Keşif Odaklı Konak-Patojen Etkileşimleri için Etiketsiz Nicel Proteomik İş Akışı
20 Ekim 2020
Burada, kitle spektrometresi bazlı proteomik enfeksiyon sırasında konak ve patojen arasındaki etkileşimin profilini çıkarmak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, tek bir deneyde hem konakçının (örneğin, makrofajlar) hem de patojenin (örneğin Cryptococcus neoformans)protein bolluğundaki değişiklikleri ölçmek için etiketsiz niceleme kullanır.
Protokolümüz, bir hastalık için kritik olan biyolojik sistemler arasındaki etkileşimleri belirlemek için mantar enfeksiyonunu hem konakçı hem de patojen perspektifinden araştırır. Tek bir deneyde hem mantar hem de konak proteinlerini tespit edebilir ve yeni enfeksiyonla ilişkili proteinleri temsil eden yalnızca enfeksiyon sırasında üretilen mantar proteinlerini tanımlayabiliriz. Tedavi için yeni anti-virülan stratejileri ortaya çıkararak mantar enfeksiyonlarını tedavi etmeye odaklanmamıza rağmen, proteomik ve biyoinformatik boru hattımız evrenseldir ve birçok biyolojik sisteme uygulanabilir.
Yaklaşımımız, farklı patojenler ve çok sayıda bağışıklık tepkisi üzerine yapılan çalışmaların temelini oluşturur ve kriptokok ile doğuştan gelen bağışıklık sistemi arasındaki ilişkiye dair yeni bilgiler sağlamak için kullanılabilir. Makrofajın patojenlere verdiği yanıt ve yeterli mantar proteininin saptanması önemlidir. Bu nedenle, her tür için MOI'lerin ve zaman noktalarının test edilmesi ve optimize edilmesi önerilir.
Makrofaj ve mantar hücre kültürü zor olabileceğinden, kokültürden sonra ne bekleyeceğinizi bilmek önemlidir. Görselleştirme, araştırmacıya prosedürün uygulanmasında güven sağlar. Mantar hücrelerini bir makrofaj enfeksiyonu için hazırlamak için, orta uzun faz kültüründen C neoformans hücrelerini toplayın ve santrifüjleyin, ardından aynı santrifüj koşulları altında bir mililitre oda sıcaklığında PBS ile üç nazik yıkama yapın.
Son yıkamadan sonra, mantar hücrelerini mililitre antibiyotik serbest hücre kültürü, orta konsantrasyonda 1.2 kez 10 ila sekizinci hücrede yeniden süspanse edin ve %70 ila %80 birleşik altı kuyulu makrofaj kültür plakasının dört oyuğunun her birine bir mililitre mantar hücresi süspansiyonu ekleyin. Ardından, plakayı üç saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Her bir oluğun, yıkama başına bir mililitre PBS ile üç kez nazikçe yıkanmasına izin vermek için plakayı dikkatlice eğin.
Son yıkamadan sonra enfeksiyon yeterliliğini ölçmek için, altı oyuklu plakanın her bir oyuğuna bir mililitre antibiyotik içermeyen ortam ekleyin ve plakayı hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Uygun deneysel zaman noktalarında, her bir kuyucuktan süpernatanı toplayın ve standart protokollere göre her bir kuyucuktaki LDH miktarını ölçün. Aynı zaman noktalarında, maksimum sitotoksisite değerini belirlemek için enfekte olmamış makrofaj hücrelerini parçalayın.
Sitotoksisite daha sonra belirtildiği gibi formül kullanılarak hesaplanabilir. Enfekte olmamış makrofaj toplama ve ko-kültür için, enfekte olmamış makrofajların her bir kuyusuna bir mililitre soğuk PBS ekleyin. Bir dakika sonra, hücreleri kuyucukların dibinden ayırmak için plakaya hafifçe vurun ve hücre süspansiyonlarını tek bir 15 mililitrelik tüpe koyun.
Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve eksi 80 derecelik depolama için peletin sıvı nitrojen içinde anında hızlı donmasına izin vermek için süpernatanı tamamen çıkarın. Sürecin veri kümelerine yapılan temel bileşen analizi, beklendiği gibi, veriler arasındaki en büyük ayırma bileşeninin, enfekte olmayan örneklere karşı enfekte olmuş örnekler olduğunu ortaya koymaktadır. Numunelerin ikinci ayırt edici özelliği biyolojik değişkenlikleridir.
Bir Pearson korelasyonunun Öklid mesafesine göre hiyerarşik kümeleme ile birleştirilmesi, enfekte olmuş ve enfekte olmayan örneklerin %95 ila %96 arasında değişen bir tekrarlanabilirlik ile farklı bir kümelenmesini gösterir Benjamini-Hochberg Yanlış Keşif Oranı kullanılarak çoklu hipotez testi için düzeltilmiş Öğrenci T testi, enfekte olmayan kontrollere kıyasla enfeksiyon sırasında bollukta önemli farklılıklara sahip proteinleri tanımlamak için gerçekleştirilebilir. Bu analizde, enfeksiyon üzerine ekspresyonda önemli bir değişiklik gösteren 117 konak proteini tanımlandı. Özellikle, enfeksiyon sırasında beklendiği gibi mantar proteinlerinin bolluğunda da önemli artışlar gözlenmiştir.
Makrofajların kültürleme, yıkama ve numune toplama sırasında nazikçe ele alınması önemlidir. Patojenin konakçıya nasıl adapte olduğunu ve konakçının kendisini enfeksiyondan nasıl koruduğunu tanımlayarak, mikrobiyoloji ve immünoloji alanlarında yeni bilgiler edinilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, kütle spektrometrisi tabanlı proteomik kullanarak fungal enfeksiyon sırasında konakçı ve patojen arasındaki etkileşimi incelemektedir. Tek bir deneyde hem konakçı hem de patojen proteinlerinin tespit edilmesine olanak tanıyarak, enfeksiyonla ilişkili proteinler hakkında bilgiler sağlar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Bulaşıcı Hastalıklar
- Proteomik
Arka Plan
- Konak-patojen etkileşimlerini anlamak, hastalık araştırmaları için kritik öneme sahiptir.
- Fungal enfeksiyonlar ciddi sağlık riskleri oluşturmakta ve yeni tedavi stratejilerini gerekli kılmaktadır.
- Proteomik, enfeksiyon sırasında protein bolluğundaki değişiklikleri ortaya çıkarabilir.
- Makrofajlar, patojenlere karşı verilen bağışıklık yanıtında kilit bir rol oynar.
Çalışmanın Amacı
- Konak makrofajlar ile patojen Cryptococcus neoformans arasındaki etkileşimleri profillemek.
- Fungal enfeksiyon sırasında üretilen yeni enfeksiyonla ilişkili proteinleri tanımlamak.
- Çeşitli biyolojik sistemlere uygulanabilir evrensel bir proteomik ve biyoinformatik iş akışı oluşturmak.
Kullanılan Yöntemler
- Protein saptaması için kütle spektrometrisi tabanlı proteomik.
- Protein bolluğu değişimlerini ölçmek için etiketsiz nicelik belirleme.
- Doğru sonuçlar için enfeksiyon çokluğunun (MOI) ve zaman noktalarının optimizasyonu.
- Proteomik verileri yorumlamak için biyoinformatik analiz.
Ana Sonuçlar
- Enfeksiyon sırasında spesifik olarak üretilen fungal proteinlerin tanımlanması.
- Makrofajların Cryptococcus neoformans'a verdiği yanıta dair içgörüler.
- Çeşitli patojenlerin ve bağışıklık yanıtlarının incelenmesi için bir çerçeve oluşturulması.
- Protokolün farklı biyolojik sistemlere uygulanabilirliğinin gösterilmesi.
Sonuçlar
- Protokol, konakçı-patojen etkileşimlerini incelemek için kapsamlı bir yaklaşım sunmaktadır.
- Fungal enfeksiyonlar ve bağışıklık yanıtları üzerine yapılacak gelecek araştırmalar için temel oluşturmaktadır.
- Farklı türler için deneysel koşulların daha fazla optimize edilmesi önerilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Bu etiketsiz kantitatif proteomik iş akışı, enfeksiyon sırasında konakçı ve patojen proteomlarının eş zamanlı profillenmesine olanak tanıyarak, bulaşıcı hastalık araştırmalarında hedef doğrulaması için kritik olan tarafsız protein bolluk verileri sağlar. Enfeksiyonla ilişkili fungal proteinleri ve konakçı yanıt imzalarını tanımlayarak bu yöntem, anti-virülans stratejilerinin mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler ve preklinik hedef seçimine bilgi sağlar. Farklı konakçı-patojen sistemleri arasındaki aktarılabilirliği, antifungal ve immünomodülatör keşif programları için portföy genelindeki uygulanabilirliği artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Enfeksiyon sırasında özel olarak üretilen patojen proteinlerinin belirlenmesiyle, yeni virülans ilişkili hedefleri temsil eden terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Bilimsel Değer: Her iki proteomdaki korele bolluk değişimleri aracılığıyla konakçı-patojen etkileşim yollarını netleştirerek fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Bilimsel Değer: Hedef hipotezlerini riskten arındırmak için nicel, tekrarlanabilir enfeksiyon durumu proteomik profilleri sağlayarak mekanistik belirsizliği azaltır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış enfeksiyon koşulları ve MOI optimizasyonu ile sonraki analiz geliştirme süreçleri için valide edilmiş biyolojik sistemler (enfekte makrofajlar) hazırlar.
- Operasyonel Değer: Tarama kampanyalarında analiz standartlaştırması ve tekrarlanabilirlik değerlendirmesi için uygun olan kantitatif, etiketsiz proteomik çıktılar üretir.
- Operasyonel Değer: Evrensel proteomik ve biyoinformatik boru hattı tasarımı sayesinde, farklı patojenler genelinde ölçeklenebilir platform yeniden kullanımını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Değer: Mikrobiyal istilaya yanıt veren hastalıkla ilgili konak proteinlerini tanımlayarak, preklinik doğrulama için biyobelirteç uyumlandırmasına olanak tanır.
- Translasyonel Değer: Enfeksiyon durumundaki proteomik değişimleri patojenik mekanizmalarla ilişkilendirerek, keşif aşamasından preklinik çalışmalara kadar olan sürecin sürekliliğini sağlar.
- Translasyonel Değer: Virülans ve konak savunma mekanizmaları için temel proteinleri belirterek, risk ayarlı ilerleme kararlarına veri sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
İş akışı, konakçı-patojen etkileşim profillemesi yoluyla erken keşif biyolojisine entegre olur, standardize edilmiş enfeksiyon modelleri aracılığıyla tarama hazırlığını destekler ve proteomik değişiklikleri virülans ile bağışıklık yanıt mekanizmalarına bağlayarak translasyonel araştırmalara olanak sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Hem patojen hem de konakçı proteomlarında enfeksiyon kaynaklı değişiklikleri nicelleştirerek hipotez testlerini ve yolak aydınlatmasını destekler.
- Tarama: Optimize edilmiş MOI ve zaman noktalarıyla analizlere hazır biyolojik sistemler sunarak bileşik değerlendirmeleri için tekrarlanabilir enfeksiyon modelleri sağlar.
- Analizler: Koşulları karşılaştırmak ve anlamlı şekilde değişmiş proteinleri belirlemek için etiketsiz kantitatif ölçümler ve istatistiksel çıktılar (örneğin, Benjamini-Hochberg düzeltmeli t-testleri) sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Proteomik imzaları patojenik mekanizmalar ve konakçı savunma yanıtları ile ilişkilendirerek biyobelirteç keşfini ve preklinik sürekliliği destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla patojen ve bağışıklık sistemine uygulanabilen, yeniden kullanılabilir bir proteomik ve biyoinformatik iş akışı oluşturarak mükerrer yöntem geliştirme ihtiyacını azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Tarafsız, kantitatif enfeksiyon durumu proteomik profillemesi yoluyla hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Doğrulanmış kalite kontrol (QC) metrikleri (PCA, kümeleme, %95-96 replika tekrarlanabilirliği) ile optimize edilmiş kokültür, yıkama ve lizis protokolleri aracılığıyla tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu geliştirir.
- Stratejik Değer: Kritik virülans faktörlerini ve konak yanıt ağlarını ortaya çıkararak, antifungal programlardaki geç aşama biyolojik risklerini azaltır ve git/gitme (go/no-go) kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Enfeksiyona özgü protein ekspresyonu ve yolak katılımına dayalı olarak hedeflerin riske göre ayarlanmış önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Memeli ve fungal hücre kültürü, proteomik örnek hazırlama ve kütle spektrometrisi veri analizi konularında uzmanlık gerektirir.
- LC-MS/MS cihazlarına, etiketsiz nicelendirme yazılımına ve PCA, kümeleme ve diferansiyel ekspresyon analizi için biyoinformatik araçlara erişime bağlıdır.
- Çalışmalar arasında tekrarlanabilirliği sağlamak için enfeksiyon parametrelerinin (MOI, zaman noktaları) ve örnek işlemenin ekipler arası standartlaştırılmasını gerektirir.
- Fungal hücre hazırlığının ve makrofaj konfluensinin optimizasyonu dahil olmak üzere, farklı patojen-konak sistemleri için adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Pratik kısıtlamalar arasında, yüksek arka plan konak sinyalleri arasında düşük bolluktaki fungal proteinlerin tespit edilmesinin teknik zorluğu yer alır; bu durum yeterli enfeksiyon derinliği ve hassasiyet gerektirir.
