Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Bu deneyin genel amacı, farklı ilaç tedavileri, zaman kursları veya biyolojik koşullar boyunca hücre veya doku lizatından 10.000'den fazla proteini tanımlamak ve doğru bir şekilde ölçmektir. Bu yöntem, bir ilaca veya başka bir biyolojik uyarana yanıt olarak hangi proteinlerin değiştiği gibi tıp veya biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, 10 farklı deney koşulunda ifade edilen proteomun %70'inden fazlasını doğru bir şekilde niceleme yeteneğine sahip olmasıdır.

Bu teknolojinin anlamı, potansiyel biyobelirteç keşfi yoluyla insan hastalıklarının teşhisine kadar genişletilebilir. Optimal hücre lizisi ve sıvı tahmini, aşağı akış sindirimi, etiketleme ve ayırma prosedürlerinde önemli bir rol oynadığından, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Bu protokole başlamak için, ilgilenilen kültürlenmiş hücreleri elde edin.

Her yıkama için 10 mililitre PBS kullanarak hücreleri iki kez yıkayın. Yıkanmış hücreleri bir mililitre PBS içeren 1.5 mililitrelik bir tüpte kazıyın ve toplayın. Beş dakika boyunca 600 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkarın ve hücreleri parçalamaya hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Diseksiyondan sonra istenen dokuları hızlı bir şekilde toplayın ve tartın. Bundan sonra, hemen sıvı nitrojen içinde saklayın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Lizis tamponunu, metin protokolünde belirtildiği gibi deney gününde hazırlayın. Dondurulmuş numuneye, tampon / numune oranı 10'a bir olacak ve nihai protein konsantrasyonu mililitre başına beş ila 10 miligram arasında olacak şekilde lizis tamponu ekleyin. Daha sonra, cam boncukları ekleyin ve numuneleri dört santigrat derecede ve sekizinci hızda 30 saniye karıştırarak ve ardından beş saniye dinlendirerek, bunu beş kez tekrarlayarak veya numuneler homojenize olana kadar parçalamak için bir blender kullanın.

Protein konsantrasyonunu, standart bir protein kantitasyon testi veya standart olarak BSA içeren Coomassie ile boyanmış bir SDS poliakrilamid jeli kullanarak ölçün. Bundan sonra, nihai konsantrasyon %10 olacak ve Lys-C proteazı bir ila 100 arasında bir enzim/substrat oranında olacak şekilde %100 asetonitril ekleyin. Protein sindiriminin gerçekleşmesine izin vermek için oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.

Ardından, son konsantrasyon bir milimolar olacak şekilde DTT ekleyin. Oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra, numunelerdeki üre konsantrasyonu iki molar ile seyreltilene kadar 50 milimolar HEPES ekleyin.

Her numuneye bir ila 50 arasında bir tripsin / protein oranında tripsin ekleyin. Oda sıcaklığında en az üç saat inkübe edin. Daha sonra, konsantrasyonu bir kez daha bir milimolar olana kadar DTT ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.

Son konsantrasyonu 10 milimolar olacak şekilde iyodoasetamid ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Bundan sonra, nihai konsantrasyonu 30 milimolar olacak şekilde DTT ekleyerek reaksiyona girmemiş iyodoasetamidleri söndürün.

Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Metin protokolünde belirtildiği gibi tripsin sindiriminin verimliliğini kontrol edin. Ardından, nihai konsantrasyon %1 olacak şekilde her numuneye TFA ekleyin. Bir pH şeridi kullanarak, iki ile üç arasında olduğunu doğrulamak için her numunenin pH'ını ölçün.

Kabul edilemez bir pH'a ulaşmak için gerekirse ek TFA damla damla ekleyin. Numuneleri 20.000 kez g ve oda sıcaklığında 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın ve numuneleri hazırlanan döndürme kolonlarına yükleyin.

Numuneleri bağlamak için üç dakika boyunca veya numune kolondan tamamen geçene kadar 100 kez g'de santrifüjleyin. Ardından, her sütuna 0,5 mililitre% 0,1 TFA ekleyin. 30 saniye boyunca 500 kez g'de santrifüjleyin.

Bundan sonra, her kolona% 60 asetonitril ve 0.1 TFA içeren 125 mikrolitre çözelti ekleyin. Peptitleri kolondan çıkarmak için üç dakika boyunca 100 kez g'de santrifüjleyin. Her tuzdan arındırılmış peptit örneğini 50 mikrolitre 50 milimolar HEPES içinde sulandırın.

Bir pH şeridi kullanarak, her bir numunenin pH'ının yedi ile sekiz arasında olduğunu doğrulayın. Daha sonra, TMT reaktiflerini susuz asetonitril içinde çözün, numunelere ekleyin ve ardından oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Bundan sonra, her numunenin bir mikrogramını tuzdan arındırmak ve metin protokolünde belirtildiği gibi etiketleme verimliliğini analiz etmek için kromatografi ortamına gömülü 10 mikrolitrelik pipet ucu kullanın.

Etiketli numunelerde etiketlenmemiş peptitlerin tespit edilmediğinden emin olmak için altı ila 10 ayrı peptidi inceleyin. Ardından, her bir numuneden yaklaşık iki mikrolitreyi birlikte karıştırın. Bu karışımı tuzdan arındırmak için kromatografi ortamına gömülü 10 mikrolitrelik pipet ucu kullanın.

Örnekleri metin protokolünde belirtildiği gibi LC-MS/MS ile analiz edin. Başlamak için, tuzdan arındırılmış havuzlanmış TMT etiketli peptit örneğini 65 mikrolitre tampon A'da çözündürün. PH'ın yaklaşık 8.0 olduğunu doğrulamak için bir pH şeridi kullanın. Örnek hala asidikse, pH'ı gerektiği gibi ayarlamak için amonyum hidroksit kullanın.

Ardından, örneği metin protokolünde belirtildiği gibi parçalara ayırın. Kesir toplayıcıyı, yükleme süresi de dahil olmak üzere her iki dakikada bir kesirleri toplayacak şekilde ayarlayın. Akış hızını dakikada 0,4 mililitre olarak ayarlayın.

Toplam 80 kesir toplayın. Ardından, diğer tüm numuneleri tamamen kurutmak için bir vakum yoğunlaştırıcı kullanın. LC-MS/MS kullanarak, ultra derin proteom kapsamı elde etmek için 80 fraksiyonun tümünü analiz edin.

İlk olarak, 1.9 mikrometre C18 reçinesini, yaklaşık 1.3 mikrolitrelik bir yatak hacmine ulaşan 75 mikrometre iç çaplı boş sütunlara paketleyin. Tüm uzunluğun ısıtıldığından emin olmak için sütunu bir kelebek portföy ısıtıcısının içine iki ila üç kez sarın. Isıtıcının sıcaklık sensörünün üzerine bantlamamaya dikkat ederek sütunu ısıtıcının içine bantlayın.

Ardından, sütunu 65 santigrat dereceye ısıtın. Sistemin kalitesini değerlendirmek için LC-MS/MS sisteminden 100 nanogram sıçan beyin peptidi çalıştırın. Bu değerlendirmeyi bir kez daha tekrarlayın.

Bundan sonra,% 5 tampon A'yı akarken kolona yaklaşık 0.2 mikrogram sulandırılmış peptit yükleyin. Peptitleri kolondan çıkarın ve metin protokolünde belirtildiği gibi kütle spektrometresi ile analiz edin. Bu çalışmada, 10-plex izobarik etiketleme stratejisi ile proteinlerin miktar tayini için yüksek verimli bir yöntem açıklanmaktadır. TMT etiketleme verimliliği, TMT etiketli numuneleri ve karşılık gelen etiketlenmemiş numuneleri analiz etmek için LC-MS/MS kullanılarak incelenir.

Görülebileceği gibi, etiketlenmemiş peptit zirvesi sadece etiketlenmemiş numunede bulunurken, TMT etiketli peptit zirvesi sadece etiketli numunede bulunur. Daha sonra, MS2 izolasyon penceresinin girişim üzerindeki etkisi değerlendirilir. Tüm MS2 taramaları temiz veya gürültülü tarama olarak belirlenir.

Temiz taramalar sadece lizinin y1 iyonlarını sergilerken, gürültülü taramalar bunları hem lizin hem de arginin içinde sergiler. Üç farklı TMT reaktifi ile ayrı ayrı etiketlenmiş E.coli peptitleri kullanılarak temsili girişim giderme burada gösterilmektedir. Toplanan bağıl yoğunluklar, y1 iyon bazlı düzeltmenin TMT bazlı kantitasyon için daha doğru olduğunu ortaya koymaktadır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokol uygun şekilde yapılırsa dört ila beş hafta içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, nihai veri setinin mümkün olduğunca doğru olmasını sağlamak için tüm kalite kontrol adımlarının eksiksiz olarak yapıldığından emin olmak çok önemlidir. Bu prosedürün translasyon sonrası modifikasyonlara odaklanacak şekilde uyarlanması, hastalığın ilerlemesine veya ilaç tedavisine yanıt olarak ubikitinasyon, fosforilasyon veya asetilasyonun nasıl değiştiği gibi diğer soruları yanıtlayabilir.

Teknoloji, geliştirildikten sonra, ürün alanındaki araştırmacıların hücre ve dokulardaki protein değişikliklerini keşfetmesinin önünü açtı. Bu videoyu izledikten sonra, bir memeli hücresi veya dokusundan 10.000'den fazla proteinin nasıl tanımlanacağı ve doğru bir şekilde ölçüleceği konusunda çok iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Yüksek basınçlı UPLC ve az sayıda silika kolon ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman koruyucu gözlük takmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

Bu yöntem fikrine ilk olarak, izobarik etiketlemede meydana gelen bilinen oran sıkıştırma sorununu ele almaya başladığımızda sahip olduk. Kapsamlı fraksiyonlamanın sadece bu sorunu hafifletmek için değil, aynı zamanda bir proteom analizini daha da artırabilen ve uyarlayabilen proteinlerin ve peptitlerin tanımlanmasını da artırmanın harika bir yolu olduğunu fark ettik.