Keşif Odaklı Konak-Patojen Etkileşimleri için Etiketsiz Nicel Proteomik İş Akışı

Burada, kitle spektrometresi bazlı proteomik enfeksiyon sırasında konak ve patojen arasındaki etkileşimin profilini çıkarmak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, tek bir deneyde hem konakçının (örneğin, makrofajlar) hem de patojenin (örneğin Cryptococcus neoformans)protein bolluğundaki değişiklikleri ölçmek için etiketsiz niceleme kullanır.

Protokolümüz, bir hastalık için kritik olan biyolojik sistemler arasındaki etkileşimleri belirlemek için mantar enfeksiyonunu hem konakçı hem de patojen perspektifinden araştırır. Tek bir deneyde hem mantar hem de konak proteinlerini tespit edebilir ve yeni enfeksiyonla ilişkili proteinleri temsil eden yalnızca enfeksiyon sırasında üretilen mantar proteinlerini tanımlayabiliriz. Tedavi için yeni anti-virülan stratejileri ortaya çıkararak mantar enfeksiyonlarını tedavi etmeye odaklanmamıza rağmen, proteomik ve biyoinformatik boru hattımız evrenseldir ve birçok biyolojik sisteme uygulanabilir.

Yaklaşımımız, farklı patojenler ve çok sayıda bağışıklık tepkisi üzerine yapılan çalışmaların temelini oluşturur ve kriptokok ile doğuştan gelen bağışıklık sistemi arasındaki ilişkiye dair yeni bilgiler sağlamak için kullanılabilir. Makrofajın patojenlere verdiği yanıt ve yeterli mantar proteininin saptanması önemlidir. Bu nedenle, her tür için MOI'lerin ve zaman noktalarının test edilmesi ve optimize edilmesi önerilir.

Makrofaj ve mantar hücre kültürü zor olabileceğinden, kokültürden sonra ne bekleyeceğinizi bilmek önemlidir. Görselleştirme, araştırmacıya prosedürün uygulanmasında güven sağlar. Mantar hücrelerini bir makrofaj enfeksiyonu için hazırlamak için, orta uzun faz kültüründen C neoformans hücrelerini toplayın ve santrifüjleyin, ardından aynı santrifüj koşulları altında bir mililitre oda sıcaklığında PBS ile üç nazik yıkama yapın.

Son yıkamadan sonra, mantar hücrelerini mililitre antibiyotik serbest hücre kültürü, orta konsantrasyonda 1.2 kez 10 ila sekizinci hücrede yeniden süspanse edin ve %70 ila %80 birleşik altı kuyulu makrofaj kültür plakasının dört oyuğunun her birine bir mililitre mantar hücresi süspansiyonu ekleyin. Ardından, plakayı üç saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Her bir oluğun, yıkama başına bir mililitre PBS ile üç kez nazikçe yıkanmasına izin vermek için plakayı dikkatlice eğin.

Son yıkamadan sonra enfeksiyon yeterliliğini ölçmek için, altı oyuklu plakanın her bir oyuğuna bir mililitre antibiyotik içermeyen ortam ekleyin ve plakayı hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Uygun deneysel zaman noktalarında, her bir kuyucuktan süpernatanı toplayın ve standart protokollere göre her bir kuyucuktaki LDH miktarını ölçün. Aynı zaman noktalarında, maksimum sitotoksisite değerini belirlemek için enfekte olmamış makrofaj hücrelerini parçalayın.

Sitotoksisite daha sonra belirtildiği gibi formül kullanılarak hesaplanabilir. Enfekte olmamış makrofaj toplama ve ko-kültür için, enfekte olmamış makrofajların her bir kuyusuna bir mililitre soğuk PBS ekleyin. Bir dakika sonra, hücreleri kuyucukların dibinden ayırmak için plakaya hafifçe vurun ve hücre süspansiyonlarını tek bir 15 mililitrelik tüpe koyun.

Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve eksi 80 derecelik depolama için peletin sıvı nitrojen içinde anında hızlı donmasına izin vermek için süpernatanı tamamen çıkarın. Sürecin veri kümelerine yapılan temel bileşen analizi, beklendiği gibi, veriler arasındaki en büyük ayırma bileşeninin, enfekte olmayan örneklere karşı enfekte olmuş örnekler olduğunu ortaya koymaktadır. Numunelerin ikinci ayırt edici özelliği biyolojik değişkenlikleridir.

Bir Pearson korelasyonunun Öklid mesafesine göre hiyerarşik kümeleme ile birleştirilmesi, enfekte olmuş ve enfekte olmayan örneklerin %95 ila %96 arasında değişen bir tekrarlanabilirlik ile farklı bir kümelenmesini gösterir Benjamini-Hochberg Yanlış Keşif Oranı kullanılarak çoklu hipotez testi için düzeltilmiş Öğrenci T testi, enfekte olmayan kontrollere kıyasla enfeksiyon sırasında bollukta önemli farklılıklara sahip proteinleri tanımlamak için gerçekleştirilebilir. Bu analizde, enfeksiyon üzerine ekspresyonda önemli bir değişiklik gösteren 117 konak proteini tanımlandı. Özellikle, enfeksiyon sırasında beklendiği gibi mantar proteinlerinin bolluğunda da önemli artışlar gözlenmiştir.

Makrofajların kültürleme, yıkama ve numune toplama sırasında nazikçe ele alınması önemlidir. Patojenin konakçıya nasıl adapte olduğunu ve konakçının kendisini enfeksiyondan nasıl koruduğunu tanımlayarak, mikrobiyoloji ve immünoloji alanlarında yeni bilgiler edinilir.