Hastalıkta İşlevsel Olmayan Protein-Protein Etkileşimlerinin Haritalanması

Çalışmamız, işlevsiz protein-protein etkileşimlerini doğrudan doğal hücreler ve dokulardan haritalayarak hastalığın hücresel ağları nasıl yeniden yapılandırdığını ortaya koyuyor. Çoğu atomlararası yöntemin aksine, dfPPI genetik mühendislik ve hasta kohortlarına beceri gerektirmez; her örnek için bir çoklu yakalama kullanılır. Başlamak için, 20 milimolar Tris, 20 milimolar potasyum klorür, 5 milimolar magnezyum klorür ve %0,01 Nb-40 içeren bir protein ekstraksiyon tamponu hazırlayın.

Kullanımdan hemen önce proteaz ve fosfataz inhibitörleri ekleyin ve tamponu buzda tutun. Donmuş doku örneğini, bir havacı ile donatılmış mikro doku homojenizer tüpüne yerleştirin. 500-700 mikrolitre doğal lizis tamponu ekleyin, hacmi doku kompaktlığına ve homojenleşme kolaylığına göre ayarlayın.

Sonra, ıçkırtıcıyı aşındırıcı duvarlara doğru yukarı aşağı ve nazikçe hareket ettirerek numuneyi buz üzerinde homojenleştirerek tekiz bir askı elde edilene kadar. Lizatları 4 derece Celsius'ta 30 dakika boyunca inkubka edin, şişeleri bir döner üniteye yerleştirin. Örnekleri inkubasyon sırasında nazikçe karıştırın.

Bir tezgah üstü santrifüj kullanarak, örnekleri 13.000 G'de 4 derece Celsius sıcaklığında 10 dakika boyunca santrifüjlenerek hücresel kalıntıları uzaklaştırır. Süpernatanları dikkatlice toplayın ve onları 1,5 mililitrelik şeffaf mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Üreticinin talimatlarına göre BCA Test Kiti kullanarak üst proteindeki toplam protein konsantrasyonunu belirleyin.

Sonra, doğrudan izopropanol stokundan poliüretan boncuklardan bir aliquot alın. Boncukların birikmesini sağlayarak depolama çözücüsünü çıkarabilirsiniz. İzopropanol dikkatlice aspire edilir, ardından doğal lizis tamponu ekleyin ve boncukları nazik pipetleme veya ters çevirerek tamamen yeniden askıya alın.

Boncukları yıkamak ve dengelemek için tüpü vortex ile geçirin ve sonra santrifüj yapın. Bundan sonra, pipet ucu olan bir vakum hattıyla süpernatantı aspire edin, peleti rahatsız etmemeye özen gösterin. Yıkanmış boncuklara eşit oranda bağlama tamponu ekleyin ve böylece eşit bir çalışma boncuk bulamaç oluşturulur.

Aliquot 40 mikrolitre poliüretan boncuk bulamaçı, kesilmiş pipet ucu kullanarak 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj borularına yerleştirin. Sonra, her tüpe 1 mililitre tampon ekleyerek boncukları üç kez doğal liz tamponu ile yıkayın. Boncukları tekrar asmak için tüpü girdabla söndürün, ardından 10.000 G'de 1 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı aspirasyonla atın.

Son yıkamadan sonra, borulardan kalan sıvının çoğunu çıkararak boncuk peletinin bozulmadığından emin olun. Normalize protein özlerini, 40 mikrolitre kontrol boncuk bulamaç içeren bireysel 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine ekleyin. Son hacmi uygun miktarda doğal liz tamponu ekleyerek 250 mikrolitre ayarlayın.

Örnekleri 4 derece Celsius'ta 30 dakika boyunca kuluçka edin, uçtan uca dönen bir rotatör üzerinde dakikada 10-15 devir hızında dönerek kullanın. Tüpleri 10.000 G'de 1 dakika boyunca 4 derece Celsius'ta santrifüjlenerek kontrol boncuklarını toplamış veya çözünmeyen proteinlerle birlikte pellet edin. Kontrol boncuklarından süpernatantı dikkatlice 1 mililitrelik pipet kullanarak toplayıp 40 mikrolitre yıkanmış poliüretan boncuk bulamaç içeren taze 1,5 mililitrelik tüplere aktarın.

Örnekleri 4 derece Celsius sıcaklığında 3 saat boyunca kuluçka edin, uçtan uca dönen bir rotatör üzerinde döndürün. Tüpler dikkatlice santrifüjlendikten sonra, üst fenatantı aspire edin ve boncukları daha önce gösterildiği gibi dört kez yıkayın. Tüpten kalan PBS'yi çıkarın.

Yıkanmış boncukları, pH 8.5'te 50 milimolar amonyum bikarbonatta taze hazırlanmış 2 mol üre'nin 80 mikrolitresinde pipetleme veya kısa bir vorteksleme ile yeniden askıya alın. Sonra, nihai konsantrasyon 1 milimolar elde etmek için ditiothreitol ekleyin. Tüp kapatıldıktan sonra, 37 derece Celsius'ta 30 dakika boyunca kuluçka yapın ve ısıtılmış yörünge sallayıcısında dakikada 1.100 devirde sallayın.

Son konsantrasyon 3,67 milimolar olarak iodoasetamid ekleyin. Tüpleri karanlıkta oda sıcaklığında 45 dakika kuluçkaya geçirin, dakikada 1.100 devirde çalkalayarak. Şimdi, reaksiyona girmemiş iyodoasetamidi söndürmek için ek ditiothreitol ekleyin, böylece nihai konsantrasyon 3,67 milimolar elde edilir ve pipetle nazikçe karıştırılır.

Numuneye 750 nanogram mililitrede 0,5 miligram kütle spektrometrisi kalitesinde Lys-C proteaz ekleyin. Karışımı 37 derece Celsius'ta 1 saat boyunca kuluçkalayın, dakikada 1.150 devirde çalkalayarak. Sonra, numuneye 750 nanogram taze hazırlanmış 0,5 miligram/mililitre dizileme derecesinde tripsin ekleyin.

Karışımı gece boyunca 37 derece Celsius'ta inkübe edin, dakikada 1.150 devirde sallayın. Ertesi gün, numuneyi oda sıcaklığında 1.000-5.000 G boyunca 1-5 dakika santrifüjlendirin. Süpernatantı pipet kullanarak dikkatlice taze 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve boncukları atın.

Sindirimin pH'ını %50 triffluroasetik asit ile 3'ün altına ayarlayın. PH'ı gösterge şeritleriyle doğrulayın. PU-boncuklar, epichaperome yüksek lizattan HSP90, HSC70 ve sıcak proteinleri güçlü bir şekilde yakaladı; epichaperome düşük lizattan minimum sinyal alarak sondanın biyolojik özgüllüğünü doğruladı.

PU-boncuklarının kargo profili, PU boncuk şeridinde zengin, yüksek moleküler ağırlıklı bir sinyal ve kontrol boncuk şeridinde minimal arka plan göstererek başarılı sonda faaliyetini doğruladı. Coomassie boyalı SDS-PAGE jelleri, dört jel içi işlenmiş örnekte tutarlı bant dağılımı göstererek, kütle spektrometrisinden önce doğal lizatlardan protein komplekslerinin başarılı zenginleştirildiğini doğruladı. Teknik tekrarlanabilirlik, çoğaltılan örneklerin sıkı bir şekilde kümelendiği ve farklı örneklerin temiz ayrıldığı ana bileşen analiziyle doğrulandı.

Öncü iyon yoğunluk dağılımları, çoğu özelliğin %20'nin altında varyasyon katsayılarına sahip olduğunu, örnekler arasında %9,7 ile %11,9 arasında medyan değerlere sahip olduğunu göstererek tutarlı peptid tespit ve geri kazanımı doğrulamıştır. Log-transforme edilmiş protein bolluklarının hiyerarşik kümelenmesi, güçlü örnek ayrımını ve protein yoğunluklarının düşük bolluktan yüksek zenginleştirilmiş proteinlere kadar uzanan korunmuş örnekler arası varyasyonlarını ortaya koydu. Yol zenginleştirme analizi, gen ontoloji kategorileri ve Reactome, KEGG ve WikiPathways gibi seçilmiş veritabanları dahil olmak üzere birden fazla ontoloji kapsamında geniş bir açıklama kapsamı göstermiştir.

dfPPI, diğer yaklaşımların ulaşamayacağı mekanik ve terapötik içgörülerin ortaya çıkarılmasını sağladı. dfPPI, interomikleri gerçek dünya hastalık kohortları ve doğal koşullar seviyesine taşıyarak kesin mekanik ve terapötik hipotezleri mümkün kılar. Şu anda dfPPI'yi Alzheimer ve Parkinson gibi nörodejeneratif hastalıklarda ağ düzeyindeki değişiklikleri haritalamak için genişletiyoruz.