Name: Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Keşfedin derin proteom profilleme yöntemini izobarik etiketleme, kapsamlı fraksiyonasyon ve kütle spektrometrisi kullanarak. Bu teknik 10.000'den fazla proteini doğru şekilde nicelendirir ve hastalık biyobelirteçlerinin keşfine yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar tüm diğer laboratuar ve tesis üyeler yararlı tartışma için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen tarafından desteklenmiştir NI H R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 ve ALSAÇ verir. MS analizi St. Jude çocuk Araştırma Hastanesi proteomik tesiste, kısmen desteklenen NIH Kanser Merkezi destek grant P30CA021765 tarafından seslendirildi. Yazarlar Nisha Badders el yazması düzenleme konusunda yardım için teşekkür ederiz.

<ol><li>Pagala, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+protein+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative protein analysis by mass spectrometry.</a> Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).</li>
<li>Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+proteomics%3A+towards+an+integrative+view+of+proteome+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics.</a> Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).</li>
<li>Rauniyar, N., Yates, J. R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isobaric+labeling-based+relative+quantification+in+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics.</a> J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).</li>
<li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+exploration+of+proteome+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function.</a> Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+Profiling+of+Proteome+and+Phosphoproteome+by+Isobaric+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Extensive+Liquid+Chromatography%2C+and+Mass+Spectrometry.+Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling.</a> Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+multiplexing+capacity+of+TMTs+using+reporter+ion+isotopologues+with+isobaric+masses%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses.</a> Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).</li>
<li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+throughput+in+targeted+proteomics+assays%3A+54-plex+quantitation+in+a+single+mass+spectrometry+run%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run.</a> Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+approaches+for+analyzing+U1-70K+cleavage+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer's disease.</a> J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li>
<li>Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+of+proteomics+applied+to+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances of proteomics applied to human diseases.</a> J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).</li>
<li>Churchman, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Retinoids+in+IKZF1-Mutated+BCR-ABL1+Acute+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+mouse-human+phenome-wide+association+to+test+gene+function+and+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk.</a> Nat Commun. 7, 10464(2016).</li>
<li>Mertz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+elution+interactome+analysis+of+the+Mind+bomb+1+ubiquitin+ligase+reveals+a+novel+role+in+dendritic+spine+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).</li>
<li>Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pH+reversed-phase+chromatography+with+fraction+concatenation+for+2D+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis.</a> Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+off-line+high+pH+reversed-phase+fractionation+and+nano-liquid+chromatography-mass+spectrometry+method+for+global+proteomic+profiling+of+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).</li>
<li>Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-line+high-pH+reversed-phase+fractionation+for+in-depth+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics.</a> J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).</li>
<li>Song, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversed-phase-reversed-phase+liquid+chromatography+approach+with+high+orthogonality+for+multidimensional+separation+of+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides.</a> Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+optimization+of+long+gradient+chromatography+mass+spectrometry+for+deep+analysis+of+brain+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome.</a> J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).</li>
<li>Hebert, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+one+hour+yeast+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The one hour yeast proteome.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JUMP%3A+a+tag-based+database+search+tool+for+peptide+identification+with+high+sensitivity+and+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).</li>
<li>Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematical+optimization+of+reverse-phase+chromatography+for+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics.</a> J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).</li>
<li>Niu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Peptide+Fractionation+and+y1+Ion-Based+Interference+Detection+Method+for+Enabling+Accurate+Quantification+by+Isobaric+Labeling+and+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).</li>
<li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).</li>
<li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+fragmentation+and+optimized+isolation+width+settings+for+improvement+of+protein+identification+and+accuracy+of+isobaric+mass+tag+quantification+on+Orbitrap-type+mass+spectrometers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers.</a> Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).</li>
<li>Wenger, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-phase+purification+enables+accurate%2C+multiplexed+proteome+quantification+with+isobaric+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging.</a> Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiNotch+MS3+enables+accurate%2C+sensitive%2C+and+multiplexed+detection+of+differential+expression+across+cancer+cell+line+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes.</a> Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+proteome+quantification+by+DEEP+SEQ+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry.</a> Nat Commun. 4, 2171(2013).</li>
<li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+fragmentation+and+optimized+isolation+width+settings+for+improvement+of+protein+identification+and+accuracy+of+isobaric+mass+tag+quantification+on+Orbitrap-type+mass+spectrometers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers.</a> Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).</li>
<li>Ahrne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Improvement+of+Quantification+Accuracy+in+Isobaric+Mass+Tag-Based+Protein+Quantification+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments.</a> J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).</li>
<li>Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematical+Optimization+of+Reverse-Phase+Chromatography+for+Shotgun+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics.</a> J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).</li>
<li>Tan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Proteomics+and+Phosphoproteomics+Profiling+Reveals+Dynamic+Signaling+Networks+and+Bioenergetics+Pathways+Underlying+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation.</a> Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).</li>
<li>Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+ubiquitination+analysis+by+SILAC+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).</li>
<li>Tan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+phosphopeptide+enrichment+by+phosphate+additive+and+the+analysis+of+human+brain+phosphoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome.</a> Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JUMPg%3A+an+Integrative+Proteogenomics+Pipeline+Identifying+Unannotated+Proteins+in+Human+Brain+and+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells.</a> J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+clinical+utility+of+cancer+genomic+and+proteomic+data+across+tumor+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types.</a> Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).</li>
<li>Nesvizhskii, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteogenomics%3A+concepts%2C+applications+and+computational+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies.</a> Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).</li>
<li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Biz yüksek üretilen iş iletişim kuralı olan çeşitli yayınları12,13,14' te,32 başarıyla uygulanan bir 10-plex izobarik etiketleme stratejisi ile proteinlerin Nefelometri için tarif . Bu protokol için ilâ 10 farklı biyolojik protein örnekleri 1 denemede analiz edebiliriz. Düzenli olarak tanımlamak ve 10.000 Eh proteinler yüksek güven ile quantitate. İzobarik etiketleme proteinler quantitate için ...

Yeni nesil sıralama teknolojisindeki ilerlemeler biyolojik sistemleri ve insan hastalık çalışmak için yeni bir manzara açmıştır. Bu ölçümler genom, transcriptome, Proteom, metabolome ve diğer moleküler sistemlerin somut olmak için çok sayıda izin vardır. Kütle spektrometresi (MS) analitik kimya en hassas yöntemlerinden biridir ve proteomik uygulaması hızlı bir şekilde insan genomu sıralama sonra genişledi. Proteomik alanında, son birkaç yıl içinde MS tabanlı kantitatif analizleri, izobarik etiketleme ve araçları yanı sıra kapsamlı sıvı Kromatografi ile birlikte yeteneği çoğullama da dahil olmak üzere önemli teknik gelişmeler vermiştir , daha hızlı, daha doğru ölçümler için daha az örnek malzeme gerekli izin ilerler. Nicel proteomik proteinler ve ardından değişiklikleri son derece karmaşık biyolojik örnekleri1,2,3,4 , on binlerce profil oluşturma için genel bir yaklaşım haline gelmiştir , 5 , 6.
Çoğaltılmış izobarik etiketleme gibi yöntemleri izobarik etiketi göreli ve mutlak Nefelometri (örneğin, iTRAQ) ve tandem kitle etiketi (TMT) MS için büyük ölçüde örnek işlem hacmi geliştirilmiş ve tek bir analiz örnekleri sayısı arttı 1,6,7,8deneme. Yanı sıra diğer MS tabanlı Nefelometri yöntemleri, etiket içermeyen Nefelometri ve kararlı izotop amino asitler (örneğin, SILAC), hücre kültüründe ile potansiyel proteomik teknikler etiketleme gibi önemli9 alandır ,10,11. Örneğin, TMT yöntemi 10 protein örneklerini birlikte 1 deneyde 10-plex reaktifler kullanarak çözümlenmesi için izin verir. Bu yapısal olarak özdeş TMT etiketleri aynı genel kitle var, ama ağır izotoplar differentially böylece göreli Nefelometri etkinleştirme her etiket, MS/MS parçalanma sırasında bir benzersiz muhabir iyon kaynaklanan karbon veya azot atomu dağıtılır 10 örnekleri arasında. TMT strateji rutin olarak biyolojik yollar, hastalık ilerleme ve hücresel12,13,14çalışmaya uygulanır.
Önemli teknik gelişmeler sıvı Kromatografi (LC)-MS/MS sistemleri, LC ayırmaları ve Nefelometri doğruluk ödün vermeden protein tanımlama en üst düzeye çıkarmak için MS parametreleri açısından hem de gelişmiş var. İlk boyut peptidler ikinci boyutu için yüksek dikeylilik ile ayırma tekniği ile20maksimum sonuçlar elde etmek için av tüfeği proteomik yöntemi bu tür kritik ayrılmasıdır. Yüksek pH ters fazlı sıvı Kromatografi (RPLL) geleneksel güçlü katyon değişim Kromatografi20daha iyi performans sağlar. Yüksek pH RPLL düşük pH RPLL ikinci bir boyut ile birleştirildiğinde, hem analitik dinamik alan ve protein kapsamı, Bütün-Proteom analizleri15 işlemi sırasında toplu ifade proteinlerin tanımlama yeteneği içinde kaynaklanan artırıldı ,16,17,18. Diğer teknik gelişmeler küçük C18 parçacıklar (1.9 µm) içerir ve genişletilmiş uzun sütun (~ 1 m)19. Ayrıca, diğer önemli iyileştirmeler hızlı tarama hızları, geliştirilmiş hassasiyet ve çözünürlük20ve MS veri madenciliği21sofistike Biyoinformatik boru hatları ile Kütle Spektrometreleri yeni sürümlerini içerir.
Burada, duyarlılık ve işlem hacmi, kalite kontrol mekanizmaları deneme boyunca odaklanan geliştirmek için değişiklikler ile en son metodolojiler birleştirmek detaylı bir protokol açıklayın. Protokol protein ayıklama ve sindirim, 10-plex TMT etiketleme, temel pH ve asit pH RPLL ayırma, yüksek çözünürlüklü MS algılama ve MS veri işleme (şekil 1) içerir. Ayrıca, sorun giderme ve deneysel varyasyon değerlendirmek için çeşitli kalite kontrol adımları uygulayın. Bu ayrıntılı iletişim kuralı düzenli olarak tanımlamak ve doğru bir şekilde proteinler üzerinden bir lysate binlerce quantitate araştırmacılar yeni alana yardımcı olma amacını taşıyan veya doku.

<table><tbody><tr><td>1220 LC sistem</td><td>Agilent</td><td>G4288B</td><td></td></tr><tr><td>%50 Hidroksilamin</td><td>Termo Bilimsel</td><td>90115</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Burdick & Jackson</td><td>AH015-4</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Next Advance</td><td>BB24-AU</td><td></td></tr><tr><td>Kelebek Portföy Isıtıcı</td><td>Phoenix S & T</td><td>PST-BPH-20</td><td></td></tr><tr><td>C18 ipuçları</td><td>Harvard Aparatı</td><td>74-4607</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td> <td>Sigma</td><td>D5545</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41648</td><td></td></tr><tr><td>Formik asit</td><td>Sigma</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Fraksiyon Toplayıcı</td><td>Gilson</td><td>FC203B</td><td></td></tr><tr><td>Cam Boncuk</td><td>Sonraki İlerleme</td><td>GB05</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>İyodoasetamid (IAA)</td> <td>Sigma</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Lys-C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Burdick & Jackson</td><td>AH230-4</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Kütle Spektrometresi</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q Exactive HF</td><td></td></tr><tr><td>nanoflow UPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>Ultimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur C18 reçine, 1.9um</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r119.aq.0003</td><td></td></tr><tr><td>Self Pck Sütunları</td><td>Yeni Hedef</td><td>PF360-75-15-N-5</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Speedva</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD11V</td><td></td></tr><tr><td>TMT 10plex İzobarik etiket reaktifi</td><td>Thermo Scientific</td><td>90110</td><td></td></tr><tr><td>Trifloroasetik asit (TFA)</td><td></td><td></td> Tripsin Promega V511C Üre 400003 <td></td>Uygulanan</tr><tr><td></td><td></td><td></td> Biyosistemler <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Xbridge Kolonu C18 kolonu</td><td>Sular</td><td>186003943</td><td></td></tr><tr><td>Fermuar uçları C18</td><td>Millipore ZTC18S096</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SepPak 1cc 50mg</td><td>Sular</td><td>WAT054960</td><td></td></tr></tbody></table>

derin proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Kütle spektrometresi (MS) birçok olağanüstü gelişmeler yaptık-sıvı Kromatografi (LC) belirli teknik ilerleme ile tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ve izobarik etiketleme çoğullama kapasite birleştiğinde proteomik dayalı. Burada, bir geniş LC/LC-MS/MS platform ve doğru bir şekilde tüm proteomes quantitate için sonrası MS Hesaplamalı girişim düzeltme ile etiketleme 10-plex tandem toplu etiket (TMT) birleştiren bir derin-proteomik profil oluşturma protokolü tanıtmak. Bu iletişim kuralı aşağıdaki temel adımları içerir: protein ayıklama ve sindirim, TMT etiketleme, 2-boyutlu (2D) LC, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ve sayısal veri işleme. Kalite kontrol adımları sorun giderme ve deneysel varyasyon değerlendirmek için dahil edilir. 10.000'den fazla proteinler memeli örnekleri arasında güvenle bu iletişim kuralı ile quantitated. Bu iletişim kuralı küçük değişiklikler ile sonrası translasyonel modifikasyonlar Nefelometri için uygulanabilir. Bu çoğaltılmış, sağlam yöntemi karmaşık örnekleri, hücre kültürü, hayvan doku ve insan klinik örnekler de dahil olmak üzere çeşitli proteomik analiz için güçlü bir araç sağlar.

Yukarıda açıklanan türler arası peptid mix sistematik olarak oranı sıkıştırma pre-MS ayırma, MS ayarları ve post-MS düzeltme23gibi 3 büyük protokolü adımda etkisini analiz için kullanılan. Pre-MS ayırma değerlendirilir ve bir temel pH RPLL kombinasyonu ve asidik pH RPLL kullanarak en iyi duruma getirilmiş. Post-MS analiz için sadece species-specific peptidler kabul edildi. Biz bu girişime model bir dizi parametre LC/LC-MS/MS2 yalıtım pencere, online LC çözünürlük, ...

Biz doğru bir şekilde sıvı Kromatografi yüksek çözünürlüklü bir Kütle Spektrometre için arabirim ile proteinler ile izobarik etiketleme, geniş ayırma, Biyoinformatik araçlarını ve kalite kontrol adımları birlikte quantitate için bir protokol mevcut.

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Bu deneyin genel amacı, farklı ilaç tedavileri, zaman kursları veya biyolojik koşullar boyunca hücre veya doku lizatından 10.000'den fazla proteini tanımlamak ve doğru bir şekilde ölçmektir. Bu yöntem, bir ilaca veya başka bir biyolojik uyarana yanıt olarak hangi proteinlerin değiştiği gibi tıp veya biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, 10 farklı deney koşulunda ifade edilen proteomun %70'inden fazlasını doğru bir şekilde niceleme yeteneğine sahip olmasıdır.Bu teknolojinin anlamı, potansiyel biyobelirteç keşfi yoluyla insan hastalıklarının teşhisine kadar genişletilebilir. Optimal hücre lizisi ve sıvı tahmini, aşağı akış sindirimi, etiketleme ve ayırma prosedürlerinde önemli bir rol oynadığından, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Bu protokole başlamak için, ilgilenilen kültürlenmiş hücreleri elde edin.Her yıkama için 10 mililitre PBS kullanarak hücreleri iki kez yıkayın. Yıkanmış hücreleri bir mililitre PBS içeren 1.5 mililitrelik bir tüpte kazıyın ve toplayın. Beş dakika boyunca 600 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.Süpernatanı çıkarın ve hücreleri parçalamaya hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Diseksiyondan sonra istenen dokuları hızlı bir şekilde toplayın ve tartın. Bundan sonra, hemen sıvı nitrojen içinde saklayın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.Lizis tamponunu, metin protokolünde belirtildiği gibi deney gününde hazırlayın. Dondurulmuş numuneye, tampon / numune oranı 10'a bir olacak ve nihai protein konsantrasyonu mililitre başına beş ila 10 miligram arasında olacak şekilde lizis tamponu ekleyin. Daha sonra, cam boncukları ekleyin ve numuneleri dört santigrat derecede ve sekizinci hızda 30 saniye karıştırarak ve ardından beş saniye dinlendirerek, bunu beş kez tekrarlayarak veya numuneler homojenize olana kadar parçalamak için bir blender kullanın.Protein konsantrasyonunu, standart bir protein kantitasyon testi veya standart olarak BSA içeren Coomassie ile boyanmış bir SDS poliakrilamid jeli kullanarak ölçün. Bundan sonra, nihai konsantrasyon %10 olacak ve Lys-C proteazı bir ila 100 arasında bir enzim/substrat oranında olacak şekilde %100 asetonitril ekleyin. Protein sindiriminin gerçekleşmesine izin vermek için oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.Ardından, son konsantrasyon bir milimolar olacak şekilde DTT ekleyin. Oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra, numunelerdeki üre konsantrasyonu iki molar ile seyreltilene kadar 50 milimolar HEPES ekleyin.Her numuneye bir ila 50 arasında bir tripsin / protein oranında tripsin ekleyin. Oda sıcaklığında en az üç saat inkübe edin. Daha sonra, konsantrasyonu bir kez daha bir milimolar olana kadar DTT ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.Son konsantrasyonu 10 milimolar olacak şekilde iyodoasetamid ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Bundan sonra, nihai konsantrasyonu 30 milimolar olacak şekilde DTT ekleyerek reaksiyona girmemiş iyodoasetamidleri söndürün.Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Metin protokolünde belirtildiği gibi tripsin sindiriminin verimliliğini kontrol edin. Ardından, nihai konsantrasyon %1 olacak şekilde her numuneye TFA ekleyin. Bir pH şeridi kullanarak, iki ile üç arasında olduğunu doğrulamak için her numunenin pH'ını ölçün.Kabul edilemez bir pH'a ulaşmak için gerekirse ek TFA damla damla ekleyin. Numuneleri 20.000 kez g ve oda sıcaklığında 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın ve numuneleri hazırlanan döndürme kolonlarına yükleyin.Numuneleri bağlamak için üç dakika boyunca veya numune kolondan tamamen geçene kadar 100 kez g'de santrifüjleyin. Ardından, her sütuna 0,5 mililitre% 0,1 TFA ekleyin. 30 saniye boyunca 500 kez g'de santrifüjleyin.Bundan sonra, her kolona% 60 asetonitril ve 0.1 TFA içeren 125 mikrolitre çözelti ekleyin. Peptitleri kolondan çıkarmak için üç dakika boyunca 100 kez g'de santrifüjleyin. Her tuzdan arındırılmış peptit örneğini 50 mikrolitre 50 milimolar HEPES içinde sulandırın.Bir pH şeridi kullanarak, her bir numunenin pH'ının yedi ile sekiz arasında olduğunu doğrulayın. Daha sonra, TMT reaktiflerini susuz asetonitril içinde çözün, numunelere ekleyin ve ardından oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Bundan sonra, her numunenin bir mikrogramını tuzdan arındırmak ve metin protokolünde belirtildiği gibi etiketleme verimliliğini analiz etmek için kromatografi ortamına gömülü 10 mikrolitrelik pipet ucu kullanın.Etiketli numunelerde etiketlenmemiş peptitlerin tespit edilmediğinden emin olmak için altı ila 10 ayrı peptidi inceleyin. Ardından, her bir numuneden yaklaşık iki mikrolitreyi birlikte karıştırın. Bu karışımı tuzdan arındırmak için kromatografi ortamına gömülü 10 mikrolitrelik pipet ucu kullanın.Örnekleri metin protokolünde belirtildiği gibi LC-MS/MS ile analiz edin. Başlamak için, tuzdan arındırılmış havuzlanmış TMT etiketli peptit örneğini 65 mikrolitre tampon A'da çözündürün. PH'ın yaklaşık 8.0 olduğunu doğrulamak için bir pH şeridi kullanın. Örnek hala asidikse, pH'ı gerektiği gibi ayarlamak için amonyum hidroksit kullanın.Ardından, örneği metin protokolünde belirtildiği gibi parçalara ayırın. Kesir toplayıcıyı, yükleme süresi de dahil olmak üzere her iki dakikada bir kesirleri toplayacak şekilde ayarlayın. Akış hızını dakikada 0,4 mililitre olarak ayarlayın.Toplam 80 kesir toplayın. Ardından, diğer tüm numuneleri tamamen kurutmak için bir vakum yoğunlaştırıcı kullanın. LC-MS/MS kullanarak, ultra derin proteom kapsamı elde etmek için 80 fraksiyonun tümünü analiz edin.İlk olarak, 1.9 mikrometre C18 reçinesini, yaklaşık 1.3 mikrolitrelik bir yatak hacmine ulaşan 75 mikrometre iç çaplı boş sütunlara paketleyin. Tüm uzunluğun ısıtıldığından emin olmak için sütunu bir kelebek portföy ısıtıcısının içine iki ila üç kez sarın. Isıtıcının sıcaklık sensörünün üzerine bantlamamaya dikkat ederek sütunu ısıtıcının içine bantlayın.Ardından, sütunu 65 santigrat dereceye ısıtın. Sistemin kalitesini değerlendirmek için LC-MS/MS sisteminden 100 nanogram sıçan beyin peptidi çalıştırın. Bu değerlendirmeyi bir kez daha tekrarlayın.Bundan sonra,% 5 tampon A'yı akarken kolona yaklaşık 0.2 mikrogram sulandırılmış peptit yükleyin. Peptitleri kolondan çıkarın ve metin protokolünde belirtildiği gibi kütle spektrometresi ile analiz edin. Bu çalışmada, 10-plex izobarik etiketleme stratejisi ile proteinlerin miktar tayini için yüksek verimli bir yöntem açıklanmaktadır. TMT etiketleme verimliliği, TMT etiketli numuneleri ve karşılık gelen etiketlenmemiş numuneleri analiz etmek için LC-MS/MS kullanılarak incelenir.Görülebileceği gibi, etiketlenmemiş peptit zirvesi sadece etiketlenmemiş numunede bulunurken, TMT etiketli peptit zirvesi sadece etiketli numunede bulunur. Daha sonra, MS2 izolasyon penceresinin girişim üzerindeki etkisi değerlendirilir. Tüm MS2 taramaları temiz veya gürültülü tarama olarak belirlenir.Temiz taramalar sadece lizinin y1 iyonlarını sergilerken, gürültülü taramalar bunları hem lizin hem de arginin içinde sergiler. Üç farklı TMT reaktifi ile ayrı ayrı etiketlenmiş E.coli peptitleri kullanılarak temsili girişim giderme burada gösterilmektedir. Toplanan bağıl yoğunluklar, y1 iyon bazlı düzeltmenin TMT bazlı kantitasyon için daha doğru olduğunu ortaya koymaktadır.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokol uygun şekilde yapılırsa dört ila beş hafta içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, nihai veri setinin mümkün olduğunca doğru olmasını sağlamak için tüm kalite kontrol adımlarının eksiksiz olarak yapıldığından emin olmak çok önemlidir. Bu prosedürün translasyon sonrası modifikasyonlara odaklanacak şekilde uyarlanması, hastalığın ilerlemesine veya ilaç tedavisine yanıt olarak ubikitinasyon, fosforilasyon veya asetilasyonun nasıl değiştiği gibi diğer soruları yanıtlayabilir.Teknoloji, geliştirildikten sonra, ürün alanındaki araştırmacıların hücre ve dokulardaki protein değişikliklerini keşfetmesinin önünü açtı. Bu videoyu izledikten sonra, bir memeli hücresi veya dokusundan 10.000'den fazla proteinin nasıl tanımlanacağı ve doğru bir şekilde ölçüleceği konusunda çok iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Yüksek basınçlı UPLC ve az sayıda silika kolon ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman koruyucu gözlük takmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.Bu yöntem fikrine ilk olarak, izobarik etiketlemede meydana gelen bilinen oran sıkıştırma sorununu ele almaya başladığımızda sahip olduk. Kapsamlı fraksiyonlamanın sadece bu sorunu hafifletmek için değil, aynı zamanda bir proteom analizini daha da artırabilen ve uyarlayabilen proteinlerin ve peptitlerin tanımlanmasını da artırmanın harika bir yolu olduğunu fark ettik.

deep-proteome-profiling-isobaric-labeling-extensive-liquid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Burada tam 15 N etiketli Arabidopsis thaliana hücre kültürleri etiketlenmemiş bir karışımına dayanan deterjan dayanıklı ve deterjan çözünür membran içine bitki plazma zarlarının parçalanması için ve in vivo güçlü bir yöntem açıklanmaktadır. Prosedür sinyal süreçleri anlamak için karşılaştırmalı proteomik çalışmalar için uygulanır.

Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Süspansiyon Hücre Kültürleri

Indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) tarafından peptidlerin kararlı izotop etiketleme doğru kütle spektrometresi tabanlı nicel Proteomikte için hızlı, ucuz bir stratejidir. Burada, hemen hemen her tür örnek uygulanabilir Redi yaklaşım kullanılarak protein karışımlarının hazırlanması ve analizi için güçlü bir yöntem ortaya koymaktadır.

Kararlı İzotop Etiketleme için indirgeyici dimetilasyonu kullanma Sayısal Proteomiks

Kanser hücresi proteomlarının derinlemesine analizleri, yeni ilaç hedeflerinin ve tanısal biyobelirteçlerin tanımlanmasını kolaylaştırır. Sıvı ve katı tümörlerden türetilen kanser hücresi alt popülasyonlarındaki (fosfo-) proteomların kantitatif analizi için deneysel bir iş akışı açıklıyoruz. Bu, hücresel zenginleştirme stratejilerinin kantitatif Super-SILAC tabanlı kütle spektrometresi ile birleştirilmesiyle elde edilir.

Sıvı ve Katı Tümörler Kaynaklanan Kanser hücre Proteomlar Kantitatif Kitle Spektrometrik Profil

Kombine ön-madde izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) izobarik etiketlerin örnek çoğullama kabiliyetini arttıran bir sayısal proteomik stratejisidir. Bu protokol bir Alzheimer hastalığı fare modeli ve vahşi tipli kontrollerden dokulara cPILOT uygulanmasını tarif etmektedir.

Geliştirilmiş Numune Kombine Öncül İzotop Etiketleme ve Isobaric Etiketlemeyi Kullanma Dokuların çoğullama (cPILOT)

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Açıklanan ilgi ve etiket-free kütle spektrometresi belirli bir protein in immünafinite zenginleştirme kullanarak bir nükleer hücre altı fraksiyonu protein etkileşim ortakları tanımlamak için bir proteomik iş akışıdır. İş akışı hücre altı fraksiyonu, immünoprepitasyon, filtre destekli numune hazırlama, çevrimdışı temizleme, kütle spektrometresi ve aşağı akım biyoinformatik boru hattını içerir.

Büyük Ölçekli Nükleer Etkileşimom Profilleme için Etiketsiz İmmünoprekütle Spektrometresi İş Akışı

Aşağıdaki adımların her biri için ayrıntılı bilgi içeren optimize edilmiş bir tandem kütle etiketi (TMT) etiketleme protokolü salıyoruz: protein ekstraksiyonu, nicelikselleştirme, yağış, sindirim, etiketleme, proteomik bir tesise teslim ve veri analizleri.

Proteomik Tesis Gönderimi ve Müteakip Veri Analizi için TMT Örnek Hazırlama

Kombine öncül izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT), mevcut izobarik etiketlerle eş zamanlı olarak analiz edilebilen numune sayısını artırabilen gelişmiş bir numune çoklama stratejisidir. Robotik bir platformun dahil edilmesi deneysel iş bilgililiği, tekrarlanabilirliği ve nicel doğruluğu büyük ölçüde artırmıştır.

Kombine Öncül İzotopik Etiketleme ve İzobarik Etiketleme (cPILOT) kullanılarak Otomatik Numune Çoklama

Açıklanan protokol, iki yaklaşım kullanarak doku örneklerinin optimize edilmiş bir nicel proteomik analizini sağlar: etiket bazlı ve etiketsiz nicellik. Etiket tabanlı yaklaşımlar proteinlerin daha doğru nicelliği avantajına sahipken, etiketsiz bir yaklaşım daha uygun maliyetlidir ve bir kohorttan yüzlerce örneği analiz etmek için kullanılır.

Doku Örneklerinin Kütle Spektrometresi Bazlı Av Tüfeği Proteomik Kapsamlı İş Akışı

Protein tiol oksidasyonunun normal fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında önemli etkileri vardır. Reçine destekli yakalama, izobarik etiketleme ve kütle spektrometrisini kullanan, proteinlerin geri dönüşümlü olarak oksitlenmiş sistein kalıntılarının bölgeye özgü tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini sağlayan kantitatif bir redoks proteomik yönteminin ayrıntılarını açıklıyoruz.

Reçine Destekli Yakalama, Protein Thiol Oksidasyonunun Çoklanmış Niceliği için İzobarik Tandem Kütle Etiketi Etiketleme ile Birleştirildiğinde

Keşfedin derin proteom profilleme yöntemini izobarik etiketleme, kapsamlı fraksiyonasyon ve kütle spektrometrisi kullanarak. Bu teknik 10.000'den fazla proteini doğru şekilde nicelendirir ve hastalık biyobelirteçlerinin keşfine yardımcı olur.

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma (Video) | JoVE Journal

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Daha fazla video keşfet