Akış ve Esneme Altında Biyomalzemelerin Enflamatuar ve Rejeneratif Kapasitesini Değerlendirmek için Çok İşaretli Bir Biyoreaktör

Şimdiye kadar, hemodinamik ve vasküler doku rejenerasyonu arasındaki neden-sonuç ilişkilerini belirlemek gerçekten zor olmuştur. Ve bunun nedeni, bireysel mekanik yükleri kontrol etmenin zor olmasıdır. Bu biyoreaktör, çok çeşitli doku mühendisliği vasküler greftlerin rejeneratif potansiyeli üzerindeki saf stres ve döngüsel gerilmenin bireysel ve birleşik etkilerini mekanik olarak araştırmamızı sağlar.

Bu prosedürü göstermek, grubumuzdaki bir doktora adayı olan Suzanne Koch olacaktır. Ve laboratuvarımızdan doktora sonrası araştırmacı olan Dr.Tamar Wissing. Elektro eğrilmiş iskeleyi silikon boruya monte etmek için, bir silikon boru parçasının bir ucuna 4-0 prolen sütür geçirin ve diğer ucundan çıkarın.

Borunun her iki tarafında küçük bir düğüm atın, her iki düğümde de yaklaşık 10 santimetre tel bırakın ve ikisinin üzerine üçüncü bir düğüm atın. Bir dikiş iğnesini çıkardıktan sonra, silikon borunun kenarlarını üçgen bir şekle kesin ve iki 10 santimetrelik telin ucunda son bir düğüm yapın. Elektro eğrilmiş iskeleyi %30 etanole batırın ve iskeleyi serbest dikiş telinin bir ucuna yerleştirin.

Daha sonra, silikon borunun her iki tarafını ve 10 santimetrelik dikiş düğümünü nazikçe gererken, ikinci araştırmacı elektro eğrilmiş iskeleyi borunun üzerinde nazikçe kaydırmak için pürüzsüz bir iç uca sahip cımbız kullanır. Elektro eğrilmiş iskeleyi cımbızla aynı anda düzeltirken silikon boru üzerindeki gerginliği yavaşça serbest bırakın. Ve iskeleyi ve silikon boruyu iki kez ultra saf suya batırın.

Alt bölmeyi oluşturun ve O-ringin doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olun. Alt bölmenin üst kısmına bir adaptör burcu yerleştirin ve basınç kanalını alt bölmeden deliklerle yerleştirin. Sızıntıyı önlemek için silikon O-ringi basınç kanalının alt ucunun etrafına bağlayın.

Basınç kanalını sabitlemek için alt bölmenin alt kısmını alt bölmenin üst kısmına vidalayın. Basınç kanalının alt oyulmuş oluğunun, alt bölmenin adaptör burcunun kenarından yaklaşık üç ila beş milimetre yukarıda olduğundan emin olun. Elektro eğrilmiş iskele ile silikon tüpü basınç kanalının üzerine çekin ve elektro eğrilmiş iskelenin alt ucunda, basınç kanalı üzerindeki oyulmuş oluğun bulunduğu yerde bir başını sallayın ve dikiş teli.

Silikon boruyu elektro eğrilmiş greft ile sıkıca sabitlemek için karşı tarafa ikinci bir baş sallayın. Ve silikon borunun üst ucuna bir cetvel ile donatılmış bir makas kelepçesi yerleştirerek, makas kelepçesini tutarlı bir şekilde yukarı doğru çekin ve kırışıklıkları gidermek için elektrikli yumurtlama iskelesini nazikçe çekin. Basınç kanalının üst oyulmuş oluğunda iskelenin her iki ucunda iki düğüm yapmak için bir dikiş teli kullanın.

Her iki düğüm de yapıldığında, makas kelepçesini serbest bırakın ve fazla silikon boruyu çıkarmak için bir bıçak kullanın. Dinamik olarak yüklenecek numuneler için burun konilerini basınç kanallarının vida dişine vidalayın. Kurulumu önceden ıslatmak için basınç kanalını, boruyu ve iskeleyi bir kez %30 etanole ve iki kez ultra saf suya batırın.

Cam tüpü basınç kanalının üzerine yerleştirin ve cam tüpü yerine sabitlemek için alt bölmeye hafifçe itin. Ardından akış düzleştiriciyi, silikon bir O-ringi ve adaptör burcunu üst bölmeye yerleştirin. Ve bölmeyi cam tüpün açık ucunun üzerine sabitleyin.

Erkek yem tapasını akış çıkışından çıkarın, steril bir laminer akış kabininde çalışın. Beyaz yem kapağını açın ve akış çıkışının önüne bir etanol ıslatma mendili yerleştirin. Üst bölme ile cam tüpü çıkararak akış kültürü odasını sökün.

Mümkün olduğu kadar fazla ortamı çıkarmak için elektro eğrilmiş iskelenin üzerine bir vakumlu mera borusu ekleyin. Ve trombin takviyeli hücre süspansiyonu ile bire bir oranında fibrinojen çözeltisi ekleyin. Solüsyonu bir kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve solüsyonu hemen iskelenin tüm uzunluğu boyunca damlatın.

Tüm hücreler teslim edildiğinde, hücrelerin eşit bir şekilde dağılmasını sağlamak için iskeleyi yavaşça soldan sağa ve yukarı ve aşağı hareket ettirin. İskelenin her iki tarafı da tohumlandığında, cam tüpü ve üst bölmeyi geri koyarak akış kültürü odasını dikkatlice yeniden oluşturun. Ve elyafın katılaşmasına izin vermek için akış kültürü odasını inkübatöre yerleştirin.

Biyoreaktörü pompa sistemine bağlamak için, akış kültürü odasını biyoreaktör tabanındaki sekiz vida dişinden birine yerleştirin. Ve orta boruya bir ana klips yerleştirin. Akış kültürü odasının üst bölmesinin akış girişini kaplayan beyaz yem kapağını çıkarın ve orta borunun dişi yem kuplörünü çıkarın.

Orta boruyu üst bölmedeki akış girişinin bir tarafına bağlayın. Ve diğer taraf, alt bölmedeki akış çıkışı ile. Tüm kurulumu laminer akış kabininden inkübatöre aktarın.

Ve bir akışkan ünitesini ve biyoreaktör tabanını hava basıncı borusuna ve elektrik kablosuna bağlayın. Yazılımı başlatın ve pompaları başlatın. Numuneler için orta akışı tek tek başlatın.

Ardından gerinim pompası parametrelerini istenen ayarlara getirin ve gerilimi başlatın. İskeleye uygulanan esnemeyi gün aşırı izleyin. Uzun süreli kültür periyotları boyunca gerilme ve duvar kesme gerilmesinin izlenmesi, bu değerlerin 20 güne kadar bir süre boyunca nispeten sabit seviyelerde tutulabileceğini göstermektedir.

Üç günlük hemodinamik yüklemeden sonra, immünofloresan boyama, yapı iskelesi boyunca monosit türevi makrofajların ve miyofibroblastların homojen bir dağılımını ortaya çıkarır. 20 günlük ko-kültürden sonra, döngüsel gerilme, daha çok sayıda ve daha kalın kollajen tip 1 liflerinin birikmesine neden olur. Kombine hemodinamik yük grubundayken, döngüsel gerilme etkisi, daha az belirgin bir kollajen tip 1 birikimi ile sonuçlanan saf stres tarafından reddedilir.

Sekiz günlük makrofaj monokültüründen sonra, tüm hemodinamik yükleme rejimlerinde lif erozyonu ve lif bölünmesi gözlenir, en belirgin rezorpsiyon statik grupta gözlenir ve en az belirgin rezorpsiyon saf stres grubunda gözlenir. Hem döngüsel gerilme hem de saf stres, ko-kültür kurulumunun sitokin salgı profilini etkiler. İlginç bir şekilde, her iki yükün birleşik etkileri, ya iki yükten birinin baskınlığını ya da her iki yükün sinerjik etkilerini gösterir.

Ko-kültür deneyleri ayrıca mekanik ortamın ve sonuçta ortaya çıkan yüklemeye bağlı enflamatuar ortamların miyofibroblastların fenotipini modüle ettiğini göstermektedir. Ayrıca, kasılma belirteci alfa düz kas aktininin gen ekspresyon paternleri protein sentezi ile ilişkilidir. Bu protokolü gerçekleştirirken en önemli şey, esneme uygulamasının ne olduğudur, kurulumunuzun sızdırmaz olması çok önemlidir.