çok çeşitli doku mühendisliği vasküler greftlerin (örneğin sentetik veya doğal kökenli, farklı mikro mimari, çeşitli gözeneklilikler) testine izin verir. Kesme gerilme ve germe uygulamasını etkili bir şekilde ayrıştırmak için, biyoreaktörün kullandığı temel kavramlar (1) ayrı pompa sistemleri kullanılarak kesme stresi ve esneme kontrolünün ayrılması ve (2) iskelelerin hesaplama odaklı boyutlara sahip 'içten dışa' bir şekilde uyarılmasıdır. Akış, borulu iskelenin dış yüzeyine bir akış pompası kullanılarak uygulanırken, iskelenin çevresel gerilmesi, iskelenin ayrı bir gerinim pompası kullanılarak monte edildiği silikon bir tüp genişletilerek indüklenmiştir. Silikon tüpün boyutları ve yapıyı içeren cam tüp, iskeledeki kesme stresinin (akış nedeniyle) ve çevresel germenin (tüp genişlemesi nedeniyle) birbirini önemli ölçüde etkilememesini sağlamak için hesaplamalı akışkan dinamiği simülasyonları kullanılarak özenle seçilir ve doğrulanır. Bu içten dışa tasarımın birkaç pratik mantığı vardır. Streç, ışık sıvısı basıncı (fizyolojik yüklemeye benzer) tarafından uygulanırsa, doğal olarak numune tasarımının sızdırmaz olmasını gerektirir. Ek olarak, numuneyi germek için gereken basınç, numuneler arasında ve zaman içinde bir numune içinde değişebilen numune sertliği tarafından tamamen belirlenir ve bu da esnemeyi kontrol etmeyi zorlaştırır. Bu biyoreaktör, doku mühendisliği yapılan grefti silikon bir tüpün etrafına monte eder ve greftin dış duvarında duvar kesme stresi (WSS) uygulamasına izin verir ve grefti içeriden basınçlandırır. Bu şekilde, numuneler arasında ve zaman içinde numuneler içinde eşit yükleme koşulları sağlanabilir ve dahası, gözenekli vasküler iskelelerde yaygın olduğu gibi numunelerin sızdırılmasına izin verilir19. Bu içten dışa biyoreaktör, geleneksel vasküler biyoreaktör kurulumlarının daha uygun olduğu doğal benzeri bir kan damarı in vitro mühendisliği yerine, kesme ve/ veya esnemenin etkileri üzerine sistematik çalışmalar için özel olarak tasarlanmıştır. Biyoreaktör tasarım çizimleri için Şekil 1A–B'ye ve biyoreaktörün ana bileşenlerinin arkasında işlevsel bir açıklama ve rasyonellik için ilgili Tablo 1'e bakın.
Biyoreaktör kullanımı, grubumuz tarafından, yerinde kardiyovasküler doku için resorbable elektrospun iskelelerinde kesme stresi ve döngüsel streçlerin iltihaplanma ve doku oluşumu üzerindeki bireysel ve kombine etkilerini araştırdığımız bir dizi yeni çalışmaya dayanarak gösterilmiştir19,43,44. Bu amaçla, in situ rejeneratif çağlayanın çeşitli aşamalarını simüle etmek için mono veya ortak kültürde insan makrofajları ve miyofibroblastları kullandık. İnsan makrofajları tarafından sitokin salgılamanın hem döngüsel streç hem de kesme stresinden belirgin bir şekilde etkilendiğini, bu iskelelerdeki insan miofibroblastları tarafından matris birikimini ve organizasyonunu etkilediğini, hem parakrin sinyalizasyon hem de doğrudan temas yoluyla19,43,44. Özellikle, bu çalışmalar, kesme stresi ve esnemenin kombine uygulanması durumunda, doku oluşumu ve iltihabı üzerindeki etkilerin ya iki yüklerden birinin hakim olduğunu ya da her iki yükün sinerjik etkilerinin olduğunu ortaya koydu. Bu bulgular, mekanik ortamın TE proseslerine olan katkısını daha iyi anlamak için her iki yükün ayrıştırmasının alaka düzeyini göstermektedir. Bu anlayış, ilgili hemodinamik yükleme rejimlerinde iskele tasarım parametrelerini sistematik olarak optimize etmek için uygulanabilir. Buna ek olarak, bu tür iyi kontrol edilen ortamlardan elde edilen mekanistik veriler, yakın zamanda TEVG 65 veya TEHV66 için bildirildiği gibi, yerinde doku tadilatının seyrini tahmin etmek için geliştirilen sayısal modeller için girdi görevi görebilirsiniz.

<table><tbody><tr><td>gelişmiş Dulbecco' Fibroblastlar için modifiye edilmiş EagleMedium (aDMEM)</td> <td>Gibco</td><td>12491-015</td><td>hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Aqua Stabil</td><td>Julabo</td><td>8940012</td><td>biyoreaktör-hidrolik rezervuarda mikroorganizma büyümesini önlemek</td></tr><tr>için<td>Sığır fibrinojeni</td><td>Sigma</td><td>F8630</td>, <td>elektrospun iskele üzerindeki hücreleri tohumlamak için fibrinojen jeli hazırlamak için</td></tr><tr><td>Sığır trombini</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td>elektrospun iskele üzerindeki hücreleri tohumlamak için fibrinojen jeli hazırlamak için</td></tr><tr>Hücreleri <td>döndürmek için</td><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5804</td> ve şartlandırılmış ortam</tr><tr><td>Kelepçe makası - "kelly forseps"</td><td>Almedic</td><td>P-422</td><td>silikon boruyu kelepçeler ve iskeleye ön gerdirme uygulayın, böylece iskele oyulmuş oluğa dikilebilir (adım 1, adım 7'de otoklav)</td></tr><tr><td>CO2 hücre kültürü inkübatörleri</td><td>Sanyo</td><td>Hücre kültürü için MCO-170AIC-PE</td><td></td></tr><tr><td>Basınçlı hava deposu</td><td>Festo</td><td>CRVZS-5</td>, <td>hava basıncı dalgalanmalarını yumuşatır ve basınç oluşumu için zaman gecikmeleri oluşturur</td></tr><tr><td>Maksimum esnemeleri hesaplamak için özel Matlab komut dosyası</td><td>Matlab</td><td>R2017. Mathworks, Natick, MA,</td><td>elektrospun iskelenin minimum ve maksimum dış çapını hesaplar</td></tr><tr><td>Veri toplama kartı</td><td>National Instruments</td><td>BNC-2090</td><td>amplifikatör sistemi ile bilgisayar arasında veri işleme</td></tr><tr><td>Steril çalışma koşullarını korumak için</td><td>etanol</td><td>VWR</td><td>VWRK4096-9005</td></tr><tr><td>Fetal sığır buzağı serumu (FBS)</td> <td>Greiner</td><td>758087</td><td>hücre kültürü ortamı takviyesi; serum takviyesi</td></tr><tr><td>Silikon boruya basınç uygulamak için oyulmuş oluklara ve küçük deliklere sahip bir basınç kanalı, bir vida dişi, burun konisi, akış girişli üst bölme ve alt bölme akış çıkışından oluşan akış kültürü odası bölmeleri, adaptör burcu</td><td>Özel yapım, Biyomedikal Mühendisliği Bölümü, Eindhoven Teknoloji Üniversitesi</td><td>n.a.flow</td> <td>kültür odası bölmeleri (1. adımda otoklav, adım 7)</td></tr><tr><td>Cam Pasteur pipet</td><td>Asistanı</td><td>HE40567002</td><td>elektroeğrilmiş iskeleye vakum uygulayın (adım 1'de otoklav)Custon</td></tr> <tr>yapımı <td>akış kültürü odasının cam</td><td>tüpleri, Ekipman ve Prototip Merkezi, Eindhoven Teknoloji Üniversitesi</td><td>n.a.akış</td> <td>kültürü odasının bir parçası (temizleyin ve %70 etanol içinde saklayın, adım 1 ve 7'de)</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>hücre kültürü ortamı amino asit takviyesi, amonyak birikimini en aza indirir</td></tr><tr><td>Yüksek hızlı kamera</td><td>MotionScope</td><td>M-5</td><td>kültür sırasında gerilmeyi izlemek için; İskelelerin hızlandırılmış fotoğrafları 6 saniye boyunca 30 Hz frekansında çekilir (yani 3 esneme döngüsü)</td></tr><tr><td>Yüksek hızlı kamera lensi - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - kültür</td><td>sırasında esnemeyi izlemek için Nikon JAA616AB objektif; iskelelerin hızlandırılmış fotoğrafları 6 saniye boyunca 30 Hz frekansında çekilir (yani 3 gerdirme döngüsü)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hortum klipsi</td><td>ibidi GmbH</td><td>10821</td><td>blok orta akış (1. adımda otoklav, adım 7)</td></tr> <tr><td>8 akış kültürü odası için 8 vida dişli hidrolik rezervuar</td><td>Özel yapım, Biyomedikal Mühendisliği Bölümü, Eindhoven Teknoloji Üniversitesi</td><td>n.a.silikon</td> <td>monteli yapılara basınç uygulamak için (dışını %70 etanol içeren bir kağıt mendille temizleyin, rezervuarı %70 etanol ile durulayın ardından 1. ve 7. adımda demi su)</td></tr><tr><td>Akış kültürü odalarındaki akışı kontrol etmek için kullanılan ibidi pompası, PumpControl yazılımı, akışkan ünitesi, perfüzyon seti (orta boru), hava basıncı borusu, turuncu silika boncuklu kurutma şişeleri ibidi</td><td>GmbH</td><td>10902</td> kurulumu dahil olmak üzere Ibidi pompa <td>sistemi (8x). Not 1: ibidi pompaları, üretici tarafından 200 mbar kapasite sağlayacak şekilde modifiye edilmiştir. Not 2: Aynı akış rejimleri uygulanabildiği sürece başka bir üreticinin pompa sistemi ile değiştirilebilir.</td></tr><tr><td>Bıçaklar (no.10 steril bıçaklar, ayrı folyo paketi) ve neşter sapı (paslanmaz çelik, ayrı ayrı sarılmış)</td><td>Swann Morton</td><td>0301; 0933</td> silikon <td>boruyu iskele için doğru boyutta kesmek ve dikiş malzemesini kesmek için</td></tr><tr><td>LabVIEW Yazılımı</td><td>National Instruments</td><td>sürüm 2018</td><td>İskelelere uygulanan esnemeyi kontrol etmek için</td></tr><tr><td>UV ışıklı laminer akış biyogüvenlik kabini</td><td>Labconco</td><td>302310001</td><td>steril çalışma koşullarını sağlamak için. UV, otoklavlanamayan veya otoklavlamadan sonra dokunulamayan her şeyi dekontamine etmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Büyük ve küçük petri kapları</td><td>Steril çalışma koşulları için</td><td>Greiner</td><td>664-160</td></tr><tr><td>L-askorbik asit 2-fosfat (C vitamini)</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>hücre kültürü ortamı takviyesi, kollajen üretimi için önemlidir</td></tr><tr><td>LED ışık soğuk kaynak KL2500</td><td>Zeiss</td><td>Schott AG</td><td>Streç</td></tr><tr><td>Luer (dişi ve erkek) kilitlerin ve konektörlerin, beyaz luer kapaklarının</td> izlenmesi sırasında iskelelerin zaman atlamalı görüntüsüne yardımcı olmak için <td>ibidi GmbH</td><td>çeşitli, bkz. (https://ibidi.com/26-flow-accessories)</td><td>biyoreaktörün ve ibidi pompasının parçalarını kapatmak veya bağlamak için (adım 1, adım 7'de otoklav)</td></tr><tr><td>Ölçüm amplifikatörü (PICAS)</td><td>PEEKEL instruments BV</td><td>n.a.basınç</td> <td>sensöründen gelen sinyali ve LabView'a geri beslemeyi yükseltmek için</td></tr><tr><td>Orta rezervuar (büyük şırıngalar 60 mL) ve rezervuar tutucular</td><td>ibidi GmbH</td><td>10974</td><td>orta rezervuar (adım 1, adım 7'de otoklav)</td></tr><tr><td>4,25 mm dış çapa ve 1 mm iç çapa sahip orta boru</td><td>Kauçuk BV</td><td>1805</td><td>Daha büyük bir akış hızına izin vermek için, daha büyük çaplı ibidi orta boru kullanılır. Not: Akışkan ünite valfleri aracılığıyla yönlendirilen orta borunun bir kısmı, varsayılan ibidi orta boru</td></tr><tr><td>ile aynıdır Motion Studio Yazılımı</td><td>Idtvision</td><td>2.15.00</td>, <td>esneme izleme için yüksek hızlı hızlandırılmış görüntüler oluşturmak için</td></tr> İğne <tr><td>(19G)</td> <td>BD Microlance</td><td>301700</td>, <td>hidrolik rezervuarı hava kabarcıkları eklemeden ultra saf suyla doldurmak için kullanılan ince esnek boru ile birlikte</td></tr><tr><td>İğne sürücüsü</td><td>Naylon</td><td></td><td>sütürün iğnesini silikon tüpten geçirmek için Adson 2429218 (adım 1, adım 7'de otoklav)</td></tr><tr><td>Kağıt mendiller</td><td>%70 etanol ile ekipmanın temizlenmesi için</td><td>Kleenex</td><td>38044001</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td>sızıntı olursa hızlı düzeltme</td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin (P / S)</td> <td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td>hücre kültürü ortamı takviyesi; bakterileri önlemek kontaminasyon</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Serum Fizyolojik (PBS)</td>Depolama ve yıkama adımları için <td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td>(1. adımda otoklav)</td></tr><tr><td>Kırmızı vidalı kapaklı plastik kaplar (60 mL)</td><td>Fibrinojen çözeltisini hazırlamak için</td><td>Greiner</td><td>206202</td></tr><tr><td>Teflon</td> körüğü harekete geçirmek için pnömatik silindir <td>Festo</td><td>AEVC-20-10-I-P</td><td>(1. ve 7. adımlarda %70 etanol içeren bir kağıt mendille temizleyin)</td></tr><tr><td>Polikaprolakton bisurea (PCL-BU) borulu iskeleler (3 mm iç çap, 200 & mikro; m duvar kalınlığı, 20 mm uzunluk)</td><td>SyMO-Chem, Eindhoven, Hollanda</td><td>n.a.</td><td>% 15 (a/a) kloroform (Sigma; 372978) polimer çözeltilerinden elektrospinning kullanılarak üretilmiştir. Daha fazla ayrıntı için Van Haaften ve ark. Doku Mühendisliği Bölüm C'ye (2018) bakın</td></tr><tr><td>Deliksiz basınç kanalı (statik kontrol için)</td><td>Özel yapım, Biyomedikal Mühendisliği Bölümü, Eindhoven Teknoloji Üniversitesi</td><td>n.a.elektrospun</td> <td>tüpleri silikon boruya monte etmek için (adım 1, adım 7'de otoklav)</td></tr><tr><td>Basınç sensörü ve dönüştürücü</td><td>BD</td><td>TC-XX ve P 10 EZ</td><td>Pnömatik aktüatörlü pompaya giden hava basıncı, ayarlanan basınca ulaşana kadar yükseltilir</td></tr><tr><td>Oransal hava basıncı kontrol vanası ve basınç sensörü</td><td>Festo</td><td>MPPES-3-1/8-2-010, 159596</td><td>pnömatik aktüatörlü pompaya basınçlı hava sağlar</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)</td><td>Gibco</td><td>A1049101</td><td>monosit/makrofaj için hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Güvenli kilit Eppendorf tüpleri (1,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>çoklu uygulamalar (adım 1'de otoklav)</td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat çözeltisi %20</td> <td>Sigma</td><td>5030</td><td>Malzemeleri temizlemek için %0,1 konsantrasyonda kullanılır. &nbsp;</td></tr><tr><td>Sızıntıyı önlemek için silikon O-ringler</td><td>Technirub</td><td>1250S</td><td>(adım 1, adım 7'de otoklav)</td></tr><tr><td>Silikon boru (2,8 mm dış çap, 400 um duvar kalınlığı)</td><td>Elektrospun boruları basınç kanallarına monte etmek için</td> <td>Rubber BV</td><td>1805</td> (adım 1'de otoklav)</tr><tr><td>Steril tüp (15 mL)</td>Çoklu <td>uygulamalar</td><td>352095</td> <td>Falcon</td></tr><tr><td>Sütür, önceden takılmış konik uçlu iğne</td> <td>ile 5-0 proleneEthicon, Johnson& Johnson</td><td>EH7404H</td><td>Prolene sütür teli 5-0 (75 cm uzunluk, TF konik uçlu iğne, 1/2 daire, 13 mm iğne uzunluğu)</td></tr> <tr><td>Şırınga (24 mL)</td><td>B. Braun Melsungen AG</td>, <td>ultra saf su veya ortamı hidrolik rezervuara veya akış kültürü odasına eklemek için</td><td>2057932</td></tr><tr><td>Şırınga filtresi (0.2 ve mikro; m)</td> <td>Fibrinojen çözeltisini filtrelemek için</td> <td>Satorius</td><td>17597-K</td></tr><tr><td>Filtre kapaklı T150 hücre kültürü şişesi</td><td>Nunc</td><td>178983</td><td>degas kültür ortamı</td></tr><tr><td>T75 Filtre kapaklı hücre kültürü şişesi</td><td>Nunc</td><td>156499</td><td>kültür statik kontrol numuneleri</td></tr><tr><td>Teflon körük</td><td>Özel yapım, Biyomedikal Mühendisliği Bölümü, Eindhoven Teknoloji Üniversitesi</td><td>n.a.</td><td>hidrolik rezervuarı yüklemek için (1. ve 7. adımda %70 etanol içeren bir kağıt mendille dışını temizleyin)</td></tr><tr><td>Tepsi (paslanmaz çelik)</td><td>PolarWare</td><td>15-248</td>, <td>akışkan kültür odalarının ve biyoreaktörün inkübatörden laminer akış kabinine ve sırtına kolay taşınması için (kullanımdan önce ve sonra %70 etanol içeren bir kağıt mendille temizleyin)</td></tr><tr><td>Cımbız</td><td>Wironit</td><td>4910</td><td>münferit parçaların steril kullanımı (adım 1 ve 7'de otoklav)</td></tr><tr><td>Ultra saf su</td><td>Stakpure</td><td>Omniapure UV,</td><td>orta buharlaşmayı düzeltmek için 18200002, aqua stabil ile karıştırılır ve hidrolik sıvı olarak kullanılır. (1. adımda otoklav ultra saf su)</td></tr><tr><td>Tohumlamadan önce greftlerin ve biyoreaktör parçalarının dekontaminasyonu için</td> <td>UV ışığı</td><td>Philips</td><td>TUV 30W/G30 T8</td></tr></tbody></table>

akış ve esneme altında biyomalzemelerin enflamatuar ve rejeneratif kapasitesini değerlendirmek için Çok İşaretli bir biyoreaktör

A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch

Resorbe edilebilir biyomalzemelerin doğrudan vücutta yenilenmeyi teşvik etmek için kullanılması, çevirisel açıdan çekici bir stratejidir. Bu tür malzemeler implantasyon üzerine enflamatuar bir yanıta neden olur, bu da malzemenin daha sonra emilmesinin ve yeni dokunun yenilenmesinin sürücüsüdür. Yerinde doku mühendisliği olarak da bilinen bu strateji, doku mühendisliği vasküler greftler gibi kardiyovasküler yedekler elde etmek için izlenmiştir. Hem enflamatuar hem de rejeneratif süreçler, iskeledeki lokal biyomekanik ipuçları (yani, esneme ve kesme stresi) ile belirlenir. Burada, borulu bir iskelede streç ve kesme stresinin ayrıştırılmasını benzersiz bir şekilde sağlayan özel olarak geliştirilmiş bir biyoreaktörün kullanımını ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu, insan makrofajları ve miyofibroblastları kullanarak dinamik bir ortak kültür deneyine dayanarak gösterdiğimiz iyi kontrol edilmiş mekanik yüklerin etkisi altında tübüler iskelelerin enflamatuar ve rejeneratif kapasitesinin sistematik ve standart olarak değerlendirilmesine izin verir. Bu yaklaşımdaki temel pratik adımlar (biyoreaktörün inşası ve kurulması, iskelelerin ve hücre tohumlamanın hazırlanması, streç ve kesme akışının uygulanması ve bakımı ve analiz için numune hasadı) ayrıntılı olarak ele alınmıştır.

Bu biyoreaktör, 3D biyomalzeme iskelelerinde kesme stresi ve döngüsel esnemenin vasküler doku büyümesi ve yeniden şekillendirilmesi üzerindeki bireysel ve kombine etkilerini incelemek için geliştirilmiştir. Biyoreaktörün tasarımı, çeşitli yükleme koşullarında sekiz vasküler yapının kült örüldürülmesine izin verir (Şekil 1A). Vasküler yapılar, hem çevresel streç hem de WSS'nin bağımsız olarak kontrol edilebildiği bir akış kültürü odasına(Şekil 1B)yerleştirilmişti...

Bu protokolün amacı, kesme stresi ve döngüsel esnemenin birleşmesini sağlayan bir biyoreaktör kullanarak, malzeme güdümlü doku yenilenmesini araştırmak için tübüler elektrospun iskelelerinde insan makrofajları ve miyofibroblastların dinamik bir ortak kültürünü yürütmektir.

Akış ve Esneme Altında Biyomalzemelerin Enflamatuar ve Rejeneratif Kapasitesini Değerlendirmek için Çok İşaretli Bir Biyoreaktör

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials ...

Şimdiye kadar, hemodinamik ve vasküler doku rejenerasyonu arasındaki neden-sonuç ilişkilerini belirlemek gerçekten zor olmuştur. Ve bunun nedeni, bireysel mekanik yükleri kontrol etmenin zor olmasıdır. Bu biyoreaktör, çok çeşitli doku mühendisliği vasküler greftlerin rejeneratif potansiyeli üzerindeki saf stres ve döngüsel gerilmenin bireysel ve birleşik etkilerini mekanik olarak araştırmamızı sağlar.Bu prosedürü göstermek, grubumuzdaki bir doktora adayı olan Suzanne Koch olacaktır. Ve laboratuvarımızdan doktora sonrası araştırmacı olan Dr.Tamar Wissing. Elektro eğrilmiş iskeleyi silikon boruya monte etmek için, bir silikon boru parçasının bir ucuna 4-0 prolen sütür geçirin ve diğer ucundan çıkarın.Borunun her iki tarafında küçük bir düğüm atın, her iki düğümde de yaklaşık 10 santimetre tel bırakın ve ikisinin üzerine üçüncü bir düğüm atın. Bir dikiş iğnesini çıkardıktan sonra, silikon borunun kenarlarını üçgen bir şekle kesin ve iki 10 santimetrelik telin ucunda son bir düğüm yapın. Elektro eğrilmiş iskeleyi %30 etanole batırın ve iskeleyi serbest dikiş telinin bir ucuna yerleştirin.Daha sonra, silikon borunun her iki tarafını ve 10 santimetrelik dikiş düğümünü nazikçe gererken, ikinci araştırmacı elektro eğrilmiş iskeleyi borunun üzerinde nazikçe kaydırmak için pürüzsüz bir iç uca sahip cımbız kullanır. Elektro eğrilmiş iskeleyi cımbızla aynı anda düzeltirken silikon boru üzerindeki gerginliği yavaşça serbest bırakın. Ve iskeleyi ve silikon boruyu iki kez ultra saf suya batırın.Alt bölmeyi oluşturun ve O-ringin doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olun. Alt bölmenin üst kısmına bir adaptör burcu yerleştirin ve basınç kanalını alt bölmeden deliklerle yerleştirin. Sızıntıyı önlemek için silikon O-ringi basınç kanalının alt ucunun etrafına bağlayın.Basınç kanalını sabitlemek için alt bölmenin alt kısmını alt bölmenin üst kısmına vidalayın. Basınç kanalının alt oyulmuş oluğunun, alt bölmenin adaptör burcunun kenarından yaklaşık üç ila beş milimetre yukarıda olduğundan emin olun. Elektro eğrilmiş iskele ile silikon tüpü basınç kanalının üzerine çekin ve elektro eğrilmiş iskelenin alt ucunda, basınç kanalı üzerindeki oyulmuş oluğun bulunduğu yerde bir başını sallayın ve dikiş teli.Silikon boruyu elektro eğrilmiş greft ile sıkıca sabitlemek için karşı tarafa ikinci bir baş sallayın. Ve silikon borunun üst ucuna bir cetvel ile donatılmış bir makas kelepçesi yerleştirerek, makas kelepçesini tutarlı bir şekilde yukarı doğru çekin ve kırışıklıkları gidermek için elektrikli yumurtlama iskelesini nazikçe çekin. Basınç kanalının üst oyulmuş oluğunda iskelenin her iki ucunda iki düğüm yapmak için bir dikiş teli kullanın.Her iki düğüm de yapıldığında, makas kelepçesini serbest bırakın ve fazla silikon boruyu çıkarmak için bir bıçak kullanın. Dinamik olarak yüklenecek numuneler için burun konilerini basınç kanallarının vida dişine vidalayın. Kurulumu önceden ıslatmak için basınç kanalını, boruyu ve iskeleyi bir kez %30 etanole ve iki kez ultra saf suya batırın.Cam tüpü basınç kanalının üzerine yerleştirin ve cam tüpü yerine sabitlemek için alt bölmeye hafifçe itin. Ardından akış düzleştiriciyi, silikon bir O-ringi ve adaptör burcunu üst bölmeye yerleştirin. Ve bölmeyi cam tüpün açık ucunun üzerine sabitleyin.Erkek yem tapasını akış çıkışından çıkarın, steril bir laminer akış kabininde çalışın. Beyaz yem kapağını açın ve akış çıkışının önüne bir etanol ıslatma mendili yerleştirin. Üst bölme ile cam tüpü çıkararak akış kültürü odasını sökün.Mümkün olduğu kadar fazla ortamı çıkarmak için elektro eğrilmiş iskelenin üzerine bir vakumlu mera borusu ekleyin. Ve trombin takviyeli hücre süspansiyonu ile bire bir oranında fibrinojen çözeltisi ekleyin. Solüsyonu bir kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve solüsyonu hemen iskelenin tüm uzunluğu boyunca damlatın.Tüm hücreler teslim edildiğinde, hücrelerin eşit bir şekilde dağılmasını sağlamak için iskeleyi yavaşça soldan sağa ve yukarı ve aşağı hareket ettirin. İskelenin her iki tarafı da tohumlandığında, cam tüpü ve üst bölmeyi geri koyarak akış kültürü odasını dikkatlice yeniden oluşturun. Ve elyafın katılaşmasına izin vermek için akış kültürü odasını inkübatöre yerleştirin.Biyoreaktörü pompa sistemine bağlamak için, akış kültürü odasını biyoreaktör tabanındaki sekiz vida dişinden birine yerleştirin. Ve orta boruya bir ana klips yerleştirin. Akış kültürü odasının üst bölmesinin akış girişini kaplayan beyaz yem kapağını çıkarın ve orta borunun dişi yem kuplörünü çıkarın.Orta boruyu üst bölmedeki akış girişinin bir tarafına bağlayın. Ve diğer taraf, alt bölmedeki akış çıkışı ile. Tüm kurulumu laminer akış kabininden inkübatöre aktarın.Ve bir akışkan ünitesini ve biyoreaktör tabanını hava basıncı borusuna ve elektrik kablosuna bağlayın. Yazılımı başlatın ve pompaları başlatın. Numuneler için orta akışı tek tek başlatın.Ardından gerinim pompası parametrelerini istenen ayarlara getirin ve gerilimi başlatın. İskeleye uygulanan esnemeyi gün aşırı izleyin. Uzun süreli kültür periyotları boyunca gerilme ve duvar kesme gerilmesinin izlenmesi, bu değerlerin 20 güne kadar bir süre boyunca nispeten sabit seviyelerde tutulabileceğini göstermektedir.Üç günlük hemodinamik yüklemeden sonra, immünofloresan boyama, yapı iskelesi boyunca monosit türevi makrofajların ve miyofibroblastların homojen bir dağılımını ortaya çıkarır. 20 günlük ko-kültürden sonra, döngüsel gerilme, daha çok sayıda ve daha kalın kollajen tip 1 liflerinin birikmesine neden olur. Kombine hemodinamik yük grubundayken, döngüsel gerilme etkisi, daha az belirgin bir kollajen tip 1 birikimi ile sonuçlanan saf stres tarafından reddedilir.Sekiz günlük makrofaj monokültüründen sonra, tüm hemodinamik yükleme rejimlerinde lif erozyonu ve lif bölünmesi gözlenir, en belirgin rezorpsiyon statik grupta gözlenir ve en az belirgin rezorpsiyon saf stres grubunda gözlenir. Hem döngüsel gerilme hem de saf stres, ko-kültür kurulumunun sitokin salgı profilini etkiler. İlginç bir şekilde, her iki yükün birleşik etkileri, ya iki yükten birinin baskınlığını ya da her iki yükün sinerjik etkilerini gösterir.Ko-kültür deneyleri ayrıca mekanik ortamın ve sonuçta ortaya çıkan yüklemeye bağlı enflamatuar ortamların miyofibroblastların fenotipini modüle ettiğini göstermektedir. Ayrıca, kasılma belirteci alfa düz kas aktininin gen ekspresyon paternleri protein sentezi ile ilişkilidir. Bu protokolü gerçekleştirirken en önemli şey, esneme uygulamasının ne olduğudur, kurulumunuzun sızdırmaz olması çok önemlidir.

a-multi-cue-bioreactor-to-evaluate-inflammatory-regenerative-capacity

Research

JoVE Journal

Engineering

Mühendislik

Grubumuz, kardiyovasküler sistem fizyolojik pulsatil gerilmeler implante küçük çaplı vasküler greft yeniden taklit eden bir biyoreaktör kültür sistemi geliştirmiştir.

Pulsatif Biyoreaktör kullanarak Mühendislik Biyolojik Tabanlı Vasküler Greftler

Basınç koşulları fizyolojik ve patolojik kalp kapakçığı dokusu tabi yapabilen bir siklik basınç biyoreaktör dizayn edilmiştir. LabVIEW programı, kullanıcıların basınç büyüklüğü, genlik ve frekans kontrol etmenizi sağlar. Bu cihaz, kalp kapakçığı dokusu veya izole hücrelerin mechanobiology incelemek için kullanılabilir.

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

Biz eklem kıkırdağı kusur içine önce nakli için bir kıkırdak biokompozit için tek eksenli veya çift eksenli mekanik zorlanma uygulayabilirsiniz yeni bir mekanik yüklenme biyoreaktör tasarlanmıştır.

Doku Mühendisliği için iki eksenli Mekanik Yükleniyor Biyoreaktör tasarımı

Burada, birincil hücreleri, doku modellerini ve punch biyopsilerini 28 güne kadar mikroakışkan çok organlı bir çipte kokültür yapmak için bir protokol sunuyoruz. İnsan dermal mikrovasküler endotel hücreleri, karaciğer agregatları ve deri biyopsileri ortak bir besiyeri dolaşımında başarılı bir şekilde birleştirildi.

Çok organ Chip - Uzun vadeli Çok doku kokültürü için mikroakışkan Platformu

Biz macroporous microcarriers bir hücre genişletme protokolü ve kullanımları decellularized doku matris temel için bir perfüzyon biyoreaktör teslim sistemi olarak öneriyoruz. Biz de hücre çoğalması ve canlılığı üzerinde microcarriers kültürlü hücre belirlemek için farklı teknikler içerir. Ayrıca, biyoreaktör kültürler sonra hücreleri işlevselliğini göstermektedir.

Rekombinant kolajen peptid Microcarriers hücre genişletme ve hücre teslim sistemi bir biyoreaktör olarak potansiyel kullanım için ben Model

Bu makalede, kondrosit sıkıştırma için pnömatik olarak mikroakışkan bir cihaz imal etmek ve karakterize etmek için ayrıntılı yöntemler sağlanmıştır.

Dinamik Sıkıştırma ile Chondrocytes Uyarıcı için Bir Mikroakışkan Platform

Bu yazıda, hücresel proseslerde çözünenlerin sekresyon dinamiklerini ve absorpsiyon oranlarını ölçmek için düşük maliyetli, çok kanallı bir perfüzyon hücre kültürü sistemi kurmak ve çalıştırmak için bir yöntem sunulmaktadır. Sistem ayrıca hücreleri dinamik uyaran profillerine maruz bırakabilir.

Dinamik Hücre Kültürü için Çıkış Fraksiyonasyonu ile Entegre Çok Akışlı Perfüzyon Biyoreaktörü

Kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler kullanılarak biyomühendislik yapılan üç boyutlu kalp dokuları, doğal kardiyak nişin temel yönlerini özetlerken, sağlıklı ve hastalıklı insan miyokardını in vitro incelemek için umut verici modeller olarak ortaya çıkmıştır. Bu makale, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerden üretilen yüksek içerikli tasarlanmış kardiyak dokuların üretilmesi ve analiz edilmesi için bir protokolü açıklamaktadır.

Tasarlanmış Kardiyak Dokuların Veri Toplamasını ve Model Verimini İyileştirmek için Bir Biyoreaktör Tasarlama

Bir kesme hücre kesme hız-hız gradyanı düzleminde küçük açı nötron saçılımı ölçümleri için geliştirilmiştir ve karmaşık akışkanları karakterize etmek için kullanılır. Hız gradyanı yönünde uzaysal çözülmüş kesme-bant ölçümleri malzemelerin araştırılması için mümkündür. Uygulamalar koloidal dispersiyonların araştırmalar, polimer çözeltiler, ve kendinden düzenlenen yapılar yer alır.

1-2 Düzlem Flow-Küçük Açı Nötron Saçılma kullanma Malzeme Mikroyapı altında Akış Ölçme

Polimerlerin ve elyaf takviyeli polimer kompozitlerin hizmetteki dayanıklılığı, tasarımları ve duruma dayalı bakım için kritik bir husustur. Eşzamanlı mekanik ve çevresel yüklerin etkisinin araştırılması için yeni, düşük maliyetli bir laboratuvar test platformu sunuyoruz ve daha verimli ancak daha güvenli kompozit yapıların tasarlanmasına yardımcı olabiliriz.

Polimer Dayanıklılık Çalışmaları ve Eşzamanlı Hygrothermo-mekanik Uyaranlara altında Fiber takviyeli kompozitler Polimer A Test Platformu

Keşfedin, akış ve esneme altında biyomalzemelerin enflamatuar ve rejeneratif kapasitesini değerlendirmek için çok işaretli bir biyoreaktör kullanımını. Bu yöntem, doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta mekanik yüklerin etkilerini anlamaya yardımcı olur.

Akış ve Esneme Altında Biyomalzemelerin Enflamatuar ve Rejeneratif Kapasitesini Değerlendirmek için Çok İşaretli Bir Biyoreaktör (Video) | JoVE Journal

Akış ve Esneme Altında Biyomalzemelerin Enflamatuar ve Rejeneratif Kapasitesini Değerlendirmek için Çok İşaretli Bir Biyoreaktör

Daha fazla video keşfet