Dinamik Canlı Hücre Görüntüleme Konukçu-Patojen Etkileşimleri Çalışma Optik Tuzak

Aşağıdaki deneyin genel amacı, konakçı patojen etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için dönen disk konfokal mikroskobu ile birlikte optik yakalama kullanmaktır. Bu, ilk önce ilgilenilen patojenlerin odacıklı bir kapak camına eklenmesiyle elde edilir. Daha sonra, bir parçacık seçilir ve optik tuzak ile yakalanır.

Son olarak, parçacık ilgilenilen hücreye yönlendirilir. Burada görüldüğü gibi. Optik yakalama, dinamik hücre içi etkileşimlerin gözlemlenmesi için iki parçacığı kontrol etmek için etkili bir yöntem olabilir.

Bu yöntem, bulaşıcı hastalık ve immünoloji alanlarındaki konak patojen etkileşimlerinde, konakçı hücreler ve patojenler arasındaki mekansal ilişkilerin tam kontrolü elde edildiğinde fagositoz üzerindeki etkisinin ne olduğu ve ayrıca bir fagositik hücre tarafından alınan patojenlerin sırasının fazomal olgunlaşmayı etkileyip etkilemediği de dahil olmak üzere önemli soruları yanıtlayabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü yakalama koşullarının farklı hücre ve boncuk türleri için optimize edilmesi gerekir. Bu yöntemin görsel gösterimi, bir eğirme diski kurma ve entegre etme süreci olarak kritik öneme sahiptir.

Tüm optik bileşenler için gerekli olan hassas hizalama nedeniyle bir optik tuzağa konfokal hale getirmek zordur. İlgilenilen patojeni hasat edin. Örneğin, burada, gece boyunca et suyunda yetiştirilen 300 mikrolitre Kanada albicans kültürden çıkarılır ve patojenler 1.5 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne aktarılır.

Daha sonra patojenleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca yaklaşık 1300 Gs'de üç kez yıkayın, süpernatanı aspire edin ve peleti her seferinde yeniden askıya alınmış PBS ve sonikat olmadan bırakın. Üçüncü yıkamadan sonra, peleti 500 mikrolitre PBS'de tekrar süspanse edin. Daha sonra, mililitre başına 10 miligramlık bir nihai konsantrasyon için 100 mikrolitre dimetilformamid içinde emanet boyasının bir miligramını çözün.

Daha sonra, yıkanmış patojenleri içeren reaksiyon tüpüne üç mikrolitre boya karışımı ekleyin. Boyalar ışığa duyarlı olduğu için tüplerin etrafına folyo yerleştirin ve numuneyi bir saat boyunca 37 santigrat derecede çalkalayın ve ardından numuneyi daha önce olduğu gibi PB S3 kez pelet haline getirin ve yıkayın. Son yıkamadan sonra peleti 300 mikrolitre PBS'de tekrar süspanse edin.

Bir su banyosunda 37 santigrat dereceye kadar sıcak ortam denemesi ve PVS'yi yıkayın. 10 santimetrelik bir doku kültürü plakası, ham 2 6 4 0.7 makrofajlarla iki kez PBS ile kaplandı ve her yıkama arasında PBS'yi aspire etti. Daha sonra, plaka yüzeyini beş mililitre tripsin ile kaplayın ve plakayı 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin.

Ardından, hücreleri plaka yüzeyinden ayırmak için plakanın yan tarafını hafifçe vurun. Tripsini plakanın dışına sıçratmamaya dikkat edin. Şimdi plakaya beş mililitre ortam ekleyin ve karışımı bir reaksiyon tüpüne aktarın.

Peletlemeden sonra, hücreler peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek ortamı aspire eder ve peleti 10 mililitre ortamda yeniden süspanse eder. Bir oda slaytının her bir odasına 400 mikrolitre ortam ekleyin ve ardından her odaya beş mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Hücrelerin% 5 CO2 ile 37 santigrat derecede bir inkübatörde gece boyunca büyümesine izin verin.

Hazne slaytını inkübatör pipetinden alın, önceden hazırlanmış floresan olarak etiketlenmiş ilgili patojenlerden beş ila 10 mikrolitre makrofaj haznesine yerleştirin. Makrofajları ve patojenleri, odanın dibine dokunmamaya ve yapışan makrofajları rahatsız etmemeye dikkat ederek, yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Eğirme diski konfokal mikroskobun tüm bileşenlerini açın.

Yağa daldırma objektif merceğine yağ ekleyerek mikroskobu hazırlayın. Hazne sürgüsünü özel aşamaya yerleştirin ve ardından DIC görüntüleme için hazne sürgüsü hizalama mikroskobunun üst kısmını çıkarın. Optik tuzak ve IR lazer için deklanşörü açın.

Ardından lazer üzerindeki deklanşörü optik tuzağa açın. IR kartı ile kontrol ederek IR lazerin önündeki deklanşörün kapalı olduğunu onaylayın. Şimdi yapıştırılan slayttaki makrofajlara odaklanın.

Daha sonra makrofajlara bitişik çözelti içinde serbestçe yüzen patojenleri bulun. Bu prosedürün en zor kısmı, nesne ile numune haznesindeki kapak camı arasındaki yapışma kuvvetleri nedeniyle numune haznesinde izlenecek doğru nesneyi bulmaktır. Bu nesneyi hareket ettirmek için, nesne trafik lazeri tarafından tutulurken sahneyi hareket ettirmeniz gerekir ve ayrıca, sahnenin sürükleme kuvveti bindirme tarafından maksimum yakalama kuvvetini aşmayacak şekilde sahneyi yeterince yavaş hareket ettirmeniz gerektiğini unutmamak önemlidir.

Sahneyi, patojen tuzağın yakınında olacak şekilde hareket ettirin. Ardından deklanşörü açın ve tuzağı devreye sokun. Makrofajları sabit bir sıkışmış patojen görüntüsüyle temas ettirmek için numuneyi hareket ettirin.

DIC floresansında veya tipik olarak yaklaşık beş mikron boyutunda olan her iki ayrı Kanada albicans popülasyonunun bir kombinasyonunda dönen disk konfokal mikroskobu ile patojenler yeşil, mavi ve kırmızı olarak etiketlendi. Görüntülemeyi göstermek için, tek bir C albicans yakalandı ve gri oklarla gösterildiği gibi bir diğer maya kümesi boyunca kare bir desende hareket ettirildi, bu da kalabalık bir ortamda bile operatör tarafından seçilen tek bir patojenin spesifik konumunu yakalama ve manipüle etme yeteneğini gösterdi. Bu sistemin bu şekilde patojenik organizmalar tarafından sergilenen farklı şekil morfolojilerini yakalamak için esnekliğini daha fazla göstermek için, bir C albicans partikülünü sahte bir hifi ile tutmak ve konumlandırmak için optik cımbız kullanıldı.

C albicans kırmızı boya ile etiketlenir ve beyaz okla belirtildiği gibi bir yörünge boyunca hareket ettirilir ve floresan GFPL C3 ham hücrelerinin yanına yerleştirilir. Yeşil renkte. Albicans'ın maya kısmı, sahte hyphy boyunca takip ederken sıkışıp kaldı.

Aspergillus fum tanrıçası ayrıca, bu özel hücre hattı ve patojen ile fagositozun mutlak zaman dilimini analiz etmek için ham bir fare makrofaj hücresinin yanına yerleştirildi. Bu şekilde, parlak alan görüntüleri, beyaz okla gösterildiği gibi kapana kısılmış aspergillus'un kırmızı okla gösterildiği gibi yol boyunca nasıl hareket ettirildiğini ve konumlandırıldığını göstermektedir. Sıkışan patojen, organizmayı odak düzleminin biraz üzerine iten tuzak nedeniyle odağın biraz dışındadır.

Aspergillus, istenen ham hücrenin yanına yerleştirilene kadar hareket ettirildi. Patojen hücre ile temas ettiğinde, tuzak kapatıldı. Fagositoz süreci aktive edildi ve sonraki hücresel olayları gözlemlemek için hızlandırılmış görüntüleme kullanıldı.

30 saniye sonra, ham hücrenin zarı değişmeye ve parçacığın etrafında bir kap oluşturmaya başladı. 60. saniyede, bardak tamamen şekillendi. 90 saniyeden 150 saniyeye kadar, Afu Gotti yutuluyor ve yutuluyordu ve 180 saniye içinde parçacık tamamen içselleştirildi.

Bu videoyu izledikten sonra, bir eğirme diskli optik tuzak aparatının nasıl oluşturulacağı ve böyle bir aletin, geliştirildikten sonra canlı hücre görüntüleme için patojenlerin non-invaziv olarak kontrol edilmesini nasıl sağlayabileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu teknik, konak patojen etkileşimleri alanındaki araştırmacıların, konakçı hücreler ve patojenler arasındaki mekansal ilişkilerin rolünü ve bunun takip eden bağışıklık tepkisi üzerindeki rolünü araştırmalarının yolunu açtı.